疫苗中支原體的檢測

1、疫苗中支原體的檢測11級生技母若雨指導教師：張麗嬌主要內容 1.支原體 2.支原體的危害 3.支原體的檢測方法培養(yǎng)法培養(yǎng)法指示細胞培養(yǎng)法指示細胞培養(yǎng)法1.支原體又稱霉形體，為目前發(fā)現(xiàn)的最小的最簡單的原核生物。結構也比較簡單，多數(shù)呈球形，沒有細胞壁，只有三層結構的細胞膜，故具有較大的可變性。其大小介于細菌和病毒之間?？赏ㄟ^濾菌器，常給細胞培養(yǎng)工作及發(fā)酵和制藥滅菌帶來污染的麻煩。一般能以葡萄糖或精氨酸為主要碳源。2.支原體的危害 致病支原體一般包括肺炎支原體，人型支原體，生殖器支原體。肺炎支原體引起支原體肺炎，又稱原發(fā)性非典型肺炎，支原體肺炎全年均可發(fā)病，以冬季多見，可有小流行。人型支原體和生殖器

2、支原體一般引起尿道及生殖器的感染。3.1培養(yǎng)法培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基靈敏度檢測培養(yǎng)基處理接種培養(yǎng)結果判定推薦培養(yǎng)基及其處方（1）支原體肉湯培養(yǎng)基 豬胃消化液500ml 氯化鈉2.5g 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 5.0g 酵母浸粉5.0g 酚紅0.02g pH值7.60.2于121滅菌15分鐘。（2）精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基 豬胃消化液500ml 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 1.0g 酵母浸粉5.0g L-精氨酸2.0g 酚紅0.02g 氯化鈉2.5g pH值7.10.2。于121滅菌15分鐘。（3）支原體半流體培養(yǎng)基 按（1）項處方配制，培養(yǎng)基中不加酚紅，加 入瓊脂2.53.0g

3、。（4）支原體瓊脂培養(yǎng)基 按（1）項處方配制，培養(yǎng)基中不加酚紅，加入 瓊脂13.015.0g。培養(yǎng)基靈敏度檢測（1）菌種肺炎支原體（ATCC 15531）、口腔支原體（ATCC 23714），由國家藥品檢定機構分發(fā)。（2）操作 將菌種接種于適宜的支原體培養(yǎng)基中，經(jīng)361培養(yǎng)至培養(yǎng)基變色，盲傳2代后，將培養(yǎng)物接種到待檢培養(yǎng)基中，做10倍系列稀釋，肺炎支原體稀釋至10-710-9，接種在支原體肉湯培養(yǎng)基內；口腔支原體稀釋至10-310-5，接種在精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基內。每個稀釋度接種3 支試管，置36 士1 培養(yǎng)7 14 天，觀察培養(yǎng)基變色結果。( 3 )結果判定 以接種后培養(yǎng)基管數(shù)的2 / 3

4、 以上呈現(xiàn)變色的最高稀釋度為該培養(yǎng)基的靈敏度。 液體培養(yǎng)基的靈敏度：肺炎支原體（ATCC 15531 ) 應達到10-8 ，口腔支原體（ATCC 23714 ）應達到10-4。培養(yǎng)基處理 檢查支原體采用支原體半流體培養(yǎng)基和支原體肉湯培養(yǎng)基（或支原體瓊脂培養(yǎng)基）。支原體半流體培養(yǎng)基（或瓊脂培養(yǎng)基）在使用前應煮沸10 15 分鐘，冷卻至56 左右，然后加人滅能新生牛血清（培養(yǎng)基與血清體積比為8:2 ) ，并可酌情加入適量青霉素，充分搖勻。液體培養(yǎng)基除無需煮沸外，使用前亦應同樣補加上述成分。接種培養(yǎng) 取每支裝量為10ml 的支原體半流體培養(yǎng)墓（已冷至36 士1 ）和支原體肉湯培養(yǎng)基各4 支，每支培養(yǎng)

5、基接種供試品0.5 1.0ml ，置36 士1 培養(yǎng)21 天。于接種后的第7 天從4 支中取2 支進行次代培養(yǎng)，每1 支培養(yǎng)基轉種支原體半流體培養(yǎng)基及支原體肉湯培養(yǎng)基各2 支，置36 士l 培養(yǎng)21 天，每隔3 天觀察1 次結果判定 培養(yǎng)結束時，如接種供試品的培養(yǎng)基均無支原體生長， 則供試品判為合格；如疑有支原體生長，可取加倍量供試品復試，如無支原體生長，供試品判為合格，如仍有支原體生長，則供試品判為不合格。3.2指示細胞培養(yǎng)法（DNA染色法）實驗試劑的制備培養(yǎng)基及指示細胞的處理供試品處理用指示細胞培養(yǎng)后固定封片陰性、陽性對照處理結果判定實驗試劑制備（1）二苯甲酰胺熒光染料濃縮液 稱取二苯甲酰

6、胺熒光染料5mg ，加人100ml 不含酚紅和碳酸氫鈉的Hank s 平衡鹽溶液中，室溫下用磁力攪拌器攪拌3040 分鐘，使完全溶解，-20 避光保存。（2）二苯甲酰胺熒光染料工作液 無酚紅和碳酸氫鈉的Hank s 溶液100ml 中加人二苯甲酰胺熒光染料濃縮液lml ，混勻。（3）固定液 醋酸:甲醉（體積比1:3 ）混合溶液。（4）封片液 量取0.1mol / L 枸櫞酸溶液22.2ml 、0.2mol / L 磷酸氫二鈉溶液27.8ml 、甘油50.0ml ，混勻，調pH 值至5.5 。培養(yǎng)基及指示細胞處理（1） DMEM 完全培養(yǎng)基。 ( 2 ) DMEM 無抗生素培養(yǎng)基。 ( 3 )指

7、示細胞（已證明無支原體污染的Vero細胞或其他傳代細胞） 取培養(yǎng)的Vero細胞經(jīng)消化后，制成每lml 含105 的細胞懸液，以每孔0.5ml 接種6 孔細胞培養(yǎng)板或其他容器，每孔再加無抗生素培養(yǎng)基3ml ，于36 士1 、5 二氧化碳條件下培養(yǎng)過夜，備用。供試品處理（1）細胞培養(yǎng)物 將供試品經(jīng)無抗生素培養(yǎng)液至少傳1 代，然后取細胞已長滿的且3 天未換液的細胞培養(yǎng)上清液待檢。（2）毒種懸液 如該毒種對指示細胞可形成病變并影響結果判定時，應用對支原體無抑制作用的特異抗血清中和病毒后或用不產生細胞病變的另一種指示細胞進行檢查。（3）其他供試品 檢查時所選用的指示細胞應為該供試品對其生長無影響的細胞。

8、用指示細胞培養(yǎng)后固定封片 于制備好的指示細胞培養(yǎng)板中加入供試品（細胞培養(yǎng)上清液）2ml （毒種或其他供試品至少lml） , 于36 士1 、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)35 天。指示細胞培養(yǎng)物至少傳代1 次，末次傳代培養(yǎng)用含蓋玻片的6 孔培養(yǎng)板培養(yǎng)35 天后，吸出培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，加人固定液5ml ，放置5 分鐘，吸出固定液，再加5ml 固定液固定10 分鐘，吸出固定液，使蓋玻片在空氣中干操，加二苯甲酰胺熒光染料（或其他DNA 染料）工作液5ml ，加蓋，室溫放置30 分鐘，吸出染液，每孔用水5ml 洗3 次，吸出水，蓋玻片于空氣中干燥，取潔凈載玻片加封片液1 滴，分別將蓋玻片面向下蓋在封片液上制成封片。用熒光顯微鏡觀察。陰性、陽性對照處理 用無抗生素培養(yǎng)基2ml 替代供試品，同法操作，作為陰性對照 用已知陽性的供試品標準菌株2ml 替代供試品，同法操作，作為陽性對照。結果判定（1）陰性對照 ：僅見指示細胞