多重耐藥菌ESBLS的概念及檢驗(yàn)方法

1、esblsESBLs是英文"Extended Spectrum Beta-Lactamases"的縮寫(xiě)，中文翻譯為"超廣譜-內(nèi)酰胺酶"。大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等通常最易生產(chǎn)，其次，陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、弗勞地枸櫞酸菌、綠膿桿菌也可生產(chǎn)。其特點(diǎn)是可以水解滅活青霉素類(lèi)抗生素、頭孢菌素(主要為第三代頭孢菌素，如頭孢他啶、頭孢哌酮等，馬斯平等除外)和單環(huán)-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素(氨曲南、卡蘆莫南等)，通常不水解頭霉素類(lèi)(頭孢西丁、頭孢美唑等)和碳青霉烯類(lèi)(亞胺培南、美羅培南等)。其活性可以被克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦等-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制。我國(guó)的產(chǎn)

2、ESBLs菌株主要是分解頭孢噻肟的CTX-M型。耐藥特點(diǎn)如果臨床出現(xiàn)產(chǎn)ESBLs菌株，則對(duì)青霉素類(lèi)、第三代頭孢菌素(頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢曲松等)、單環(huán)-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素(氨曲南)耐藥，ESBLs在實(shí)驗(yàn)室有一專(zhuān)門(mén)的檢測(cè)方法，如果病人的藥敏報(bào)告單已注明為產(chǎn)ESBLs菌株，則表明已經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確證。如果病人藥敏報(bào)告單未注明為產(chǎn)ESBLs菌株，三代頭孢菌素和單環(huán)酰胺類(lèi)抗生素中有一種MIC2ug/ml，或符合CAZ22mm、ATM27mm、CTX27mm、CRO25mm其中一個(gè)，則提示菌株可能產(chǎn)ESBLs，這種情況下，即使實(shí)驗(yàn)室報(bào)告為敏感的第三代頭孢菌素和單環(huán)-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，在臨床也不推薦使用

3、。預(yù)防第三代頭孢菌素和單環(huán)-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的廣泛應(yīng)用是導(dǎo)致產(chǎn)ESBLs菌株出現(xiàn)及傳播的主要因素，此外，尚有其它因素。若臨床出現(xiàn)產(chǎn)ESBLs菌株，會(huì)在病人和醫(yī)院之間及不同菌株之間相大腸桿菌互傳播，導(dǎo)致臨床高死亡率及高比率持續(xù)性定殖，應(yīng)充分引起注意。因此，在治療時(shí)，減少第三代頭孢菌素和單環(huán)-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的應(yīng)用，可以顯著降低產(chǎn)ESBLs菌株的出現(xiàn)。選擇治療哌拉西林/他唑巴坦首先，一旦確定為產(chǎn)ESBLs菌株，應(yīng)立即停止使用第三代頭孢菌素和單環(huán)-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的治療。對(duì)付產(chǎn)ESBLs菌株，最有效的抗生素為碳青霉烯類(lèi)，亞胺培南、美羅培南等較為常用。其次，頭霉素類(lèi)中的頭孢西丁、頭孢美唑等對(duì)其也有效。因?yàn)镋

4、SBLs活性可以被克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦等-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制，所以，也可以選擇-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素和-內(nèi)酰胺酶抑制劑的混合制劑，如替卡西林/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦等，但如果細(xì)菌同時(shí)產(chǎn)ESBLs和AmpC酶，這種方法就沒(méi)用了，因?yàn)锳mpC酶可以水解以上抗菌藥物，且其活性不被克拉維酸、舒巴坦等-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制。檢測(cè)方法目前檢測(cè)ESBLs的常用方法有雙紙片協(xié)同試驗(yàn)(即阿莫西林雙紙片協(xié)同試驗(yàn)與替卡西林雙紙片協(xié)同試驗(yàn)，以NCCLS紙片表型確證試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出產(chǎn)ESBLs)、紙片表型確證試驗(yàn)、瓊脂稀釋法確證實(shí)驗(yàn)、三維試驗(yàn)等。折疊擴(kuò)散法1.篩選試驗(yàn):選用頭孢泊肟、

5、頭孢他啶、氨曲南、頭孢噻肟或頭孢曲松(每片含量均為30g)藥敏紙片中的至少2種,用苗勒-欣頓(MHA)瓊脂,標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法測(cè)試抑菌環(huán)直徑,按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)1997年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。凡頭孢泊肟或頭孢他啶的抑菌環(huán)直徑22mm,頭孢曲松25mm,氨曲南或頭孢噻肟27mm,均應(yīng)高度懷疑為ESBLs菌株,應(yīng)進(jìn)一步作確認(rèn)試驗(yàn)來(lái)加以確診。2.確認(rèn)試驗(yàn):用頭孢他啶(每片30g)和頭孢他啶加克拉維酸(30g和10g);頭孢噻肟(每片30g)和頭孢噻肟加克拉維酸(30g和10g);分別測(cè)量2種紙片單獨(dú)及加克拉維酸的抑菌環(huán)直徑。加克拉維酸較不加克拉維酸的抑菌環(huán)直徑5mm可確認(rèn)為ESBLs菌株

6、。質(zhì)控菌株:大腸埃希菌ATCC25922(頭孢他啶:頭孢他曉+克拉維酸2mm;肺炎克雷伯菌ATCC700603(頭孢他啶:頭孢他啶+克拉維酸5mm)。折疊最低濃度1.篩選試驗(yàn):選用頭孢泊肟、頭孢他啶、氨曲南、頭孢噻肟或頭孢曲松至少2種以上,用陽(yáng)離子增強(qiáng)的MH肉湯(標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法)稀釋至1mg/L,凡被測(cè)菌在上述各管中能夠生長(zhǎng)(MIC2g/ml),均應(yīng)高度懷疑為ESBLs,應(yīng)進(jìn)一步作確認(rèn)試驗(yàn)來(lái)加以確診。2.確認(rèn)試驗(yàn):用標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法測(cè)定MIC的方法,按NCCLS(1997)推薦的篩選和確認(rèn)ESBLs的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。選用頭孢噻肟單獨(dú)稀釋(范圍0.2564mg/L)及頭孢噻肟(稀釋范圍相同)加克拉維

7、酸(每管4mg/L);頭孢他啶單獨(dú)稀釋(范圍0.25128mg/L)及頭孢他啶加克拉維酸(每管4mg/L),上述2種藥物必須同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果加克拉維酸和不加克拉維酸的MIC差值如8倍(3個(gè)稀釋度),可確認(rèn)為ESBLs菌株。質(zhì)控菌株:大腸埃希菌ATTC25922(頭孢他啶:頭孢他啶+克拉維酸<8倍);肺炎克雷伯菌ATCC700603(頭孢他啶:頭孢他啶+克拉維酸8倍)。折疊特殊試驗(yàn)1.在MicroScan的一些藥敏試劑條中包括了頭孢泊肟、頭孢他啶或氨曲南,且每種試劑條均有2種指示藥物,當(dāng)被試菌對(duì)這些指示藥物的MIC2mg/L時(shí),即可篩選出可疑的ESBLs菌株,符合NCCLS(1999)推

8、薦的篩選藥物組合及濃度范圍,可用于ESBLs的篩選。2.用濃度梯度法(Etest法)的常規(guī)試條中的三代頭孢菌素或氨曲南(2種以上),凡MIC2mg/L時(shí),即高度懷疑為ESBLs,應(yīng)進(jìn)一步作確認(rèn)試驗(yàn)來(lái)加以確診?，F(xiàn)有2種Etest法的ESBLs確認(rèn)試條,分別是頭孢噻肟及頭孢噻肟加克拉維酸、頭孢他啶及頭孢他啶加克拉維酸。檢測(cè)結(jié)果加克拉維酸和不加克拉維酸的MIC差值8倍(3個(gè)稀釋度),可確認(rèn)為ESBLs菌株。Etest檢測(cè)ESBLs的具體操作步驟是(1)在常規(guī)試驗(yàn)中選出對(duì)三代頭孢M(jìn)IC1mg/L的菌株(比NCCLS的標(biāo)準(zhǔn)低一個(gè)稀釋度);(2)按NCCLS(1999)推薦的方法,用2種底物篩選和確認(rèn)ES

9、BLs(篩選試驗(yàn):在頭孢噻肟或頭孢曲松中選1種,頭孢他啶或氨曲南中選1種。確認(rèn)試驗(yàn):用頭孢噻肟和頭孢他啶);(3)確認(rèn)該菌對(duì)頭孢西丁的MIC8mg/L,以排除質(zhì)粒AmpC酶;(4)再測(cè)定該菌對(duì)其他非內(nèi)酰胺抗生素的藥敏模式,以指導(dǎo)抗菌治療或收集流行病學(xué)資料。折疊推薦方法1.雙紙片擴(kuò)散法:藥敏平板和菌液的制備方法與常規(guī)藥物敏感試驗(yàn)相同,將菌液涂布在，MH瓊脂平板上,貼上藥敏紙片,1張為三代頭孢菌素(頭孢他啶、頭孢噻肟或頭孢曲松)或氨曲南,1張為含有內(nèi)酰胺酶抑制劑(克拉維酸10mg/L)的紙片,兩紙片相距2030mm(中心-中心),35孵育1824小時(shí),觀(guān)察結(jié)果。如顯示協(xié)同為陽(yáng)性。2.三相擴(kuò)散法:該

10、法又有直接法和間接法2種。直接三相擴(kuò)散法是在紙片擴(kuò)散法的基礎(chǔ)上略加改動(dòng),首先按標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法進(jìn)行操作,貼上藥敏紙片,在離紙片3mm處打一個(gè)小孔(靠近平板中央一側(cè)),內(nèi)加200l濃度為105106的菌液,35孵育過(guò)夜,如在頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松或氨曲南周?chē)囊志π螤畎l(fā)生改變,試驗(yàn)為陽(yáng)性。如果在上述抗生素周?chē)囊志苄』驔](méi)有抑菌環(huán),應(yīng)該用間接法重復(fù)。間接三相擴(kuò)散法與直接法不同在于,直接法平板表面涂布的細(xì)菌和小孔內(nèi)的細(xì)菌是相同菌,而間接法平板表面涂布的細(xì)菌是用已知對(duì)上述藥物均敏感的菌株如大腸埃希菌ATCC25922,小孔內(nèi)為試驗(yàn)菌。如出現(xiàn)試驗(yàn)菌孔干擾敏感菌株形成抑菌環(huán)的現(xiàn)象即判斷為陽(yáng)性。該試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)在于可以同時(shí)了解細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感