第二章 流加發(fā)酵與高密度培養(yǎng)

1、流加發(fā)酵與高密度培養(yǎng)流加發(fā)酵與高密度培養(yǎng)流加發(fā)酵n所謂流加發(fā)酵，即補料分批發(fā)酵(Fed-batch fermentation)，有時又稱半連續(xù)培養(yǎng)或半連續(xù)發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過程中間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基的發(fā)酵方法優(yōu)點缺點分批發(fā)酵1.一般投資較小1.因放罐、滅菌等原因，非生產(chǎn)時間長2.易轉(zhuǎn)產(chǎn)、生產(chǎn)靈活2.經(jīng)常滅菌會降低儀器壽命3.分批操作中某一階段可獲得高的轉(zhuǎn)化率3.前培養(yǎng)和種子的花費大4.發(fā)酵周期短，菌種退化率小4.需較多的操作人員或較多的自動控制系統(tǒng)連續(xù)發(fā)酵1.可實現(xiàn)有規(guī)律的機械、自動化1.操作不靈活2.操作人員少2.因操作條件不易改變，原料質(zhì)量必須穩(wěn)定3.反應(yīng)器體積小、非生產(chǎn)時間少3.

2、若 采 用 連 續(xù) 滅 菌 ， 加 上 控 制 系 統(tǒng) 和 自 動 化設(shè)備，投資較大4.產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定4.必須不斷地排除一些非溶性的固型物5.操作人員接觸毒害物質(zhì)的可能性小5.易染菌，菌種易退化6.測量儀器使用壽命長流加發(fā)酵1.操作靈活1.非生產(chǎn)時間長2.染菌、退化的幾率小2.需較多的操作人員或計算機控制系統(tǒng)3.可獲得高的轉(zhuǎn)化率3.操 作 人 員 接 觸 一 些 病 原 菌 和 有 毒 產(chǎn) 品 的 可能性大4.對發(fā)酵過程可實現(xiàn)優(yōu)化控制5.因經(jīng)常滅菌會降低儀器使用壽命分批、連續(xù)、流加操作方式的比較流加發(fā)酵的研究進展流加發(fā)酵的研究進展n在20世紀70年代以前流加發(fā)酵的理論研究幾乎是個空白，流加過程控

3、制僅僅以經(jīng)驗為主，流加方式也僅僅局限于間歇或恒速流加n1973年日本學(xué)者Yoshida等人首次提出了“Fed-Batch Fermentation”這個術(shù)語，并從理論上建立了第一個數(shù)學(xué)模型，流加發(fā)酵的研究才開始進入理論研究階段流加發(fā)酵所取得的三個方面的重大進展n 20世紀70年代中后期對流加發(fā)酵過程的動力學(xué)解析n 結(jié)合發(fā)酵過程的可測參數(shù)對流加過程進行反饋控制（如DO法、CO2法、RQ(呼吸商)法、pH法、代謝物法、螢光法等）n流加發(fā)酵的最優(yōu)化研究n流加發(fā)酵最優(yōu)化研究的核心問題是找出最佳的底物流加方式，以維持發(fā)酵過程始終處于最佳狀態(tài)n流加發(fā)酵最優(yōu)化的研究內(nèi)容包括： n （1）狀態(tài)方程的建立n （

4、2）目標泛函的確定n （3）最優(yōu)化底物流加方式的求解流加發(fā)酵的物料衡算式可以表達為：XVdtXVd)(FSXVdtSVdF)(XVdtPVd)(FdtdV流加發(fā)酵的最優(yōu)化理論有：格林原理、龐特里金最小值(最大值)原理等在采用流加發(fā)酵技術(shù)之前要考慮的兩個在采用流加發(fā)酵技術(shù)之前要考慮的兩個問題問題一、何時采用流加發(fā)酵方式？一、何時采用流加發(fā)酵方式？二、如何進行底物的流加？二、如何進行底物的流加？一、何時采用流加發(fā)酵方式？一、何時采用流加發(fā)酵方式？ 所用底物在高濃度時對菌體生長有抑制所用底物在高濃度時對菌體生長有抑制作用作用 高菌體濃度培養(yǎng)即高密度培養(yǎng)系統(tǒng)高菌體濃度培養(yǎng)即高密度培養(yǎng)系統(tǒng) 非生長耦聯(lián)性

5、次級代謝產(chǎn)物非生長耦聯(lián)性次級代謝產(chǎn)物( (如產(chǎn)物的合如產(chǎn)物的合成需要某些營養(yǎng)物質(zhì)或前體成需要某些營養(yǎng)物質(zhì)或前體) ) 利用營養(yǎng)突變體的系統(tǒng)利用營養(yǎng)突變體的系統(tǒng)( (過量加入營養(yǎng)物只能使菌體過量加入營養(yǎng)物只能使菌體迅速生長，而目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量會減少。而當營養(yǎng)物嚴重缺乏迅速生長，而目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量會減少。而當營養(yǎng)物嚴重缺乏時，菌體生長受抑制，代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量也會減小時，菌體生長受抑制，代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量也會減小 ) ) 營養(yǎng)缺陷型菌株的培養(yǎng)營養(yǎng)缺陷型菌株的培養(yǎng)二、如何進行流加發(fā)酵操作？二、如何進行流加發(fā)酵操作？1. 流加發(fā)酵類型流加發(fā)酵類型2. 采用流加發(fā)酵應(yīng)該解決的關(guān)鍵問題？采用流加發(fā)酵應(yīng)該解決的

6、關(guān)鍵問題？3.流加發(fā)酵過程中某些重要參數(shù)的確定流加發(fā)酵過程中某些重要參數(shù)的確定4.合適的流加發(fā)酵類型的確定合適的流加發(fā)酵類型的確定5. 流加方式的應(yīng)用流加方式的應(yīng)用1. 流加發(fā)酵類型流加發(fā)酵類型流加發(fā)酵的分類流加發(fā)酵的分類類別類別流流 加加 方方 式式無 反 饋 控?zé)o 反 饋 控制制反饋控制反饋控制恒流量流加、變流量流加和間歇流加恒流量流加、變流量流加和間歇流加直接控制流加、間接控制流加直接控制流加、間接控制流加定值控制流加、程序控制流加、最優(yōu)控制流定值控制流加、程序控制流加、最優(yōu)控制流加加2. 采用流加發(fā)酵應(yīng)該解決的關(guān)鍵問題采用流加發(fā)酵應(yīng)該解決的關(guān)鍵問題(1) 流加什么物質(zhì)？流加什么物質(zhì)？

7、補充微生物能源和碳源，如在發(fā)酵液中添加補充微生物能源和碳源，如在發(fā)酵液中添加葡萄糖、葡萄糖、 飴糖、液化淀粉。作為消泡劑的天然油飴糖、液化淀粉。作為消泡劑的天然油脂，有時也能同時起到補充碳源的作用脂，有時也能同時起到補充碳源的作用 補充菌體所需要的氮源，有機氮或氨水補充菌體所需要的氮源，有機氮或氨水 加入某些微生物生長或合成需要的微量加入某些微生物生長或合成需要的微量元素或無機鹽元素或無機鹽 加入酶合成誘導(dǎo)物或前體物質(zhì)加入酶合成誘導(dǎo)物或前體物質(zhì)(2) 如何流加？如何流加？ a.底物流加速率底物流加速率 b.流加開始時間及總流加時間流加開始時間及總流加時間 c.需控制的底物濃度需控制的底物濃度3

8、. 流加發(fā)酵過程中某些重要參數(shù)的確定流加發(fā)酵過程中某些重要參數(shù)的確定a. 最佳底物濃度的確定最佳底物濃度的確定 (包括菌體生長階段和產(chǎn)物合成階段包括菌體生長階段和產(chǎn)物合成階段)b. 底物的消耗速率底物的消耗速率c. 菌體比生長速率菌體比生長速率( )d. 菌體對底物的產(chǎn)率系數(shù)菌體對底物的產(chǎn)率系數(shù)(Yx/s) 及產(chǎn)物對底物的產(chǎn)率系數(shù)及產(chǎn)物對底物的產(chǎn)率系數(shù)(Yp/s)4. 合適的流加發(fā)酵類型的確定合適的流加發(fā)酵類型的確定 a.恒速流加恒速流加(包括單一速率和分階段恒速流加包括單一速率和分階段恒速流加) b.指數(shù)速率流加指數(shù)速率流加 c.底物在線測定后的反饋流加底物在線測定后的反饋流加 (如葡萄糖反

9、饋流加如葡萄糖反饋流加) d. pH-stat e. DO-stat5. 流加方式的應(yīng)用流加方式的應(yīng)用(1) 恒速流加恒速流加采用恒流速流加培養(yǎng)時，可得到如下的物料平衡方程式：細胞平衡：碳平衡：產(chǎn)物平衡：體積平衡：xVrdtVXd)(0)(FSVrdtVSdspdVPVrdtdVFdt恒流速流加過程中的流量F的確定：(a)預(yù)試驗中所得出的流加時刻菌體對所流加基質(zhì)的消耗速率(b)發(fā)酵液中殘留基質(zhì)濃度(c)流加后需要控制的發(fā)酵液中的基質(zhì)濃度(2) (2) 指數(shù)速率流加指數(shù)速率流加在菌體生長階段采用指數(shù)速率流加法的幾點假設(shè)如下：(a)發(fā)酵罐內(nèi)為理想混合；(b)葡萄糖為唯一限制性碳源；(c)殘留菌體對

10、葡萄糖的產(chǎn)率系數(shù)(YX/s)為常數(shù)；(d)菌體生長遵循Monod方程。對底物葡萄糖進行衡算，則：F為體積流加速率(L/h)，S0為流加液中基質(zhì)濃度(g/L)，Yx/s為菌體對底物的產(chǎn)率系數(shù)(g/g)，ms為細胞比維持系數(shù)(g/g/h)，X為菌體濃度(g/L)，V為培養(yǎng)液體積(L)，為菌體比生長速率(h-1)。VXmYFSdtVSdssx)()(/0XVmYSFdtdVSdtdSVcx)(/0對菌體量的變化進行物料衡算，則：XVdtXVd)(假定為常數(shù)，則上式積分可得：)(FttFFeVXXV 由于生長符合由于生長符合Monod方程方程是是S的函數(shù)，要使的函數(shù)，要使恒定，恒定，S必須必須恒定，則

11、有：恒定，則有：SKSsm0dtdS)(/0)()(1FttFFssxeVXmYSSF 其中tF為開始指數(shù)速率流加的時間， ttF，XF和VF分別為tF時刻的菌體濃度和發(fā)酵液體積指數(shù)速率流加的速率指數(shù)速率流加的速率F的表達式為的表達式為: 指數(shù)速率流加方式在實際過程中的注指數(shù)速率流加方式在實際過程中的注意事項：意事項：(1)方程中各參數(shù)要預(yù)先求知方程中各參數(shù)要預(yù)先求知(2)應(yīng)用時流加速率應(yīng)用時流加速率F可采用階梯遞增方可采用階梯遞增方式進行設(shè)定式進行設(shè)定微生物的高細胞密度培養(yǎng)微生物的高細胞密度培養(yǎng)概述概述n發(fā)酵研究和工業(yè)的一個主要目標是使發(fā)酵研究和工業(yè)的一個主要目標是使體積生產(chǎn)率（體積生產(chǎn)率（

12、g/Lg/Lh h）最大化，即在最大化，即在給定體積中和一定時間內(nèi)獲得盡可能給定體積中和一定時間內(nèi)獲得盡可能多的產(chǎn)品數(shù)量。多的產(chǎn)品數(shù)量。n高細胞密度培養(yǎng)是高生產(chǎn)效率的要求。高細胞密度培養(yǎng)是高生產(chǎn)效率的要求。n歷史上，高細胞密度培養(yǎng)首先建立在歷史上，高細胞密度培養(yǎng)首先建立在酵母上，用以生產(chǎn)單細胞蛋白、乙醇酵母上，用以生產(chǎn)單細胞蛋白、乙醇和菌體。和菌體。n后來，建立起其它的嗜溫菌的高密度培養(yǎng)，生后來，建立起其它的嗜溫菌的高密度培養(yǎng)，生產(chǎn)各種類型產(chǎn)品。產(chǎn)各種類型產(chǎn)品。n甲基營養(yǎng)生物的高密度培養(yǎng)導(dǎo)致了聚羥基烷酸甲基營養(yǎng)生物的高密度培養(yǎng)導(dǎo)致了聚羥基烷酸的高效生產(chǎn)的高效生產(chǎn)。n如今，微生物的高細胞密如今，

13、微生物的高細胞密度培養(yǎng)的范疇已包括度培養(yǎng)的范疇已包括細菌、細菌、古細菌和真核生物（酵母）。古細菌和真核生物（酵母）。概述概述微生物微生物DCW（g/l）細菌細菌 Methylobacterium extorquens233Escherichia coli190180148145Bacillus subtilis184Alcaligenes eutrophus NCIMB 11599184Streptomyces laurentii157Lactococcus lactis141Pseudomonas putida BM01100古細菌古細菌 Marinococcus M52132Sulfolo

14、bus hibatae114真核真核 Candida brassicae268Saccharomyces serevisiae208235Pichia pastoris100HCDC中各種微生物的最大細胞密度中各種微生物的最大細胞密度概述概述n隨著重組隨著重組DNADNA技術(shù)的發(fā)展，利用大腸桿菌或其它微生物技術(shù)的發(fā)展，利用大腸桿菌或其它微生物為宿主表達重組蛋白（如干擾素、白介素等）在分子和為宿主表達重組蛋白（如干擾素、白介素等）在分子和策略上已沒有問題。但為了提高過程的經(jīng)濟性必需開發(fā)策略上已沒有問題。但為了提高過程的經(jīng)濟性必需開發(fā)高效的培養(yǎng)和發(fā)酵技術(shù)。高效的培養(yǎng)和發(fā)酵技術(shù)。 n對大腸桿菌的分子

15、生物學(xué)和生理學(xué)知對大腸桿菌的分子生物學(xué)和生理學(xué)知識的熟識，使得它成為高細胞密度培識的熟識，使得它成為高細胞密度培養(yǎng)的先鋒微生物養(yǎng)的先鋒微生物。 概述概述反應(yīng)器反應(yīng)器生理狀態(tài)生理狀態(tài) 代謝流向代謝流向 能量狀況能量狀況產(chǎn)物產(chǎn)物目的產(chǎn)物目的產(chǎn)物副產(chǎn)物副產(chǎn)物尾氣尾氣細胞細胞條件條件DO溫度溫度pH培養(yǎng)基培養(yǎng)基攪拌攪拌壓力壓力控制控制微生物微生物HCDCHCDC過程示意圖過程示意圖概述概述Markl等計算出，填塞滿長等計算出，填塞滿長3m，直徑直徑1m細胞的培養(yǎng)液中，只有細胞的培養(yǎng)液中，只有25的空間是培養(yǎng)基。的空間是培養(yǎng)基?？紤]到細胞干重是濕重的考慮到細胞干重是濕重的2025%，細胞的，細胞的最大密

16、度應(yīng)該是最大密度應(yīng)該是160200g(DCW)L。 高細胞密度帶來的問題：高細胞密度帶來的問題：1. 底物對生長的限制或抑制底物對生長的限制或抑制2. 產(chǎn)物或代謝副產(chǎn)物的抑制產(chǎn)物或代謝副產(chǎn)物的抑制3. CO2和熱量和熱量4. 粘度增加、混合不充分粘度增加、混合不充分5. 氧的限制氧的限制當細胞濃度超過當細胞濃度超過200g(DCW)L-1時，培養(yǎng)液的粘度迅速增加，在時，培養(yǎng)液的粘度迅速增加，在220g(DCW)L-1幾乎失去流動性。幾乎失去流動性。 概述概述反應(yīng)器反應(yīng)器HCDC的生物反應(yīng)器類型包括：的生物反應(yīng)器類型包括：n具有底物流加裝置的通用式攪拌罐反應(yīng)器具有底物流加裝置的通用式攪拌罐反應(yīng)器

17、n帶有各種內(nèi)置或外置細胞維持裝置的攪拌帶有各種內(nèi)置或外置細胞維持裝置的攪拌罐反應(yīng)器罐反應(yīng)器n膜透析反應(yīng)器膜透析反應(yīng)器n氣升式反應(yīng)器氣升式反應(yīng)器n陶瓷膜搖瓶陶瓷膜搖瓶 透析反應(yīng)器透析反應(yīng)器反應(yīng)器反應(yīng)器HCDCHCDC問題的解決問題的解決 HCDC遇到的主要問題有：遇到的主要問題有：n產(chǎn)物或代謝副產(chǎn)物的積累對生長的抑制產(chǎn)物或代謝副產(chǎn)物的積累對生長的抑制n氧的限制氧的限制nHCDC中培養(yǎng)基粘度不斷增加，引起混合不充分中培養(yǎng)基粘度不斷增加，引起混合不充分nCO2和熱量的高釋放率和熱量的高釋放率下面以大腸桿菌為例，來探討如何解決下面以大腸桿菌為例，來探討如何解決HCDCHCDC中中的問題。的問題。大腸桿

18、菌大腸桿菌HCDC中乙酸的形成中乙酸的形成n乙酸是大腸桿菌流入中心代謝途徑的碳超過生物合成乙酸是大腸桿菌流入中心代謝途徑的碳超過生物合成的需要和產(chǎn)生能量超過細胞的容量時產(chǎn)生的。的需要和產(chǎn)生能量超過細胞的容量時產(chǎn)生的。n高濃度的乙酸（如高濃度的乙酸（如pH7，超過，超過5gL-1）會降低會降低HCDCHCDC的生的生長速率、生物量和可獲得的最大細胞密度。長速率、生物量和可獲得的最大細胞密度。n乙酸毒害作用的機理還未被闡明。乙酸毒害作用的機理還未被闡明。很有可能是因為抑很有可能是因為抑制制DNADNA、RNARNA、蛋白質(zhì)和脂肪的合成。蛋白質(zhì)和脂肪的合成。HCDCHCDC遇到的問題遇到的問題n控制

19、比生長速率在產(chǎn)生乙酸的臨界值以下控制比生長速率在產(chǎn)生乙酸的臨界值以下 一般可通過控制限制性底物濃度控制比生長速率。一般可通過控制限制性底物濃度控制比生長速率。 比生長速率臨界值：比生長速率臨界值： 在復(fù)合和半合成培養(yǎng)基中，約為為在復(fù)合和半合成培養(yǎng)基中，約為為0.2h-1和和0.35h-1； 在合成培養(yǎng)基中，為在合成培養(yǎng)基中，為0.14h-1。 HCDCHCDC遇到的問題遇到的問題減少乙酸合成的方法減少乙酸合成的方法n選擇合適的培養(yǎng)基選擇合適的培養(yǎng)基 例如，甘油比葡萄糖吸收進入細胞的速度要慢，可例如，甘油比葡萄糖吸收進入細胞的速度要慢，可能會減少流入糖酵解途徑的碳，這會極大的減少乙能會減少流入糖

20、酵解途徑的碳，這會極大的減少乙酸的合成。酸的合成。HCDCHCDC遇到的問題遇到的問題此外，加入某些氨基酸（如谷氨酸、甲硫氨酸），此外，加入某些氨基酸（如谷氨酸、甲硫氨酸），可減輕乙酸的毒害作用?？蓽p輕乙酸的毒害作用。使用酸和堿調(diào)節(jié)使用酸和堿調(diào)節(jié)pHpH而積累下來的鹽會使乙酸的毒害而積累下來的鹽會使乙酸的毒害作用加強。作用加強。大腸桿菌大腸桿菌葡萄糖葡萄糖PtaAckAck乙酸乙酸去往其它產(chǎn)物去往其它產(chǎn)物（乙醇、乙醛等）（乙醇、乙醛等）TCA循環(huán)中循環(huán)中過剩的碳過剩的碳乙酸代謝過程示意圖乙酸代謝過程示意圖磷酸轉(zhuǎn)移磷酸轉(zhuǎn)移酶體系酶體系修飾修飾截斷截斷加強加強n代謝工程的方法減少乙酸合成代謝工程的

21、方法減少乙酸合成CoA氧的限制氧的限制n氧經(jīng)常是高細胞密度培養(yǎng)的限制因素。氧經(jīng)常是高細胞密度培養(yǎng)的限制因素。n因為氧的溶解度很低。因為氧的溶解度很低。2525、1 1大氣壓下，水中飽大氣壓下，水中飽和溶解氧濃度為和溶解氧濃度為7 7mgLmgL-1-1。 HCDCHCDC遇到的問題遇到的問題 提高溶氧的方法有：提高溶氧的方法有：n提高通氣速率和攪拌速度提高通氣速率和攪拌速度 n富氧空氣和純氧富氧空氣和純氧n在加壓環(huán)境下培養(yǎng)在加壓環(huán)境下培養(yǎng)混合的限制混合的限制nHCDCHCDC的另一個物理限制。的另一個物理限制。n發(fā)酵罐體積越大問題越明顯。發(fā)酵罐體積越大問題越明顯。n靠近進料口部分的細胞暴露在高

22、濃度營養(yǎng)物中?？拷M料口部分的細胞暴露在高濃度營養(yǎng)物中。n而其它位置的細胞則處于饑餓狀態(tài)。而其它位置的細胞則處于饑餓狀態(tài)。HCDCHCDC遇到的問題遇到的問題有必要研究發(fā)酵罐中的攪拌模型，找到改善攪拌的方法。有必要研究發(fā)酵罐中的攪拌模型，找到改善攪拌的方法。二氧化碳和放熱的影響二氧化碳和放熱的影響nHCDCHCDC中高細胞密度培養(yǎng)中的二氧化碳會影響細胞的生長。中高細胞密度培養(yǎng)中的二氧化碳會影響細胞的生長。高高COCO2 2分壓（分壓（0.30.3atmatm）會降低生長速率并刺激乙酸的生成。會降低生長速率并刺激乙酸的生成。n放熱也是高細胞密度培養(yǎng)的一個問題。放熱也是高細胞密度培養(yǎng)的一個問題。這

23、些問題可通過降低細胞比生長速率而部分的解決。這些問題可通過降低細胞比生長速率而部分的解決。熱量的主要來源是攪拌產(chǎn)生的機械熱和細胞代謝產(chǎn)生的熱量。熱量的主要來源是攪拌產(chǎn)生的機械熱和細胞代謝產(chǎn)生的熱量。HCDCHCDC遇到的問題遇到的問題溫度的影響溫度的影響n把培養(yǎng)溫度從把培養(yǎng)溫度從37降到降到2630，會降低營養(yǎng)吸收和，會降低營養(yǎng)吸收和生長速度，因此會減少有毒副產(chǎn)物和代謝產(chǎn)生的熱量。生長速度，因此會減少有毒副產(chǎn)物和代謝產(chǎn)生的熱量。n降低溫度也能減少細胞對氧的需求。降低溫度也能減少細胞對氧的需求。n降低重組細胞溫度也有可能減少包含體形式的蛋白質(zhì)降低重組細胞溫度也有可能減少包含體形式的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。

24、的產(chǎn)生。以上這些優(yōu)點說服了許多研究者使用低溫，對大腸桿菌以上這些優(yōu)點說服了許多研究者使用低溫，對大腸桿菌進行高細胞密度培養(yǎng)進行高細胞密度培養(yǎng)。HCDCHCDC遇到的問題遇到的問題流加控制策略流加控制策略有兩種主要的營養(yǎng)流加控制策略：有兩種主要的營養(yǎng)流加控制策略：n開環(huán)（無反饋）控制開環(huán)（無反饋）控制n閉環(huán)（反饋閉環(huán)（反饋）控制）控制n補料方式是高細胞密度培養(yǎng)取得成功的關(guān)鍵因素。補料方式是高細胞密度培養(yǎng)取得成功的關(guān)鍵因素。n它不僅影響最大可獲得細胞的濃度，而且影響細胞的產(chǎn)率。它不僅影響最大可獲得細胞的濃度，而且影響細胞的產(chǎn)率。n產(chǎn)物形成會受各種補料策略的影響。產(chǎn)物形成會受各種補料策略的影響。n高

25、細胞密度培養(yǎng)通常在營養(yǎng)（碳）限制的條件下進行。高細胞密度培養(yǎng)通常在營養(yǎng)（碳）限制的條件下進行。條件條件預(yù)設(shè)參數(shù)預(yù)設(shè)參數(shù)開環(huán)（無反饋）控制開環(huán)（無反饋）控制流加控制策略流加控制策略DO溫度溫度pH培養(yǎng)基培養(yǎng)基攪拌攪拌壓力壓力流加流加控制控制無反饋控制的流加策略無反饋控制的流加策略n恒速流加恒速流加以預(yù)先決定的（恒定的）速率流加營養(yǎng)物質(zhì)，比生長速率逐漸降低。n加速流加加速流加以逐漸增加的速率流加營養(yǎng)物質(zhì)。可補償一些比生長速率的降低。n指數(shù)流加指數(shù)流加以指數(shù)的速率流加營養(yǎng)物質(zhì)?？傻玫胶愣ǖ谋壬L速率。 流加控制策略流加控制策略條件條件閉環(huán)（反饋）控制閉環(huán)（反饋）控制即時即時DO即時即時pHCER細胞濃度細胞濃度碳源濃度碳源濃度反饋控制反饋控制流加控制策略流加控制策略DO溫度溫度pH培養(yǎng)基培養(yǎng)基攪拌攪拌壓力壓力流加流加控制控制間接反饋控制間接反饋控制n即時即時DO當DO降低時補加營養(yǎng)物質(zhì)。n即時即時pH主要碳源耗盡引起pH上升時補加營養(yǎng)物質(zhì)。n二氧化碳釋放率（二氧化碳釋放率（CER）CER基本正比于碳源的消耗速度。這一方法最為經(jīng)常用