抗氧化劑抗氧化活性的測(cè)定方法

1、1 .抗氧化劑是指在低濃度下能有效延緩或阻止底物氧化的物質(zhì)。被氧化的底物包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖和DNA。2 .初始型抗氧化劑(AH)可通過(guò)與脂質(zhì)自由基L.、過(guò)氧自由基LOO.或烷氧自由基LO.反應(yīng)抑制脂質(zhì)氧化鏈反應(yīng)。L.+AH-LH+A.LOO.+AH-LOOH+A.LO.+AH-LOH+A.抗氧化劑自由基A.也能與過(guò)氧自由基、烷氧自由基反應(yīng)從而終止脂質(zhì)氧化反應(yīng)。LOO.+A.-LOOALO.+A.-LOA次級(jí)型抗氧化劑可通過(guò)各種機(jī)理延緩脂質(zhì)氧化，如螯合過(guò)渡金屬、給初始型抗氧化劑補(bǔ)充氫、清除氧以及使活性物質(zhì)失活等。抗氧化劑的活性分為在生物體外(如食品中)的活性和在生物體內(nèi)的活性。本文綜述了體外測(cè)

2、定抗氧化劑抗氧化活性的方法，不包括在生物體中測(cè)定生物活性的方法。3.評(píng)價(jià)或表征抗氧化活性的方法為了說(shuō)明在特定條件下被測(cè)物抑制底物氧化的效力或清除自由基的能力實(shí)際測(cè)定時(shí)至少要說(shuō)明在測(cè)試條件下被測(cè)物是抗氧化劑還是促氧化劑在指定濃度下比較不同測(cè)試材料(如被測(cè)物與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑或添加有被測(cè)物的測(cè)試體系與空白體系)對(duì)底物的作用。評(píng)價(jià)或表征抗氧化活性的方法有：(1)在指定的時(shí)間測(cè)量氧化產(chǎn)物或官能團(tuán)的濃度或吸光度值(2)測(cè)量反應(yīng)的速率；(3)測(cè)量誘導(dǎo)期(延滯期)或氧化達(dá)到一定程度所需的時(shí)間(4)測(cè)量速度的積分(即動(dòng)力學(xué)曲線下的面積)；(5)測(cè)量被測(cè)物產(chǎn)生與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑相當(dāng)作用的濃度。4.參數(shù)4.1 誘導(dǎo)期(i

3、nductionperiod)誘導(dǎo)期tIND(也叫延滯期，lagperiod)常定義為化學(xué)反應(yīng)的速度。誘導(dǎo)期是一個(gè)相當(dāng)不確定的值，受檢測(cè)方法、使用儀器的靈敏性以及一些其他因素的影響。對(duì)于脂質(zhì)氧化，誘導(dǎo)期通常是指鏈增長(zhǎng)階段動(dòng)力學(xué)曲線的切線和時(shí)間軸的交點(diǎn)。4.2 抑制率(percentageofinhibition)和IC50抑制率和IC50(抗氧化劑提供50%抑制作用時(shí)的濃度，也可用EC50表示的)常用來(lái)表征抗氧化能力。它們不僅與被測(cè)抗氧化劑的反應(yīng)性能和氧化的底物有關(guān)，而且受其他因素的影響，如脂質(zhì)氧化鏈反應(yīng)的長(zhǎng)度和抑制速率等。此外，用IC50表征抗氧化劑的活性與比較活性的時(shí)間點(diǎn)有關(guān)。只有在其他參

4、數(shù)相同的情況下，在某一研究中測(cè)得的抑制率和IC50才可以與另一研究中測(cè)得的值進(jìn)行直接比較。TEC50是指抗氧化劑提供50%抑制作用所需的時(shí)間，也常用來(lái)表征抗氧化活性5.對(duì)測(cè)定方法的要求測(cè)定抗氧化劑抗氧化活性的方法應(yīng)滿足如下要求：(1)能說(shuō)明測(cè)試體系中發(fā)生的反應(yīng)，并能用明確的動(dòng)力學(xué)圖解描述(2)測(cè)試要有再現(xiàn)性；(3)測(cè)試效率要足夠高；(4)方法要相對(duì)簡(jiǎn)單；(5)能連續(xù)檢測(cè)；(6)應(yīng)使用與體內(nèi)或食品有關(guān)的活性自由基；(7)分析中被測(cè)物的濃度在食品中或在生物體內(nèi)能夠得到；(8)除了適合純?nèi)芤和猓€適合復(fù)雜生物組織和天然產(chǎn)物的測(cè)定；(9)水溶性的和脂溶性的化合物都適用。6.測(cè)定抗氧化活性的方法大多數(shù)方

5、法涉及到直接或間接測(cè)量：(1)底物或標(biāo)記底物或氧消耗的衰減，（2）氧化產(chǎn)物的生成,（3）特征自由基的形成或衰減的速度或程度。在（1）和（2）中，抗氧化活性是以對(duì)反應(yīng)物的消耗或生成物的形成的程度或速率來(lái)表征抗氧化活性的；（3）是假設(shè)通過(guò)捕獲脂質(zhì)自動(dòng)氧化中的自由基抑制氧化的，因此集中在檢測(cè)被測(cè)抗氧化劑對(duì)自由基的捕獲或抑制自由基的形成的能力上，而不是檢測(cè)實(shí)際發(fā)生的氧化反應(yīng)，如ABTS法和DPPH法。以抗氧化劑抑制脂質(zhì)氧化為基礎(chǔ)的方法脂質(zhì)中的不飽和脂肪酸自動(dòng)氧化，生成不穩(wěn)定的氫過(guò)氧化物，氫過(guò)氧化物繼續(xù)分解形成短碳鏈的醛、酮、酸等小分子化合物?？寡趸瘎┑募尤肟梢匝泳彋溥^(guò)氧化物及其分解產(chǎn)物的形成，由此可測(cè)

6、得抗氧化活性。由于氧化的底物、引發(fā)或加速氧化的方法以及脂質(zhì)氧化檢測(cè)方法的不同該法又可分為以下幾種情況。氧化的底物或使用的體系以抗氧化劑抑制脂質(zhì)氧化為基礎(chǔ)的測(cè)量抗氧化活性的方法經(jīng)常使用。常使用純的甘油三酸酯、植物油（紅花油、葵花油、大豆油、橄欖油等）、魚(yú)油或豬油作為氧化反應(yīng)的底物，也使用磷脂或脂蛋白作為底物。為了得到重復(fù)性的結(jié)果，選擇底物時(shí)應(yīng)優(yōu)先考慮單一的物質(zhì)，如亞油酸或亞油酸甲酯底物中含有的抗氧化劑（如植物油中常含有VE）也能參與測(cè)試過(guò)程，干擾測(cè)定。但是實(shí)際測(cè)定中常使用植物油等脂質(zhì)混合物，因?yàn)樗鼈兪桥c真實(shí)食品有關(guān)的脂質(zhì)成分。實(shí)際操作中應(yīng)根據(jù)具體的測(cè)試方法選擇合適的底物和測(cè)試體系。引發(fā)或加速氧化

7、的方法各種加速氧化的方法，如烘箱法、活性氧法、Rancimat法、OSI法這些方法是通過(guò)升溫或增加氧濃度加速氧化的。自由基引發(fā)劑加速脂質(zhì)氧化，常用熱不穩(wěn)定的偶氮化合物作為引發(fā)劑，最典型的是水溶性的AAPH和脂溶性的AMVN。除此之外，還有水溶性的ABAP、ABIP和脂溶性的ADVN、AIBN等，也有用DBHN的上述偶氮化合物在適當(dāng)?shù)臏囟认履芤孕枰乃俣确纸猓苫钚宰杂苫Ｓ捎跍囟热菀赘淖兒捅３?，因此引發(fā)速率容易控制。上述引發(fā)劑的優(yōu)點(diǎn)是自由基的生成速度與引發(fā)劑的濃度成比例，與測(cè)試體系中的其他成分無(wú)關(guān)但是，用自由基引發(fā)劑加速反應(yīng)時(shí)抗氧化劑的抗氧化能力主要體現(xiàn)在供氫的速度上，沒(méi)有考慮抗氧化劑自身生

8、成的自由基的作用，而有些抗氧化劑被氧化后的產(chǎn)物也能參與抑制作用，對(duì)抗氧化活性有一定影響。在食品體系和生物體系中還普遍使用過(guò)渡金屬或過(guò)渡金屬的氧化還原反應(yīng)引發(fā)氧化，如Fe2+和Cu2+、Fe3+/抗壞血酸等。但是這些體系中的一些成分（如抗壞血酸）能與自由基反應(yīng)，干擾測(cè)定結(jié)果。而且使用含有過(guò)渡金屬的體系不能將不同于初始型抗氧化劑的抑制機(jī)理（如螯合作用）區(qū)別開(kāi)。也有用光照或紫外光來(lái)加速氧化的，但是光引發(fā)脂質(zhì)氧化可能引起氧化機(jī)理的改變，因此這種方法不常用。脂質(zhì)氧化的檢測(cè)在化學(xué)方法中，過(guò)氧化值、碘值、游離脂肪酸的含量（酸值）、TBARS法、?；衔?、克雷斯試驗(yàn)和茴香胺值已被廣泛采用。至于物理方法，如粘

9、度、顏色、共鈍二烯含量、紅外光譜、折光指數(shù)、介電常數(shù)和氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用等已用于油脂氧化的測(cè)定。此外，不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比率（C18:2/C16:0）、聚合物的含量、極性脂類(lèi)的含量也可用于檢測(cè)脂質(zhì)的氧化程度。除上述方法外，測(cè)量體系中氧的減少造成壓力變化的氧壓法，測(cè)量氧消耗的氧電極法，測(cè)量底物中不飽和脂肪酸的減少以及氧化后底物的增重等方法也常用于檢測(cè)脂質(zhì)的氧化6.1.3,1脂質(zhì)氧化初期產(chǎn)物的檢測(cè)(1)過(guò)氧化值(peroxidevalue,PV)法。過(guò)氧化值是測(cè)量脂質(zhì)氧化最常用的方法，反映了脂質(zhì)和含脂原料中氫過(guò)氧化物和脂質(zhì)過(guò)氧化物的總含量。測(cè)量PV的方法有很多，但其

10、原理均系碘化氫還原此法是根據(jù)脂質(zhì)氧化生成的氫過(guò)氧化物ROOH和過(guò)氧化物ROOR能將碘離子氧化成碘分子進(jìn)行測(cè)定的，原理如下：ROOH+2H+2I-I2+ROH+H2OROOR+2H+2I-I2+2ROHI2+2S2O3-S4O62-+2I2此法靈敏度低，選擇性差。碘化氫易被氧化，還極易與碳碳雙鍵加成，而且生成的碘也能與不飽和雙鍵加成，使測(cè)得的結(jié)果偏低。此外，樣品的量、溶劑、反應(yīng)條件(如時(shí)間、溫度)和滴定速度的不同都會(huì)造成誤差。(2)共鈍二烯氫過(guò)氧化物法。共鈍二烯作為測(cè)量脂質(zhì)氧化的一種簡(jiǎn)單的方法和有用的指標(biāo)已普遍用于樣品抗氧化活性的測(cè)定。共鈍二烯的量可通過(guò)在某一時(shí)間的吸光值計(jì)算。此法適合純脂質(zhì)體系

11、中脂質(zhì)氧化的研究。由于組織樣品和生物體液含有許多在紫外光區(qū)有強(qiáng)吸收的物質(zhì)(如血紅蛋白、葉綠素、喋吟和喀咤等)干擾測(cè)定，所以一般不能直接測(cè)量其共鈍二烯。這可以通過(guò)在分析前用有機(jī)溶劑將脂質(zhì)提取出來(lái)加以解決。脂質(zhì)中的脂肪酸在紫外區(qū)也有吸收，對(duì)測(cè)定結(jié)果也有一定的影響。此外，共鈍二烯不穩(wěn)定，在生成的同時(shí)也會(huì)分解，因此共鈍二烯的量反映的只是氧化早期階段脂質(zhì)氧化的程度。該法不適合測(cè)量飽和脂肪酸含量高的油，如棕植油（3）硫富酸鐵（ferricthiocyanatemethod,FTC）法。此法是根據(jù)脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的過(guò)氧化物將Fe2+氧化成Fe3+,Fe3+與硫富酸鏤反應(yīng)，生成的硫富酸鐵在500nm處有強(qiáng)吸收，通

12、過(guò)500nm吸光度的變化可測(cè)得過(guò)氧化物的含量。6.1.3.2脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物的檢測(cè)脂質(zhì)氧化初期產(chǎn)物不穩(wěn)定，可分解生成醛（如己醛）、酮（如丁酮、戊酮、辛酮）、酸和炫類(lèi)等小分子物質(zhì)，這些氧化的終產(chǎn)物也用于脂質(zhì)氧化的檢測(cè)，TBARS法是目前使用最普遍的方法。但是脂質(zhì)氧化形成的丙二醛并不多，絕大多數(shù)與TBA結(jié)合的丙二醛是在酸性條件加熱時(shí)由過(guò)氧化物分解生成的。而且TBA還可以和氧化的蛋白質(zhì)，核酸等反應(yīng)生成和TBA-丙二醛反應(yīng)物類(lèi)似的紅色物質(zhì)，532535nm處的吸收包括了這些物質(zhì)的貢獻(xiàn)。用熒光法可以避免這一點(diǎn)。測(cè)量前，用HPLC分離產(chǎn)物也可以減少誤差。脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物中還含有戊烷、己烷、己醛等炫類(lèi)氣體，這些

13、氣體可以用氣相色譜檢測(cè)。通過(guò)某一小分子氣體的量的變化，可反映脂質(zhì)氧化程度，通常以己醛為檢測(cè)指標(biāo)。該法準(zhǔn)確，重復(fù)性好。測(cè)量脂質(zhì)氧化的方法很多，以過(guò)氧化值、共鈍二烯、TBARS法和頂空氣相色譜法最為常用6.2清除自由基的方法ABTS法ABTS（波長(zhǎng)max=342nm）可被K2s2O8、MnO2、ABAP和H2O2等各種試劑氧化，生成藍(lán)綠色的自由基陽(yáng)離子ABTS.+oABTS.+相當(dāng)穩(wěn)定，在414、645、734和805nm處有最大吸收峰。在有供氫能力的抗氧化劑（如酚類(lèi)物質(zhì)）存在下，ABTS.+與之反應(yīng)，變成沒(méi)有顏色的ABTS。抗氧化齊I清除ABTS.+的能力可用414或734nm處吸光度的變化測(cè)量

14、。測(cè)得的結(jié)果以TEAC（當(dāng)量抗氧化能力）表示，即被測(cè)抗氧化劑清除ABTS.+的能力（吸光度大小的變化）與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑trolox（VE的水溶性類(lèi)似物）清除ABTS.+的能力的比值。trolox的TEAC值是1。Miller等人提出的ABTS法中,ABTS.+是由ABTS與鐵肌紅蛋白自由基（ferrylmyoglobin）反應(yīng)生成的，而鐵肌紅蛋白自由基由高鐵肌紅蛋白（metamyoglobin）和H2O2反應(yīng)生成。在這種方法中，被測(cè)物是在H2O2引發(fā)生成ABTS.+前加入的，抗氧化劑也能和鐵肌紅蛋白自由基反應(yīng)，造成TEAC值被高估。根據(jù)ABTS.+的生成方法和參比抗氧化劑的不同，提出了幾種改進(jìn)的

15、ABTS法，在這些方法中ABTS.+都是在添加被測(cè)試樣前生成的，避免了干擾ABTS法廣泛用于評(píng)價(jià)抗氧化劑清除自由基的能力。此法快速簡(jiǎn)單，可用于常規(guī)測(cè)定。但對(duì)于同一物質(zhì)，測(cè)得的TEAC值往往不同，造成TEAC值不同的主要原因有：生成ABTS.+的方法、被測(cè)物的濃度、反應(yīng)持續(xù)的時(shí)間、測(cè)試體系的pH值和測(cè)試所用波長(zhǎng)不同。ABTS測(cè)試所需時(shí)間一般為56min,有些抗氧化劑在使用的時(shí)間內(nèi)沒(méi)有完全與ABTS.+反應(yīng)，造成TEAC值被低估。此外，有些化合物清除ABTS.+后的產(chǎn)物也能與ABTS.+反應(yīng)，測(cè)得的TEAC值是被測(cè)化合物與反應(yīng)產(chǎn)物的TEAC值的和在測(cè)定化合物抗氧化能力時(shí),相當(dāng)高抗氧化能力的產(chǎn)物的生

16、成是個(gè)缺陷。ABTS.+在與氫原子供體的反應(yīng)中選擇性差是此法的又一個(gè)不足，它可與任何羥基化的芳香族化合物反應(yīng)，這與它們實(shí)際抗氧化能力無(wú)關(guān)，TEAC值也包括對(duì)抗氧化不起作用的羥基。DMPD.+法在酸性條件下，DMPD可被ABAP、FeCl3、CuCl2、H2O2氧化，生成穩(wěn)定的DMPD.+,它在505nm處有最大吸收峰。根據(jù)加入抗氧化劑后吸光度的變化可測(cè)得樣品清除自由基的能力。Fogliano等人用FeCl3與DMPD反應(yīng)測(cè)定葡萄酒的抗氧化活性。DMPD只溶于水，不能用于疏水性抗氧化劑的測(cè)定。DPPH法DPPH法又可分為動(dòng)力學(xué)法和靜力學(xué)法動(dòng)力學(xué)法測(cè)的是添加完含有供氫能力的樣品后DPPH.減弱的速

17、率，表征的是被測(cè)物的反應(yīng)性，即反應(yīng)的快慢，一般用DPPH.減弱的起始速率表示；靜力學(xué)法測(cè)的是被測(cè)樣品清除DPPH.的量，或DPPH.與某一供氫體反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量關(guān)系或復(fù)雜混合物中活性.OH的量，常以IC50表示。與ABTS法類(lèi)似，被測(cè)物清除DPPH.的產(chǎn)物也能與DPPH.作用，影響測(cè)定結(jié)果SanchezMoreno等人把上述2種方法結(jié)合在一起，以抗氧化效率AE(antioxidantefficiency)表示,AE用參數(shù)1/EC50t50計(jì)算(t50是達(dá)到50%變化時(shí)需要的時(shí)間)。DeBeer等人提出類(lèi)似的參數(shù)：自由基清除效率RSE(radicalscavengingefficiency),RS

18、E由DPPH.減弱的起始速率與EC50的比率計(jì)算。AE和RSE隨試劑濃度的變化而改變，因此重復(fù)性差。Bandoniene和Mukovic將DPPH法與HPLC結(jié)合起來(lái)用于檢測(cè)蘋(píng)果的抗氧化活性。此法與HPLC法一樣，在某一實(shí)驗(yàn)中只能檢測(cè)出一部分酚類(lèi)物質(zhì)(基本上是相對(duì)低分子量的)，不適合測(cè)定聚合酚類(lèi)含量高的物質(zhì)，如紅葡萄酒、紅茶、咖啡和可可等。ABTS.+和DPPH.是測(cè)定抗氧化活性使用最廣的2種人工生成的自由基，但是它們對(duì)抗氧化劑的響應(yīng)以及它們的操作也有幾個(gè)重要的不同：(1)DPPH.不需制備可直接得到，而ABTS.+必須由酶或化學(xué)反應(yīng)生成。(2)ABTS.+可溶于水，也可溶于有機(jī)溶劑，所以既可

19、測(cè)量水溶性化合物也可測(cè)量脂溶性化合物。而DPPH.只能溶于有機(jī)溶劑，特別是乙醇,不溶于水，在評(píng)價(jià)水溶性抗氧化劑的作用時(shí),這是一個(gè)很大的局限。(3)在與供氫體的反應(yīng)上，DPPH.比ABTS.+的選擇性強(qiáng)。例如，DPPH.不能與只含有一個(gè).OH的芳香酸反應(yīng)，也不能與B-環(huán)上沒(méi)有-OH的類(lèi)黃酮反應(yīng)。而ABTS.+可與任何羥基化的芳香族化合物反應(yīng)。6.2.4Fremy自由基和galvinoxyl還原法根據(jù)穩(wěn)定的Fremy自由基（五硫化二鉀）溶于水，合成的過(guò)氧自由基galvinoxyl溶于乙醇，它們能與供氫體反應(yīng)，分別用于測(cè)定茶葉中的水溶性和脂溶性抗氧化劑的活性。自由基濃度用電子自旋共振（ESR）儀測(cè)定

20、，根據(jù)自由基濃度的變化可知抗氧化劑的活性。Galvinoxyl和Fremy自由基選擇性強(qiáng)，只能與供氫能力強(qiáng)的供氫體反應(yīng)；靈敏度高,可在混濁的或顏色深的溶液中進(jìn)行。以抗氧化劑抑制自由基對(duì)底物的氧化降解為基礎(chǔ)的方法此法與6.1.3.2方法不同之處在于測(cè)試體系中既有底物又有自由基，但底物自身不能生成自由基，它與外源自由基反應(yīng)，形成有熒光或帶顏色的特征物質(zhì)，抗氧化劑的加入使生成的特征產(chǎn)物減少，由此可測(cè)得抗氧化活性。ORAC法氧自由基吸收能力法原理如下：天然蛋白質(zhì)伊藻紅蛋白（伊PE）在540nm光波激發(fā)下可發(fā)射565nm的熒光。在有自由基或氧化劑時(shí),-PE的熒光逐漸減弱；當(dāng)有抗氧化劑存在時(shí),8PE的熒光

21、減弱被抑制。自由基或氧化劑可用AAPH（產(chǎn)生過(guò)氧自由基）、H2O2-Cu2+（主要產(chǎn)生HO.）和Cu2+。使用AAPH時(shí)，可測(cè)量所有公認(rèn)的抗氧化劑，如抗壞血酸、舊生育酚、伊胡蘿卜素。使用Cu2+-H2O2時(shí)，可測(cè)量甘露醇、葡萄糖、尿酸以及過(guò)渡金屬螯合劑這類(lèi)物質(zhì)，不用于測(cè)定抗壞血酸、-生育酚。測(cè)定結(jié)果以Trolox（標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑）當(dāng)量表示。此法是一種新的、獨(dú)特的評(píng)價(jià)各種物質(zhì)抗氧化活性的方法。該法優(yōu)于其他類(lèi)似方法的原因有2個(gè)：（1）使用了曲線下面積（AUC）的方法，將抗氧化劑對(duì)自由基作用的抑制時(shí)間和抑制程度結(jié)合成一個(gè)單獨(dú)的量。其他類(lèi)似的方法是在固定抑制率時(shí)使用抑制時(shí)間或在固定的時(shí)間內(nèi)使用抑制率作為

22、定量分析的基礎(chǔ)。（2）此法使用不同的自由基生成劑或氧化劑，這點(diǎn)很重要，因?yàn)榭寡趸钚耘c分析中使用的自由基或氧化劑有關(guān)，而且PE和自由基間的反應(yīng)完全。在ORAC法中，AAPH與抗氧化劑的摩爾比非常高（超過(guò)2000）,使得此法專(zhuān)一性強(qiáng)，測(cè)量的是抗氧化劑直接清除自由基的能力，由于使用熒光技術(shù)，此法也能測(cè)量含有抗氧化劑的稀釋的油乳狀液。此法測(cè)得的是總的抗氧化活性，而且可自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化，但需要全自動(dòng)系列化分析儀。該法最初用于測(cè)定生物體系中的抗氧化劑，后來(lái)廣泛用于天然酚類(lèi)物質(zhì)和食品（如茶葉、蔬菜、水果和草藥提取物）的測(cè)定。TRAP法總自由基清除抗氧化能力法測(cè)量血漿或血清總抗氧化能力最廣的方法。該法中的過(guò)氧

23、自由基由AAPH產(chǎn)生，在向血漿中添加完AAPH后，通過(guò)測(cè)量反應(yīng)過(guò)程中消耗的氧檢測(cè)底物的氧化狀況。在誘導(dǎo)期內(nèi)，氧化被血漿中的抗氧化劑抑制。結(jié)果以血漿的誘導(dǎo)期與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑Trolox的誘導(dǎo)期的比值表示。而Ghiselli等人報(bào)道的TRAP法基本上是Glazer法的復(fù)制。Glazer于1990年發(fā)表的TRAP法用AAPH產(chǎn)生過(guò)氧自由基或用Cu2+-抗壞血酸產(chǎn)生HO.,氧化底物B-或R-PE（藻紅蛋白）。Glazer假定在過(guò)氧自由基或HO.存在時(shí)，PE熒光的減弱與時(shí)間呈線性關(guān)系。由試樣保護(hù)PE防止過(guò)氧自由基或HO.氧化的誘導(dǎo)期與Trolox誘導(dǎo)期的比值定量給出試樣的抗氧化能力。然而，PE熒光淬滅的速

24、度與過(guò)氧自由基或HO.不是線性關(guān)系，而且誘導(dǎo)期一般很難測(cè)定Ghiselli等人的TRAP法和ORAC法使用同樣的測(cè)試體系，不同之處在于動(dòng)力學(xué)曲線以及由動(dòng)力學(xué)曲線計(jì)算出的抗氧化活性。TRAP法中PE熒光的減弱與時(shí)間呈線性關(guān)系（以恒定的速率減弱）,直到滎光減弱80%;而ORAC法中熒光強(qiáng)度的減小隨時(shí)間減慢（不以恒定的速率進(jìn)行）。造成這個(gè)差異最可能的原因是PE的起始濃度不同。TRAP法的抗氧化活性可用圖表法、誘導(dǎo)期計(jì)算；在ORAC法中，抗氧化能力用動(dòng)力學(xué)曲線下的面積計(jì)算。二者都以Trolox當(dāng)量的形式來(lái)表示。DCFH-DA法二氧熒光素二乙酸酯法也是測(cè)定總的自由基清除能力AAPH產(chǎn)生的過(guò)氧自由基氧化D

25、CFH-DA,生成DCF（dichlorofluorescein,二氯熒光黃）。DCF有很強(qiáng)的熒光（Ex480nm,Fm526nm）,在504nm也有吸收，因此可用熒光法或分光光度法檢測(cè)。在此法中，DCF的熒光的形成或吸光度的出現(xiàn)包括4個(gè)階段：第一延滯期（thefirstlagphase）是由于樣品中的抗氧化劑形成的，它們被過(guò)氧自由基消耗完后反應(yīng)進(jìn)行到第一傳播階段（thefirstpropagationphase）;由于在第一傳播階段添加的內(nèi)標(biāo)抗氧化劑Trolox中斷此傳播階段，致使第二延滯期開(kāi)始，相應(yīng)的反應(yīng)隨Trolox的消耗進(jìn)入第二傳播階段。由第一延滯期與第二延滯期的比值可得出樣品的抗氧化

26、能力?；瘜W(xué)發(fā)光法基本原理是活性自由基氧化發(fā)光劑（常用的發(fā)光劑有l(wèi)uminol（魯米諾）、lucigenin（光澤精）等，形成的發(fā)光劑自由基能發(fā)光，發(fā)出的光可由發(fā)光計(jì)檢測(cè)，容易記錄。抗氧化劑是活性自由基清除劑，它能抑制CL,使發(fā)光強(qiáng)度減弱，通常有一個(gè)明確的誘導(dǎo)期（tIND）?？寡趸钚砸訲rolox當(dāng)量的形式給出。由抗氧化劑抑制CL的能力（由tIND估算）與Trolox抑制CL能力的比值可定量得出樣品的抗氧化能力。此法用H2O2或過(guò)硼酸鹽氧化luminol,反應(yīng)由辣根過(guò)氧化物酶（HRP）催化。通常，此反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)射光強(qiáng)度低，易快速消減。通過(guò)向反應(yīng)中添加對(duì)-碘苯酚（增強(qiáng)劑）能極大提高發(fā)射光強(qiáng)度，延

27、長(zhǎng)發(fā)射光時(shí)間并使發(fā)射光穩(wěn)定。發(fā)射光對(duì)抗氧化劑的干擾靈敏，當(dāng)反應(yīng)中添加的所有抗氧化劑被消耗完時(shí)能再恢復(fù)。除上述方法外，產(chǎn)生CL的方法還有多種。CL法操作簡(jiǎn)單、快速，每次操作只要幾分鐘，容易自動(dòng)化。大多數(shù)CL法用于測(cè)定生物樣品，它們也容易應(yīng)用于食品的測(cè)試。-胡蘿卜素漂白法伊胡蘿卜素漂白法是根據(jù)乳狀液中的亞油酸能自動(dòng)氧化，生成的自由基與小胡蘿卜素反應(yīng)，引起小胡蘿卜素的黃色衰減（在470nm處吸光度減小）；在有抗氧化劑存在時(shí),3胡蘿卜素漂白的速率被減緩。該法給出的抗氧化活性是通過(guò)抑制率來(lái)表示的，且測(cè)試體系是在非控制條件下進(jìn)行的（自動(dòng)化），不能得到重復(fù)的數(shù)據(jù)，因此很少用于定量測(cè)定。如果將自動(dòng)氧化改成可以

28、控制的反應(yīng)（如使用自由基引發(fā)劑），此法就可修改成一個(gè)能定量和具有重現(xiàn)性的方法。伊胡蘿卜素漂白法使用的是乳化的脂質(zhì)，而在乳化的脂質(zhì)乳狀液中影響被測(cè)物抗氧化活性的因素增加，很難得到重復(fù)性的結(jié)果。如果不考慮這一點(diǎn)，&胡蘿卡素漂白法是很有價(jià)值的，特別是對(duì)于研究脂溶性抗氧化劑。但是，此法不適合測(cè)定水溶性的化合物。藏花素漂白法用于測(cè)定復(fù)雜混合物和食品的抗氧化能力。藏花素是一種天色化合物（類(lèi)胡蘿卜素的一種），在可見(jiàn)光區(qū)（443nm）有強(qiáng)吸收。在有過(guò)氧自由基（可由AAPH或ABAP熱分解生成）時(shí)，藏花素顏色變淺（被漂白）；添加抗氧化劑后，藏花素的漂白速率減慢。藏花素漂白法是一種動(dòng)力學(xué)方法。對(duì)于單一化合

29、物A,在加入偶氮化合物(提供過(guò)氧自由基)之后，藏花素漂白的速率在大約1min內(nèi)呈線性關(guān)系，記錄沒(méi)有抗氧化劑時(shí)藏花素漂白的速率(V0)與有抗氧化劑存在時(shí)的漂白速率(V),通常記錄10min,二者的比率符合方程V0/V=1+(ka/kc)*(A/C)。其中，A和C分別是被測(cè)抗氧化劑和藏花素的濃度，kc和ka是過(guò)氧自由基分別與藏花素和抗氧化劑反應(yīng)的速率常數(shù)，ka/kc可由A/C對(duì)V0/V的線性回歸方程的斜率計(jì)算，ka/kc表明被測(cè)物與過(guò)氧自由基相互作用的相對(duì)能力，由此可測(cè)得V0/V的值。用Trolox的ka/kc除以被測(cè)抗氧化劑的ka/kc,得到的就是以Trolox當(dāng)量表示的被測(cè)化合物的抗氧化能力。

30、對(duì)于復(fù)雜的抗氧化劑混合物，這種方法測(cè)得的是總的抑制效果。Tubaro等人認(rèn)為，藏花素漂白法提供了一個(gè)更加精確的評(píng)價(jià)抗氧化效果的方法。但該法測(cè)量的是被測(cè)抗氧化劑與另一種抗氧化劑-藏花素對(duì)過(guò)氧化自由基反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)而且分析中使用的藏花素的濃度是固定的(10umol/L),而在分析中使用多個(gè)濃度是必需的。Lyssignoli等人提出一種修改的適合常規(guī)測(cè)試的方法-小平板比色法(microplatebasedcolorimetricassay),這種方法使用的是抑制率而不是動(dòng)力學(xué)方程測(cè)定抗氧化活性。抑制率=(Ac-Aa)/Ac*100,其中，Ac和Aa分別是沒(méi)有抗氧化劑和含有被測(cè)抗氧化劑時(shí)的吸光度。KI法這

31、是一個(gè)自動(dòng)分析法，也是一種測(cè)定清除過(guò)氧自由基活性的方法。該法以PV法的原理為基礎(chǔ)，用AAPH產(chǎn)生的過(guò)氧自由基取代脂質(zhì)過(guò)氧化物，將KI氧化生成碘分子?？寡趸瘎┮种七^(guò)氧自由基引起的氧化，使碘釋放的速率降低。氧化生成的碘的量可通過(guò)自動(dòng)電位滴定儀用硫代硫酸鈉滴定得出。此法簡(jiǎn)單，可用于測(cè)定各種植物提取物和類(lèi)黃酮的抗氧化活性。TOSC法總氧自由基清除能力法一種相當(dāng)新的測(cè)量體外抗氧化活性的方法根據(jù)過(guò)氧自由基、過(guò)氧化氮或.OH將KMBA氧化，生成乙烯（ethylene）,生成的乙烯可用頂空氣相色譜檢測(cè)。在有抗氧化劑存在時(shí),抗氧化劑與KMBA對(duì)過(guò)氧自由基競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，乙烯的形成被部分地抑制。TOSC值可根據(jù)方程TO

32、SC=100*（SSA/CCA*100）來(lái)計(jì)算，SSA和CCA分別是被測(cè)樣品和空白反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線下的積分面積，TOSC值由0-100。此值給出的是某一化合物在特定濃度下的抗氧化能力。抗氧化劑對(duì)過(guò)氧自由基的競(jìng)爭(zhēng)以不同的方式影響KMBA的氧化速率。但是由于使用曲線下面積的方法，TOSC的計(jì)算不受這些變量的影響。TOSC法最初用于研究海洋生物的氧化應(yīng)激，如扇貝、企鵝等，在食品方面使用的很少，而且都只限于用過(guò)氧自由基（由ABAP生成）。TOSC法靈敏度高，可在較低的濃度（umol/L）范圍內(nèi)檢測(cè)；既可用于復(fù)雜生物樣品的測(cè)定，也可用于純抗氧化劑溶液的測(cè)定；既適合測(cè)定水溶性抗氧化劑，也適合檢測(cè)脂溶性抗氧

33、化劑，還能檢測(cè)促氧化劑。此法用一個(gè)普通的氣相色譜體系即可完成，但是由于需要經(jīng)常注射，所以費(fèi)時(shí)，勞動(dòng)強(qiáng)度大，不適合大批量的檢測(cè)。由于添加到測(cè)試體系的抗氧化劑的濃度和體積的不同以及由此需要其他試劑的體積的不同，使得此法的標(biāo)準(zhǔn)化程度低?？寡趸瘎┑倪€原能力FRAP法鐵離子還原抗氧化劑能力法的原理如下：在低pH下，抗氧化劑（還原劑）將Fe3+-TPTZ（tripyridyltriazine,三毗咤三嗪）還原成Fe2+-TPTZ,Fe2+-TPTZ呈藍(lán)色，在593nm處有強(qiáng)吸收，也有在585nm和600nm處測(cè)定的。結(jié)果以Fe2+當(dāng)量或相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑的能力來(lái)表示。此法真正測(cè)量的是被測(cè)物將Fe3+還原成

34、Fe2+的能力。有些抗氧化劑（如抗壞血酸和尿酸）既能還原活性物質(zhì)（如.OH）,也能還原Fe3+,它們還原Fe3+的能力反映了它們的抗氧化能力，但是能還原Fe3+的不都是抗氧化劑。止匕外，能有效還原促氧化劑的抗氧化劑不一定能有效地還原Fe3+,如GSH。FRAP法操作簡(jiǎn)單快速，重復(fù)性好，易于標(biāo)準(zhǔn)化，最初用于測(cè)量血漿的活性，后來(lái)也用于測(cè)定其他生物體液、食品、植物提取物、果汁等的抗氧化活性。但不能用于測(cè)量含有SH-的抗氧化劑循環(huán)伏安法CV主要用于測(cè)定分子之間發(fā)生的電子轉(zhuǎn)移。用CV法評(píng)價(jià)生物體液或組織勻漿液中低分子量抗氧化劑的總還原能力。CV法測(cè)試體系是由工作電極（如玻璃化碳電極）、參比電極（Ag/A

35、gCl）和輔助電極（鉗絲）組成的。工作電極使用的電壓是恒速（100mV/s）的，正電壓用于評(píng)價(jià)還原物質(zhì)，負(fù)電壓評(píng)價(jià)氧化物。將含有被測(cè)物的樣品放入測(cè)試體系中，記錄電壓電流曲線，得出循環(huán)伏安圖，此圖通常是一個(gè)峰形或S形的曲線。電流曲線的形狀和電流的大小是由許多因素決定的，如所使用電壓的形式，電極的大小和結(jié)構(gòu)，電子轉(zhuǎn)移所需能量的大小，電極表面和電活化分子間的相互作用。電流曲線在電壓軸（伏安圖的x軸）的位置可以測(cè)定，也就是峰電流所對(duì)應(yīng)的電壓峰電位Ep（a）或拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的電壓（半波電位，電流增加到一半時(shí)的電壓，E1/2）,峰電位Ep（a）也就是半波電位E1/2。試樣的還原能力由2個(gè)參數(shù)組成：峰電位Ep（a）和陽(yáng)極電流（anodiccurrent,AC）。E1/2與還原劑的類(lèi)型有關(guān)：E1/2越低，被測(cè)化合物提供電子給工作電極的能力就越高。陽(yáng)極電流AC（是由電流曲線與y軸的交點(diǎn)測(cè)得的