鄭用璉分子生物學(xué)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上鄭用鏈分子生物學(xué)綜合復(fù)習(xí)題 08基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)鄒曉冬（基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，HZAU） -1 -分子生物學(xué)綜合復(fù)習(xí)題 第1章 緒論 第2章 基因的概念 1. Basic Concepts l 重復(fù)基因（duplicate factor）：即在基因組中有多個(gè)拷貝的基因在真核生物基因組中發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，真核生物中的重復(fù)基因可以達(dá)到30%。重復(fù)基因主要是為了滿足生物體快速發(fā)育的需要。 l 斷裂基因/不連續(xù)基因(Split genes / interrupted or discontinus genes）：即在基因編碼蛋白質(zhì)的序列中插入與蛋白質(zhì)編碼無(wú)關(guān)的DNA間隔區(qū)，使一個(gè)基因分隔成不連續(xù)的

2、若干區(qū)段。 l 跳躍基因/轉(zhuǎn)座子（Jumping gene / Transposable element）：即可移動(dòng)的或可轉(zhuǎn)移的遺傳因子。這些因子不僅存在于細(xì)菌中，同時(shí)也存在于較高等的動(dòng)物中。 l 假基因(Pseudogenes)：是基因組中與編碼基因序列非常相似的非功能性基因組DNA拷貝,一般情況都不被轉(zhuǎn)錄,且沒(méi)有明確生理意義。根據(jù)其來(lái)源可分為：保留了間隔序列的復(fù)制假基因（如珠蛋白假基因家族）和缺少間隔序列的已加工假基因。 l 重疊基因(overlapping gene)：指在同一段DNA順序上，由于閱讀框架不同或終止早晚不同，同時(shí)編碼兩個(gè)以上基因的現(xiàn)象。 2. Know-How l DNA

3、的一級(jí)、二級(jí)和高級(jí)結(jié)構(gòu) （一）核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu) 核酸的堿基順序是核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。多聚核苷酸是由四種不同的核苷酸單元按特定的順序組合而成的線性結(jié)構(gòu)聚合物，因此，它具有一定的核苷酸順序，即堿基順序。 DNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲(chǔ)的分子形式。生物界物種的多樣性即寓于DNA分子中四種核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中。 （二）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu) （1）DNA分子由兩條多聚脫氧核糖核苷酸鏈(簡(jiǎn)稱DNA單鏈)組成。兩條鏈沿著同一根軸平行盤繞，形成右手雙螺旋結(jié)構(gòu)。螺旋中的兩條鏈方向相反，即其中一條鏈的方向?yàn)?3，而另一條鏈的方向?yàn)?5。 （2）嘌呤堿和嘧啶堿基位于螺旋的內(nèi)側(cè)，磷酸和脫氧核糖基位于螺旋外側(cè)。

4、堿基環(huán)平面與螺旋軸垂直，糖基環(huán)平面與堿基環(huán)平面成90°角。 （3）螺旋橫截面的直徑約為2 nm，每條鏈相鄰兩個(gè)堿基平面之間的距離為3.4 nm，每10個(gè)核苷酸形成一個(gè)螺旋，其螺矩（即螺旋旋轉(zhuǎn)一圈）高度為3.4 nm。 （4）兩條DNA鏈相互結(jié)合以及形成雙螺旋的力是鏈間的堿基對(duì)所形成的氫鍵。堿基的相互結(jié)合具有嚴(yán)格的配對(duì)規(guī)律，即腺嘌呤（A）與胸腺嘧啶（T）結(jié)合，鳥嘌呤（G）與胞嘧啶（C）結(jié)合，這種配對(duì)關(guān)系，稱為堿基互補(bǔ)。A和T之間形成兩個(gè)氫鍵，G與C之間形成三個(gè)氫鍵。在DNA分子中，嘌呤堿基的總數(shù)與嘧啶堿基的總數(shù)相等。 DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的多型性 A-DNA（堿基平面不再與螺旋軸垂直，而是位

5、于大溝中，RNA-RNA/DNA雜交分子具有這種結(jié)構(gòu)） B-DNA(典型的Watson-Crick雙螺旋，堿基平面基本上與螺旋軸垂直) C-DNA： D-DNA E-DNA 這些不同構(gòu)象的DNA都有共同之處：都是右手雙螺旋；兩條反向平行的核苷酸鏈通過(guò)atson-Crick堿基配對(duì)結(jié)合在一起；鏈的重復(fù)單位是單核苷酸；這些螺旋中都有兩個(gè)螺旋溝，分為大溝與小溝，只是它們的寬窄和深淺程度有所不同。 三股螺旋DNA通常是一條同型寡核苷酸與寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸雙螺旋的大溝結(jié)合。 專心-專注-專業(yè)鄭用鏈分子生物學(xué)綜合復(fù)習(xí)題 08基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)鄒曉冬（基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，HZAU） -2 - （三）DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)

6、 指DNA鏈進(jìn)一步扭曲盤旋形成超螺旋結(jié)構(gòu)。超螺旋是DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式。 所有的DNA超螺旋都是由DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶產(chǎn)生。DNA分子具有相同的結(jié)構(gòu)，但鏈環(huán)數(shù)不同，所以稱它們?yōu)橥負(fù)洚悩?gòu)體。拓?fù)洚悩?gòu)酶能夠催化它們之間的轉(zhuǎn)換。 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase I, II)有兩類 （1）拓?fù)洚悩?gòu)酶：作用是暫時(shí)切斷一條DNA鏈，形成酶-DNA共價(jià)中間物而使超螺旋DNA松弛化，然后再將切斷的單鏈DNA連接起來(lái)，而不需要任何輔助因子。如：大腸桿菌的蛋白(MW-)就是一種典型的拓?fù)洚悩?gòu)酶。 （2）拓?fù)洚悩?gòu)酶：能將負(fù)超螺旋引入DNA分子，該酶能暫時(shí)性地切斷和重新連接雙鏈DNA，同時(shí)需要ATP水解

7、為ADP以供能。如：大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶(DNAgyrase)。 環(huán)狀DNA的拓?fù)鋵W(xué)特征 （1）鏈環(huán)數(shù)（linking number, DNA雙鏈分子的交叉數(shù)）：指在雙螺旋DNA中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)，以L表示。 L是整數(shù)；在 cccDNA中任何拓?fù)鋵W(xué)狀態(tài)中其值保持不變；右手螺旋對(duì)L取正值。 （2）初級(jí)螺旋圈數(shù)（纏繞數(shù)twisting number）：指DNA分子中Watson-Crick的螺旋數(shù)，以T表示。 可以是非整數(shù)；是變量；右手螺旋時(shí)T為正值。 （3）超螺旋數(shù)（writhing number）以W表示。 可以是非整數(shù)；是變量；右手螺旋時(shí)，W取負(fù)值。 舉例說(shuō)明這三者

8、之間的關(guān)系：L=T+W 如有松弛的B-DNA，共有420bp，一條鏈繞另一鏈42次，正好形成42圈螺旋，則L=T= 42，所以W= 0，無(wú)超螺旋。若固定一端，另一端按順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)6圈，使雙螺旋解開(kāi)6圈，再將雙鏈連接成閉合環(huán)，而DNA仍要保持B-DNA的結(jié)構(gòu)，每個(gè)螺旋由10個(gè)bp組成，T又變成最初的42，即有42個(gè)螺旋，則L=36，T= 42，所以W= -6，即形成了6個(gè)負(fù)超螺旋（右旋），在此情況下，T值保持不變。 （四）生物體內(nèi)的超螺旋 （1）環(huán)狀DNA的超螺旋：大腸桿菌DNA是環(huán)狀分子，整個(gè)分子長(zhǎng)達(dá)1mm多，在體內(nèi)壓縮成1um直徑的小體，包含了幾個(gè)獨(dú)立的超螺旋。 （2）真核生物的染色體(c

9、hromosome)中的DNA 染色單體由一條連續(xù)的DNA長(zhǎng)鏈，經(jīng)過(guò)四級(jí)盤旋、折疊而成。一條DNA的長(zhǎng)鏈經(jīng)過(guò)一級(jí)結(jié)構(gòu)即形成核小體后，其長(zhǎng)度被壓縮7倍；二級(jí)結(jié)構(gòu)，即形成螺旋管后，DNA長(zhǎng)度又被壓縮了6倍；三級(jí)結(jié)構(gòu),即由螺線管形成超螺線管后,DNA的長(zhǎng)度在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上被壓縮了40倍；在由三級(jí)到四級(jí)結(jié)構(gòu),即形成染色單體后，DNA的長(zhǎng)度在三級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上被壓縮了5倍。因此由一條DNA長(zhǎng)鏈,經(jīng)過(guò)多級(jí)螺旋化，可以使幾厘米長(zhǎng)的DNA與組蛋白等物質(zhì)共同形成幾微米長(zhǎng)的染色體，其長(zhǎng)度總共被壓縮800010 000倍。 核小體 (nucleosomes )由H2A、H2B、H3、H4各兩個(gè)分子生成的八聚體和由大

10、約200bpDNA組成。八聚體在中間，DNA分子盤繞在外，而H1則在核小體的外面。核小體的組裝能導(dǎo)致DNA的超螺旋化。 端粒（telomere）是真核生物線形染色體的末端具有的一種特殊結(jié)構(gòu)。真核生物染色體的天然末端，是細(xì)胞必需的遺傳組分，因?yàn)樗軌蜓a(bǔ)償染色體末端遺傳信息的丟失。端粒是染色體末端的DNA重復(fù)序列，作用是保持染色體的完整性。細(xì)胞分裂一次，由于DNA復(fù)制的原因，端粒就縮短一點(diǎn)。一旦端粒消耗殆盡，染色體則易于突變而導(dǎo)致動(dòng)脈硬化和某些癌癥。因此，端粒和細(xì)胞老化有明顯的關(guān)系。一直以來(lái)都知道精、卵細(xì)胞的端粒比成年體細(xì)胞的都長(zhǎng)許多。 l DNA在體內(nèi)穩(wěn)定存在的因素：氫鍵、磷酸酯鍵、堿基堆積力

11、(非特異性結(jié)合力)、疏水作用力。 氫鍵為弱鍵, 可加熱解鏈；磷酸酯鍵為強(qiáng)鍵, 需酶促解鏈。 0.2 mol / L Na+生理鹽條件，可消除DNA單鏈上磷酸基團(tuán)間的靜電斥力。 （1）DNA分子中非極性的嘌呤、嘧啶環(huán)（-NH2等）使有序的以氫鍵連接的水分子層繞，熵值降低。 （2）DNA分子中非極性堿基的聚集，使有序的水分子層繞減低到最低的限度，減少熵值的降低。 （3）磷酸基團(tuán)間的靜電斥力。 （4）堿基間的擠壓、抵御使其內(nèi)能增加, 堿基間有序排列的狀態(tài)破壞（氫鍵作用力被減弱）。 鄭用鏈分子生物學(xué)綜合復(fù)習(xí)題 08基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)鄒曉冬（基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，HZAU） -3 -l DNA的變性和復(fù)性，核酸分子雜交

12、(一) 核酸的變性（Denaturation） 指核酸雙螺旋區(qū)的多聚核苷酸鏈間的氫鍵斷裂，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過(guò)程。變性核酸將失去其部分或全部生物活性。核酸的變性并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所以它的一級(jí)結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。 能夠引起核酸變性的因素很多。溫度升高、酸堿度改變、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸變性。 監(jiān)測(cè)DNA是否變性的一個(gè)最常用的指標(biāo)是DNA在紫外區(qū)260nm波長(zhǎng)處的吸收光值變化。因?yàn)镈NA變性時(shí)，DNA雙鏈發(fā)生解離，共軛雙鍵更充分暴露，故DNA變性，DNA在260nm處的吸收光度值增加，并與解鏈程度有一定的比例關(guān)系，這種關(guān)系叫做DNA的增色效應(yīng)。 DNA的變性從開(kāi)始到解鏈完全，是在

13、一個(gè)相當(dāng)窄的溫度內(nèi)完成的，在這一范圍內(nèi)，紫外光吸收值增加達(dá)到最大增加值的50時(shí)的溫度叫做DNA的解鏈溫度（Tm）。一種DNA分子的 Tm值的大小與其所含堿基中的 GC的比例相關(guān)也與DNA分子大小及變性條件有關(guān)，G+C的比例越高，DNA分子越長(zhǎng)，溶液離子強(qiáng)度越高，Tm值越大。 常用的DNA變性方法 （1）熱變性方法：缺點(diǎn)是高溫可能引起磷酸二酯鍵的斷裂，得到長(zhǎng)短不一的DNA。 （2）堿變性方法：pH11.3時(shí)，可淘汰全部氫鍵，DNA完全變成單鏈。 （3）維持單鏈狀態(tài)：pH>11.3或鹽濃度<0.01mol/L。 （二）DNA的復(fù)性(Renaturation) 復(fù)性機(jī)制：10-20bp成

14、拉鏈。（有減色效應(yīng)） 指變性DNA在一定條件下恢復(fù)成天然DNA結(jié)構(gòu)的過(guò)程。（熱變性的DNA可通過(guò)緩慢冷卻而復(fù)性-分子生物學(xué)中也稱為退火。）一般認(rèn)為，比Tm值低25的溫度是DNA復(fù)性的最佳條件。 熱變性DNA在緩慢冷卻時(shí)可以復(fù)性，快速冷卻不能復(fù)性。 DNA片段越小、濃度越大，復(fù)性越快； 復(fù)性條件： （1）有足夠的鹽濃度以消除磷酸基的靜電斥力：0.15 0.5 mol/L NaCl。 （2）有足夠高的溫度以破壞無(wú)規(guī)則的鏈內(nèi)氫鍵 (但不能太高, 否則配對(duì)堿基之間的氫鍵又難以形成) 一般：低于 Tm 20 25 C 的溫度。 （三）DNA分子的雜交（molecular hybridization） 是

15、用一個(gè)DNA或RNA單鏈與另一被測(cè)DNA單鏈形成雙鏈，以測(cè)定某特異序列是否存在的方法。這種方法已成為遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等生命學(xué)科中最為普遍和重要的方法之一。 分子雜交的方法多種多樣，但其共同特點(diǎn)是： 都是應(yīng)用復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理； 都必須有探針（probe）的存在。所謂探針就是用同位素或非同位素如熒光染料，生物素等標(biāo)記的短片段特異DNA或RNA序列。 分子雜交的方法 （1）原位分子雜交（in situ hybridization） 玻片原位雜交：進(jìn)行染色體的基因定位，或觀察組織中不同的 RNA的分布。 膜上原位雜交：在基因文庫(kù)中釣基因。 （2）斑點(diǎn)雜交（dot blotting）：也叫狹縫雜交。由S

16、outhern blot衍生而來(lái)。它是將某種生物的總DNA直接點(diǎn)在尼龍膜上，或者通過(guò)一個(gè)小的長(zhǎng)形狹縫印在尼龍膜上，后將膜變性處理，預(yù)雜交后，經(jīng)中和、洗脫、干燥。再將其和探針?lè)湃霃?fù)性緩沖溶液中緩緩復(fù)性，洗滌干燥后進(jìn)行放射自顯影，觀察結(jié)果。這種方法是用來(lái)初步探測(cè)某種生物中含有一種特殊的基因或序列。用以分析DNA樣品之間的同源性。 （3）Northern 雜交-檢驗(yàn)RNA：提取某種生物或組織的總RNA或mRNA，用含有變性劑的瓊脂糖凝膠電泳分離RNA，分離后再將凝膠上的RNA帶吸印到尼龍膜上，在液相中和標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交，用此方法可以測(cè)定某基因表達(dá)的時(shí)空特異性 （4）基因芯片(Gene chip

17、)技術(shù)：是指通過(guò)微陣列(Microarray)技術(shù)將高密度DNA片段陣列通過(guò)高速機(jī)器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標(biāo)記的DNA探針，借助堿基互補(bǔ)雜交原理，進(jìn)行大量的基因表達(dá)及監(jiān)測(cè)等方面研究的最新革命性技術(shù)。 DNA芯片為生物芯片的一種。 鄭用鏈分子生物學(xué)綜合復(fù)習(xí)題 08基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)鄒曉冬（基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，HZAU） -4 - 生物芯片包括：DNA芯片、蛋白質(zhì)芯片、其它芯片。 按制備方式分： （1）原位合成芯片：采用顯微光蝕刻等技術(shù)在特定部位原位合成寡核苷酸而制備的芯片。探針較短。 （2）DNA微集陣列：將預(yù)先制備的DNA片段以顯微打印的方式有序地固化于支持

18、物表面而制成的芯片。探針的來(lái)源較靈活。 DNA芯片的應(yīng)用 （1）DNA測(cè)序、雜交測(cè)序（SBH）； （2）基因表達(dá)分析； （3）基因組研究：作圖、測(cè)序、基因鑒定、基因功能分析； （4）基因診斷：尋找和檢測(cè)與疾病相關(guān)的基因及在RNA水平上檢測(cè)致病基因的表達(dá)； （5）藥物研究與開(kāi)發(fā)。 基因表達(dá)譜（gene expression pattern)芯片的應(yīng)用最為廣泛，技術(shù)上也最成熟。這種芯片可以檢測(cè)整個(gè)基因組范圍的眾多基因在mRNA表達(dá)水平的變化。它能對(duì)來(lái)源于不同個(gè)體、不同組織、不同細(xì)胞周期、不同發(fā)育階段、不同分化階段、不同生理病理、不同刺激條件下的組織細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比分析。 從而對(duì)基因群在個(gè)

19、體、組織、發(fā)育、分化、疾病、刺激等特異性的變化特征和規(guī)律進(jìn)行描述。 l 原核、真核生物基因結(jié)構(gòu)的異同 相同點(diǎn)： 都由能夠編碼蛋白質(zhì)的編碼區(qū)和具有調(diào)控作用的非編碼區(qū)組成。 不同點(diǎn)： 原核細(xì)胞編碼區(qū)是連續(xù)的，所有堿基對(duì)均能編碼蛋白質(zhì)，而真核細(xì)胞編碼區(qū)是間隔的、不連續(xù)的，它有不表達(dá)的序列，叫做內(nèi)含子，編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子。內(nèi)含子和非編碼區(qū)合成非編碼序列。 l 真核生物與原核生物基因組特點(diǎn)的異同 相同點(diǎn)： 都由生物基本單位中的所有核酸序列組成，都有重復(fù)序列和單一序列，都是生物的遺傳物質(zhì)。 不同點(diǎn)： 1）真核生物基因分布在多個(gè)染色體上，而原核生物只一個(gè)染色體； 2）真核生物基因組遠(yuǎn)大于原核生物基因

20、組； 3）真核生物細(xì)胞中DNA與組蛋白和大量非組蛋白結(jié)合，并有核膜將其與細(xì)胞質(zhì)隔離，結(jié)果真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯在時(shí)間上和空間上都是分離的，而原核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯是同步的； 4）真核生物的基因是不連續(xù)的，中間存在不被翻譯的內(nèi)含子序列，而原核生物幾乎每一個(gè)基因都是完整的連續(xù)的DNA片段； 5）基因組中非編碼序列遠(yuǎn)多于編碼序列； 6）存在著重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)從幾次到幾百萬(wàn)次不等； 7）真核生物基因組的復(fù)制起點(diǎn)多，缺少明顯的操縱子結(jié)構(gòu)，而原核生物基因組一般是一個(gè)復(fù)制子； 8）真核生物基因組與原核相同，存在轉(zhuǎn)座因子。 l 原核生物與真核生物基因表達(dá)調(diào)控的異同 相同點(diǎn)： 1）都包括轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后

21、調(diào)控，并且以轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控最為重要。 2）結(jié)構(gòu)基因中都存在著許多特異的調(diào)控成份。 不同點(diǎn)： 1）原核生物的染色體是裸露的DNA，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)基因的表達(dá)沒(méi)有明顯的調(diào)控；真核生物的染色質(zhì)DNA與組蛋白緊密結(jié)合形成的核小體，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)基因的調(diào)控是明顯的。 2）原核生物中有正調(diào)控（乳糖操縱子）和負(fù)調(diào)控；真核生物迄今已知的主要是正調(diào)控，而且一個(gè)真核基因通常都有多個(gè)調(diào)控序列，必須有多個(gè)激活物同時(shí)特異地結(jié)合去才能啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。 3）原核生物在多細(xì)胞中表達(dá)，不同細(xì)胞的表達(dá)不一樣，并且其轉(zhuǎn)錄和翻譯都在同一地點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行；真核生物在單細(xì)胞中表達(dá)，并且其轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核中進(jìn)行，翻譯在胞質(zhì)中進(jìn)行。 鄭用鏈分子生物學(xué)綜合

22、復(fù)習(xí)題 08基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)鄒曉冬（基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，HZAU） -5 -第3章 DNA復(fù)制 1. Basic Concepts l 復(fù)制子(replicon): 基因的一個(gè)單位。為DNA分子中能從起始點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制的部分。 l 復(fù)制體(replisome): 是參與DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)復(fù)合物，包含DNA聚合酶，引發(fā)酶，解旋酶，單鏈結(jié)合蛋白和其它輔助因子。 l 半保留復(fù)制（semiconservative replication）：DNA復(fù)制的一種方式。每條鏈都可用作合成互補(bǔ)鏈的模板，合成出兩分子的雙鏈DNA，每個(gè)分子都是由一條親代鏈和一條新合成的鏈組成。 l 半不連續(xù)復(fù)制(semidiscontinuous

23、replication): DNA分子復(fù)制在分子全長(zhǎng)中從若干起點(diǎn)向其兩側(cè)進(jìn)行復(fù)制，然后經(jīng)DNA連接酶將復(fù)制成的片段連接為一個(gè)完整分子，可使復(fù)制速度大大加快，加速生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程。 l 岡崎片斷（Okazaki fragment）：相對(duì)比較短的DNA鏈(大約1000核苷酸殘基)，是在DNA的滯后鏈的不連續(xù)合成期間生成的片段。 l 端粒(telomere): 是真核細(xì)胞染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)。人端粒由6個(gè)堿基重復(fù)序列(TTAGGG)和結(jié)合蛋白組成。端粒有重要的生物學(xué)功能，可穩(wěn)定染色體的功能，防止染色體DNA降解、末端融合，保護(hù)染色體結(jié)構(gòu)基因，調(diào)節(jié)正常細(xì)胞生長(zhǎng)。 l 端粒酶(tolomerase)：是使

24、端粒延伸的反轉(zhuǎn)錄DNA臺(tái)成酶。是個(gè)由RNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核酸-蛋白復(fù)合物。其以RNA組分為模板，蛋白組分具有催化活性，以端粒3'末端為引物，合成端粒重復(fù)序列。端粒酶的活性在真核細(xì)胞中可檢測(cè)到，其功能是合成染色體末端的端粒，使因每次細(xì)胞分裂而逐漸縮短的端粒長(zhǎng)度得以補(bǔ)償，進(jìn)而穩(wěn)定端粒長(zhǎng)度。主要特征是用它自身攜帶的RNA作模板，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成DNA。 端粒酶在細(xì)胞中的主要生物學(xué)功能是通過(guò)其逆轉(zhuǎn)錄酶活性復(fù)制和延長(zhǎng)端粒DNA來(lái)穩(wěn)定染色體端粒DNA的長(zhǎng)度。 l 酵母人工染色體(yeast artificial chromosome, YAC): 是利用釀酒酵母的染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體，其工

25、作環(huán)境在釀酒酵母中。它可以克隆和分析大片段的染色體DNA，并且可以分離那些在大腸桿菌(Escherichia coli)中不可能得到的序列。將來(lái)自其他物種的較大片段DNA連接到酵母DNA上，在宿主細(xì)胞中外來(lái)DNA能隨著酵母細(xì)胞中的其他染色體一起復(fù)制。 l 細(xì)菌接合(conjugation/mating): 是細(xì)菌通過(guò)細(xì)胞的暫時(shí)溝通和染色體或質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致基因重組的過(guò)程。 l 拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase):是一種可通過(guò)切斷DNA的一條或兩條鏈中的磷酸二酯鍵，然后重新纏繞和封口來(lái)改變DNA連環(huán)數(shù)的酶。存在于細(xì)胞核內(nèi)，他們能夠催化DNA鏈的斷裂和結(jié)合，從而控制DNA的拓?fù)錉顟B(tài)。

26、l 質(zhì)粒不相容性（plasmid incompatibility): 指同種的或親緣關(guān)系相近的兩種質(zhì)粒不能同時(shí)穩(wěn)定地保持在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的現(xiàn)象。當(dāng)兩種質(zhì)粒同時(shí)導(dǎo)入同一細(xì)胞時(shí)，它們?cè)趶?fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過(guò)程中彼此競(jìng)爭(zhēng)，在一些細(xì)胞中,一種質(zhì)粒占優(yōu)勢(shì)，而在另一些細(xì)胞中另一種質(zhì)粒卻占上風(fēng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)幾代后，占少數(shù)的質(zhì)粒將會(huì)丟失，因而在細(xì)胞后代中只有兩種質(zhì)粒的一種。 l Klenow fragment（Klenow片斷): 它具有3到5的外切酶活性和5到3的聚合功能，而去除了完整的DNA聚合酶I所具有的5到3外切酶活性，可用于DNA雙鏈末端3突出端切平和5突出端補(bǔ)平反應(yīng)。 l Sanger sequen

27、cing（sanger測(cè)序): 即Sanger（1977）發(fā)明的雙脫氧核糖核酸鏈末端終止法。它根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開(kāi)始，隨機(jī)在某一特定的堿基處終止，并且在每個(gè)堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長(zhǎng)度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得可見(jiàn)的DNA堿基序列。 Sanger法測(cè)序的原理是：每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之?dāng)U增，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)使之終止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長(zhǎng)的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止，終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTP

28、s和ddNTPs的相對(duì)濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長(zhǎng)幾個(gè)至千以上個(gè)，相差一個(gè)堿基一系列片斷。它們具有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的的核苷酸上，可通過(guò)高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。 鄭用鏈分子生物學(xué)綜合復(fù)習(xí)題 08基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)鄒曉冬（基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，HZAU） -6 -l Pyrosequencing（焦磷酸測(cè)序): 是一種對(duì)短到中等長(zhǎng)度的DNA序列樣品進(jìn)行高通量的、精確和重復(fù)性好的分析的技術(shù)。是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng), ），在每一輪測(cè)序反應(yīng)中，只加入一種三磷酸脫氧核(糖核)苷（dNTP），若該dNTP與模板配

29、對(duì)，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)（PPi）。PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見(jiàn)光信號(hào)，并由PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值。每個(gè)峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。（然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。） 焦磷酸測(cè)序的原理是： 第1步：1個(gè)特異性的測(cè)序引物和單鏈DNA模板結(jié)合，然后加入酶混合物(包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光(素)酶、腺苷三磷酸雙磷酸酶)和底物混合物(包括腺苷酰硫酸APS和熒光素。 第2步：向反應(yīng)體系中加入1種dNTP，如果它剛好能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對(duì)，則會(huì)在DNA 聚合酶的作用下，添加到測(cè)序引物的3末端，同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦

30、磷酸(PPi)。 第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結(jié)合形成ATP；在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見(jiàn)光。通過(guò)CCD光學(xué)系統(tǒng)即可獲得一個(gè)特異的檢測(cè)峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。 第4步：反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。 第5步：加入另一種dNTP，使第2-4步反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)所獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息。 l 454 sequencing（454測(cè)序): 由454生物科學(xué)發(fā)明，它使用類似于焦磷酸測(cè)序的方法，是一種依靠生物發(fā)光進(jìn)行DNA序列分析的新技術(shù)。在DN

31、A聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，首先將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)釋放的有無(wú)和強(qiáng)度，以達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。454的特點(diǎn)不需要熒光標(biāo)記的引物或核酸探針，也不需要進(jìn)行電泳；具有分析結(jié)果快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和自動(dòng)化的特點(diǎn)。 l Solexa sequencing（Solexa測(cè)序):是一種利用單分子陣列的新一代高通量低成本的測(cè)序技術(shù)，目前在DNA和RNA以及甲基化等方面的應(yīng)用廣泛。 Solexa法測(cè)序的原理是：首先將 DNA 從細(xì)胞中提取，然后將其打斷到約 100-200bp 大小，再將接頭連接到片段上，經(jīng) PCR 擴(kuò)增后

32、制成 Library 。隨后在含有接頭的芯片上將已加入接頭的 DNA 片段綁定在 flow cell 上，經(jīng)反應(yīng)，將不同片段擴(kuò)增。在下一步反應(yīng)中，四種熒光標(biāo)記的染料應(yīng)用邊合成邊測(cè)序的原理，在每個(gè)循環(huán)過(guò)程里，熒光標(biāo)記的核苷和聚合酶被加入到單分子陣列中。互補(bǔ)的核苷和核苷酸片斷的第一個(gè)堿基配對(duì)，通過(guò)酶加入到引物上。多余的核苷被移走。這樣每個(gè)單鏈 DNA 分子通過(guò)互補(bǔ)堿基的配對(duì)被延伸，利用生物發(fā)光蛋白，比如螢火蟲的熒光素酶，可通過(guò)堿基加到引物后端時(shí)所釋放出的焦磷酸鹽來(lái)提供檢測(cè)信號(hào)。針對(duì)每種堿基的特定波長(zhǎng)的激光激發(fā)結(jié)合上的核苷的標(biāo)記，這個(gè)標(biāo)記會(huì)釋放出熒光。熒光信號(hào)被 CCD 采集， CCD 快速掃描整個(gè)

33、陣列檢測(cè)特定的結(jié)合到每個(gè)片斷上的堿基。通過(guò)上述的結(jié)合，檢測(cè)可以重復(fù)幾十個(gè)循環(huán)，這樣就有可能決定核苷酸片斷中的幾十個(gè)堿基。 l SOLiD sequencing（SOLiD測(cè)序):其全稱為Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection，它是通過(guò)寡核苷酸連接和檢測(cè)來(lái)進(jìn)行測(cè)序的方法。與聚合酶測(cè)序方法不同的是，SOLiD系統(tǒng)通過(guò)連接酶（而不是聚合酶讀取序列）并利用專利的逐步連接（stepwise ligation）技術(shù)來(lái)產(chǎn)生高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，可應(yīng)用于全基因組測(cè)序、染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）、微生物測(cè)序、數(shù)字核型分析、臨床測(cè)序、基因型分析、基因表達(dá)

34、分析和小分子RNA的發(fā)現(xiàn)等等。SOLiD測(cè)序的化學(xué)及讀出過(guò)程與Sanger測(cè)序及其他邊合成邊測(cè)序方法不同。 SOLiD法測(cè)序的原理是：SOLiD技術(shù)采用四色熒光標(biāo)記寡核苷酸進(jìn)行連續(xù)連接合成代替聚合酶鏈接反應(yīng)為基礎(chǔ)，取代了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)，可對(duì)單拷貝DNA片斷進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增和高通量并行測(cè)序。這種替代能夠明顯減少因堿基錯(cuò)配而出現(xiàn)的錯(cuò)誤，消除相位不同步的問(wèn)題，以獲得更高的保真度。另外，SOLiD系統(tǒng)采用末端配對(duì)分析和雙堿基編碼技術(shù)，在測(cè)序過(guò)程中對(duì)每個(gè)堿基判讀兩遍，從而減少原始數(shù)據(jù)錯(cuò)誤，以提供內(nèi)在的校對(duì)功能，它是目前新一代基因分析技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的。SOLiD的特點(diǎn)在于其無(wú)可比擬的高通量（每輪運(yùn)行

35、可產(chǎn)生超過(guò)40億堿基的可定位數(shù)據(jù)）、可擴(kuò)展性（開(kāi)放式的上樣玻片格式和靈活可變的磁珠密度可通過(guò)更新操作流程來(lái)提高檢測(cè)通量）、精確性（原始?jí)A基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度達(dá)到99.94%，而在15X覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確度可高達(dá)99.999%）、方便性（實(shí)時(shí)跟蹤運(yùn)行狀態(tài)，允許在多個(gè)步驟中重新進(jìn)入流程）和運(yùn)用靈活性（鑒于以上的諸多優(yōu)勢(shì)，所以它應(yīng)用范圍十分廣泛）。 鄭用鏈分子生物學(xué)綜合復(fù)習(xí)題 08基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)鄒曉冬（基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，HZAU） -7 -2. Know-How l 如何驗(yàn)證“DNA半保留復(fù)制”、“DNA半不連續(xù)復(fù)制”? DNA半保留復(fù)制的證明：1957年由Mathew Meselson和Franklin Stahl設(shè)

36、計(jì)。 (1)把大腸桿菌培養(yǎng)在含有單一氮源15N的培養(yǎng)基上培養(yǎng)多代后，DNA呈重密度； (2)轉(zhuǎn)移到僅含有14N的培養(yǎng)基上增殖一代； (3)從這些細(xì)胞制備的DNA在CSCl梯度離心中形成一條帶，它的密度表明這些DNA分子為一條含15N和另一條含14N的雜合鏈； (4)讓細(xì)胞再在14N介質(zhì)中增殖兩代，提取的DNA在CSCl中形成兩條帶，一條是重、輕的雜和鏈，另一條為純輕鏈。 由此證明DNA復(fù)制是半保留的不是全保留的。 DNA半不連續(xù)復(fù)制的證明：1968年由日本學(xué)者岡崎等提出。 用含3H的dT標(biāo)記用T4噬菌體感染的大腸桿菌，在短時(shí)間內(nèi)對(duì)DNA進(jìn)行分離，得到的均為DNA小片段；而過(guò)一段時(shí)間后對(duì)DNA進(jìn)

37、行分離，則檢測(cè)到 DNA大片段。當(dāng)使用DNA連接酶的缺失變異株時(shí)，檢測(cè)到大量DNA片段的積累，由此證明DNA復(fù)制中有小片段合成，即可驗(yàn)證DNA的半不連續(xù)復(fù)制。 l 質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)(ori)的克隆與鑒定 假設(shè)該質(zhì)粒來(lái)自細(xì)菌B（非E. coli），將該質(zhì)粒經(jīng)過(guò)適當(dāng)酶切，克隆到一個(gè)克隆載體（E. coli的質(zhì)粒，攜帶某抗生素R的抗性基因）中，轉(zhuǎn)化E. coli建立一個(gè)該質(zhì)粒的小文庫(kù)，再電轉(zhuǎn)化到細(xì)菌B中，涂含R的培養(yǎng)基平板，陽(yáng)性克?。梢栽谠撡|(zhì)粒宿主B中復(fù)制）進(jìn)行測(cè)序，可初步獲得該質(zhì)粒的ori序列，然后進(jìn)一步精確定位（外切酶酶切逐步縮短，再轉(zhuǎn)化驗(yàn)證）。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法。 l 質(zhì)粒拷貝數(shù)：調(diào)控、測(cè)定 質(zhì)粒拷

38、貝數(shù)是指在正常生長(zhǎng)條件下，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞或每條染色體所對(duì)應(yīng)的平均質(zhì)粒數(shù)。 在質(zhì)粒復(fù)制子的調(diào)控下，質(zhì)?？截悢?shù)可隨細(xì)菌培養(yǎng)條件的變化在一個(gè)較窄的范圍內(nèi)波動(dòng)；生長(zhǎng)條件恒定時(shí)，質(zhì)粒增殖的速度與宿主細(xì)胞增殖的速度完全一致，拷貝數(shù)保持不變。 低拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA在宿主細(xì)胞分裂前只能復(fù)制12次，而高拷貝數(shù)質(zhì)?？梢栽诩?xì)胞分裂前復(fù)制成10200拷貝。低拷貝數(shù)的質(zhì)粒一般是嚴(yán)緊型質(zhì)粒(stringent plasmid)，它們的復(fù)制隨細(xì)菌染色體的復(fù)制同步進(jìn)行；高拷貝數(shù)的質(zhì)粒稱為松弛型質(zhì)粒(relaxed plasmid)，獨(dú)立于細(xì)菌細(xì)胞而自主復(fù)制。 質(zhì)粒的拷貝數(shù)依賴于各種胞內(nèi)外因素：質(zhì)?？截悢?shù)首先決定于自身的遺傳性，

39、控制質(zhì)粒拷貝數(shù)的基因位于一個(gè)包括DNA復(fù)制起點(diǎn)在內(nèi)的質(zhì)粒DNA的區(qū)域內(nèi)。其次，質(zhì)粒的拷貝數(shù)也受細(xì)胞生長(zhǎng)條件的影響。細(xì)胞的生長(zhǎng)速率增大時(shí)，質(zhì)粒的拷貝數(shù)下降，主要是因?yàn)樵诟弑鹊纳L(zhǎng)速率下，質(zhì)粒的復(fù)制速度跟不上細(xì)胞分裂的速度，從而質(zhì)粒拷貝數(shù)不斷下降。此外，培養(yǎng)時(shí)的溫度和培基的組成都對(duì)質(zhì)?？截悢?shù)有影響，比如當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物限制或缺乏時(shí)會(huì)使質(zhì)粒的拷貝數(shù)下降。 測(cè)定胞內(nèi)質(zhì)?？截悢?shù)的方法，大致可以歸納為兩類： (1）是直接進(jìn)行測(cè)定的方法，包括一些物理分離的方法和雜交的方法； (2）是間接進(jìn)行測(cè)定的方法。 物理分離的方法就是將質(zhì)粒DNA與染色體DNA進(jìn)行分離并定量。將質(zhì)粒DNA與染色體DNA分開(kāi)主要是基于質(zhì)粒DNA的

40、兩大特性：質(zhì)粒DNA是以共價(jià)閉合環(huán)狀的形式存在，與染色體DNA的線狀形式不同；質(zhì)粒DNA的分子量比染色體DNA要小得多。這些方法主要包括：氯化銫-溴化乙錠平衡梯度離心法、凝膠電泳法、高效液相色譜法以及毛細(xì)管電泳法等。 核酸雜交法是根據(jù)同源核酸序列可以配對(duì)的原理，人工制備出與特定片段有廣泛順序一致性的DNA或RNA探針，通過(guò)觀察是否有DNA.DNA或DNA. RNA雜交分子的生成來(lái)檢測(cè)特定基因的方法。通常用來(lái)測(cè)定質(zhì)?？截悢?shù)的雜交方法有Dot-blot和Southern-blot兩種。 間接測(cè)定質(zhì)?？截悢?shù)，即測(cè)定基因的劑量，不是象其它方法那樣直接測(cè)定質(zhì)粒的濃度，而是通過(guò)確定質(zhì)粒所編碼的某個(gè)基因產(chǎn)物

41、的功能來(lái)反映質(zhì)粒的含量。這種方法一般都是通過(guò)測(cè)定某個(gè)酶的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的，最常用的是測(cè)定-內(nèi)酰胺酶的活性。采用這種方法的前提是確證所分析的表現(xiàn)型與基因劑量之間是呈線性關(guān)系，并且這個(gè)基因定位在質(zhì)粒上。 鄭用鏈分子生物學(xué)綜合復(fù)習(xí)題 08基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)鄒曉冬（基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，HZAU） -8 -l F質(zhì)粒的復(fù)制與接合轉(zhuǎn)移 接合轉(zhuǎn)移是兩個(gè)完整的細(xì)菌細(xì)胞通過(guò)性菌毛直接接觸，由供體細(xì)菌將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移給受體細(xì)菌的過(guò)程。接合性質(zhì)粒有F質(zhì)粒、R質(zhì)粒等。F質(zhì)粒是19521953年間由萊德伯格等人最先發(fā)現(xiàn)的一種質(zhì)粒。 F質(zhì)粒（決定細(xì)菌的性別）的復(fù)制與接合轉(zhuǎn)移 有性菌毛的細(xì)菌有F質(zhì)粒，相當(dāng)于雄性菌，以F+表示；無(wú)性菌毛的細(xì)菌無(wú)

42、F質(zhì)粒，相當(dāng)于雌性菌，以F-表示。F+菌的性菌毛末端與F-菌表面上的受體結(jié)合，結(jié)合后性菌毛漸漸縮短，使兩菌緊靠在一起，F(xiàn)+菌中F質(zhì)粒的一股DNA鏈斷開(kāi)，逐漸由細(xì)胞連接處伸入F-菌，繼而以滾環(huán)模式進(jìn)行復(fù)制。所以在受體菌獲得F質(zhì)粒時(shí)，供體菌并不失去F質(zhì)粒；受體菌在獲得F質(zhì)粒后即變?yōu)镕+菌，也長(zhǎng)出性菌毛。 l 線性DNA末端的復(fù)制 所有已知的核酸聚合酶，無(wú)論是DNA聚合酶還是RNA聚合聚合酶都只從5端向3端移動(dòng)，新鏈的合成方向與聚合酶移動(dòng)方向一致，即只能是5 3；而對(duì)于DNA的合成必需一段引物的存在，體內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)，由一段RNA引物起始DNA合成，起始后它必須切除，切除后，5端如何起始呢？ 4種解

43、決途徑： (1）通過(guò)將線性復(fù)制子轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀或多聚分子。如噬菌體：滾環(huán)產(chǎn)生多聚復(fù)制子）； (2）某種蛋白質(zhì)可能會(huì)介入，在真正的末端上啟動(dòng)。幾種線性病毒核酸具有與5端堿基共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)，其中了解最清楚的例子是腺病毒 DNA )。 (3）DNA可形成特殊的結(jié)構(gòu)，如在末端形成發(fā)夾。使分子沒(méi)有游離末端。草履蟲（Paramecium）的線性線粒體DNA的復(fù)制中就形成了一種交聯(lián)； (4）末端是可變的，而不是精確確定的。真核生物染色體可能采用這種方式，在這種情況下，DNA末端的短重復(fù)序列的拷貝數(shù)改變（如端粒的復(fù)制）。 l 常見(jiàn)的三種DNA復(fù)制模式的特點(diǎn) （1）Cairns模型(Cairns model)：即

44、模型，是環(huán)狀雙鏈DNA的一種復(fù)制模型。 細(xì)菌DNA的復(fù)制遵循環(huán)狀DNA分子雙向復(fù)制的原則，首先在復(fù)制點(diǎn)形成一個(gè)復(fù)制“泡”，隨之沿著環(huán)的兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制，泡逐漸擴(kuò)大，形成像希臘字母“”的形狀，故環(huán)狀DNA的雙向復(fù)制模式稱為模型，最后由一個(gè)DNA環(huán)復(fù)制為兩個(gè)子環(huán)。 Ø 最好歸納為半保留半不連續(xù)復(fù)制的情況。（復(fù)制相對(duì)較少） （2）滾環(huán)模型(rolling-circle model)：即模型，是環(huán)狀單鏈DNA的一種復(fù)制模型。 某些病毒或細(xì)菌的雙鏈環(huán)狀DNA或以某種方式轉(zhuǎn)變的雙鏈環(huán)狀DNA，在復(fù)制時(shí)由對(duì)正鏈復(fù)制原點(diǎn)處進(jìn)行單鏈特異性切割，所形成的5端即從雙股DNA置換出來(lái)，并為SSB所覆蓋，這時(shí)

45、的DNA聚合酶III以3OH為引物，以負(fù)鏈為模板，從3OH基端逐步增添脫氧核苷酸，隨著復(fù)制的進(jìn)行，5端長(zhǎng)度即不斷增加，這一過(guò)程中，單鏈尾巴的延伸伴隨著雙鏈DNA的繞軸轉(zhuǎn)動(dòng)，故稱為滾環(huán)式復(fù)制。 真核rDNA的擴(kuò)增、F因子DNA的轉(zhuǎn)移、裂解途經(jīng)的復(fù)制以及 X174、M13、G4等環(huán)狀單鏈DNA噬菌體的第二階段復(fù)制都是進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制的。 滾環(huán)復(fù)制又叫復(fù)制，有以下特點(diǎn)： 共價(jià)延伸。先在一條親代鏈（鏈）上切一缺口，然后以另一環(huán)狀負(fù)鏈為模板，在正鏈切口上的3OH上延伸，新合成的鏈和正鏈連在一道； 模板鏈和新合成的鏈分開(kāi)。3端不斷延環(huán)狀模板合成，5端脫離負(fù)環(huán)，隨著復(fù)制，游離的5端越來(lái)越長(zhǎng)，和環(huán)狀模板完全分開(kāi)；

46、 不需RNA引物，在正鏈3OH上延伸； 只有一個(gè)復(fù)制叉； 形成多聯(lián)體（concatemer）：5游離的部分經(jīng)半保留復(fù)制形成雙鏈，并含有多個(gè)基因組，串聯(lián)在一起稱為多聯(lián)體。的增殖、接合，以及真核生物rDNA的擴(kuò)增都是以這種形式。 （3）D環(huán)模型(D-Loop model)：是線粒體、葉綠體DNA的一種復(fù)制模型。 線粒體DNA的雙股鏈由于浮力密度的不同而分為輕鏈（L鏈）和重鏈（H鏈），它有兩個(gè)單向復(fù)制叉，兩條鏈的復(fù)制原點(diǎn)不在同一點(diǎn)上，而且兩個(gè)復(fù)制原點(diǎn)的激活有先有后，復(fù)制從H鏈的原點(diǎn)開(kāi)始，以L鏈為模板，新合成的H 鏈即轉(zhuǎn)換為原來(lái)的 H鏈，所形成的結(jié)構(gòu)為取代環(huán)，或D-環(huán)，故稱D環(huán)復(fù)制。 鄭用鏈分子生物學(xué)

47、綜合復(fù)習(xí)題 08基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)鄒曉冬（基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，HZAU） -9 - D環(huán)復(fù)制又叫復(fù)制，有以下特點(diǎn)： (1)mtDNA的每條鏈有1個(gè)獨(dú)立的復(fù)制起始點(diǎn)序列； (2)H鏈在D環(huán)中啟動(dòng)復(fù)制； (3)當(dāng)?shù)谝粋€(gè)fork移動(dòng)使L鏈的起始點(diǎn)暴露時(shí)，L鏈啟動(dòng)復(fù)制； (4)葉綠體DNA采用相同的復(fù)制機(jī)制； (5)mtDNA 的復(fù)制是隨機(jī)的； (6)線粒體通過(guò)增加與其數(shù)量呈比例的基因組數(shù)目來(lái)完成其DNA復(fù)制； (7)不同mtDNA復(fù)制次數(shù)可能不同，這可能導(dǎo)致子代線粒體中等位基因的表現(xiàn)度改變； (8)線粒體分離到子細(xì)胞中也是隨機(jī)的。 l DNA Polymerase I：結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用 大腸桿菌DNA聚合酶I是一種

48、依賴于DNA的DNA聚合酶，分子量109kd。它有53DNA聚合酶活性，53及35外切酶活性。 DNAPol I在空間結(jié)構(gòu)上近似球體，直徑約65A。在酶的縱軸上有一個(gè)約20A的深溝(cleft)，帶有正電荷，這是該酶的活性中心位置，在此位置上至少有6個(gè)結(jié)合位點(diǎn)： 1）模板DNA結(jié)合位點(diǎn)； 2）DNA生長(zhǎng)鏈或引物結(jié)合位點(diǎn)； 3）引物末端結(jié)合位點(diǎn)，用以專一引物或DNA生長(zhǎng)鏈的3'-OH； 4）脫氧核苷三磷酸結(jié)合位點(diǎn)； 5）5'3'外切酶活性位點(diǎn)，用以結(jié)合生長(zhǎng)鏈前方的5'-端脫氧核苷酸并切除之； 6）3'5'外切酶活性位點(diǎn)，用以結(jié)合和切除生長(zhǎng)鏈上未配對(duì)

49、的3'-端核苷酸。 DNA聚合酶I的功能： 53的聚合作用。但不是復(fù)制染色體而是修補(bǔ)DNA，填補(bǔ)DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。 53外切酶活性。切除受損傷的DNA。它在切口平移（nick translation）中應(yīng)用。 35的外切酶活性。消除在聚合作用中摻入的錯(cuò)誤核苷酸切口平移（nick translation）；鏈的置換及模板轉(zhuǎn)換（template-switching）等。 4內(nèi)切酶活性。 DNA聚合酶I的應(yīng)用 在基因工程技術(shù)中，常用于補(bǔ)平限制酶切割DNA后產(chǎn)生的3凹端，以進(jìn)行末端標(biāo)記，從而合成cDNA第二鏈； 在體外誘變中從單鏈模板中合成雙鏈DNA，用于雙脫氧末端

50、終止法進(jìn)行DNA測(cè)序； 用于PCR。 l DNA甲基化：形式、意義、檢測(cè)方法 DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下,在基因組CPG二核苷酸的胞嘧啶5碳位共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基因。 DNA甲基化主要形式：5甲基胞嘧啶（5-mC）、少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7甲基鳥嘌呤（7-mG）。 DNA甲基化的意義：能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。 DNA甲基化的檢測(cè)方法： （1）重亞硫酸鹽(亞硫酸氫鹽)修飾：未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶；甲基化的胞嘧啶不發(fā)生變化。 （2）用甲基化特異性引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增：未甲基化引物對(duì)(“U”

51、primers, Tube 1)；甲基化引物對(duì)(“M”primer, Tube 2)。 鄭用鏈分子生物學(xué)綜合復(fù)習(xí)題 08基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)鄒曉冬（基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，HZAU） -10 第4章 轉(zhuǎn)錄 1. Basic Concepts l 模板鏈(template strand):是DNA雙鏈中按堿基配對(duì)規(guī)律能指引轉(zhuǎn)錄生成RNA的一股單鏈，也稱有意義鏈或Watson鏈。 l 編碼鏈(coding strand): 是DNA雙鏈中與模板鏈相對(duì)的單鏈，不進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，也稱反義鏈或Crick鏈。 l 轉(zhuǎn)錄單位(transcription unit): 是轉(zhuǎn)錄后形成一個(gè)RNA分子的一段DNA序列。 l 轉(zhuǎn)錄因子(tran

52、scription factor): 是指能夠結(jié)合在某基因上游特異核苷酸序列上的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)能調(diào)控其基因的轉(zhuǎn)錄。它是轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中RNA聚合酶所需的輔助因子。 l 啟動(dòng)子(promoter): 是DNA模板上專一地與RNA聚合酶結(jié)合并決定轉(zhuǎn)錄從何處起始的部位，也決定基因的轉(zhuǎn)錄效率。（啟動(dòng)子可以被RNA聚合酶辨認(rèn)，并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。） l 增強(qiáng)子(enhancer): 是增加同它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率的DNA序列。它是通過(guò)啟動(dòng)子來(lái)增加轉(zhuǎn)錄的，有效的增強(qiáng)子可以位于基因的5端，也可位于基因的3端，有的還可位于基因的內(nèi)含子中。 l 沉默子(silencer): 是參與基因表達(dá)負(fù)調(diào)控的一種元件，是在研究t淋巴細(xì)胞的t抗原受體(tcr)基因表達(dá)調(diào)控時(shí)發(fā)現(xiàn)的。 l 終止子(terminator): 是一段位于基因或操縱組末端的DNA片段，可中斷轉(zhuǎn)錄作用。 l 抗終止作用(anti-termina