微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)經(jīng)典版

1、微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)經(jīng)典版: 結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡(jiǎn)單，個(gè)體多數(shù)十分微小，通結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡(jiǎn)單，個(gè)體多數(shù)十分微小，通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)。的甚至沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)。2 2、類(lèi)群、類(lèi)群1 1、特點(diǎn)、特點(diǎn)病毒（無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、寄生生活）病毒（無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、寄生生活）細(xì)菌細(xì)菌 電子顯微鏡下的結(jié)核桿菌電子顯微鏡下的結(jié)核桿菌 放線(xiàn)菌放線(xiàn)菌真菌真菌青霉菌青霉菌酵母菌酵母菌原生生物原生生物l微生物微生物: :1.特點(diǎn)：特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡(jiǎn)單, ,個(gè)體多數(shù)十分微小個(gè)體多數(shù)十分微小. .通通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有常要用光學(xué)顯微鏡或電

2、子顯微鏡才能看到，有的甚至沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的甚至沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu). .病病 毒毒細(xì)細(xì) 菌菌放線(xiàn)菌放線(xiàn)菌真真 菌菌原生生物原生生物2.微生物的類(lèi)群微生物的類(lèi)群無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞到目前為止，幾十項(xiàng)到目前為止，幾十項(xiàng)NobelNobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，化學(xué)獎(jiǎng)都與微生物學(xué)有關(guān)化學(xué)獎(jiǎng)都與微生物學(xué)有關(guān)l微生物的分離和純培養(yǎng)技術(shù)是微生物微生物的分離和純培養(yǎng)技術(shù)是微生物最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，它包括培養(yǎng)基的最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，它包括培養(yǎng)基的制備、滅菌和消毒、接種、培養(yǎng)等步制備、滅菌和消毒、接種、培養(yǎng)等步驟驟內(nèi)容提要：內(nèi)容提要：微生物及其分類(lèi)微生物及其分類(lèi)培養(yǎng)基與各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)培

3、養(yǎng)基與各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)菌技術(shù)無(wú)菌技術(shù)菌落菌落大腸桿菌的純化培養(yǎng)大腸桿菌的純化培養(yǎng)微生物數(shù)量的測(cè)定微生物數(shù)量的測(cè)定1、概念：人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的、概念：人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。質(zhì)。按物理狀態(tài)不同劃分按物理狀態(tài)不同劃分固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)，瓊脂含量一般為，瓊脂含量一般為1.5%-2.0%1.5%-2.0%瓊脂含量一般為瓊脂含量一般為0.2%-0.7%0.2%-0.7%不加任何凝固劑不加任何凝固劑半固體培

4、養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基常用來(lái)進(jìn)行微生物的分離、鑒定固體培養(yǎng)基常用來(lái)進(jìn)行微生物的分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)及菌種保藏、活菌計(jì)數(shù)及菌種保藏 觀察微生物的運(yùn)動(dòng)特征、分類(lèi)鑒定及噬菌觀察微生物的運(yùn)動(dòng)特征、分類(lèi)鑒定及噬菌體效價(jià)滴定體效價(jià)滴定 大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)及在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)及在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用方面的研究基礎(chǔ)理論和應(yīng)用方面的研究 2 2、分類(lèi)、分類(lèi)按用途不同劃分按用途不同劃分基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基含有一般微生物生長(zhǎng)繁殖所需的基本營(yíng)養(yǎng)含有一般微生物生長(zhǎng)繁殖所需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）物質(zhì)的培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）用來(lái)將某種或某類(lèi)微生物從

5、混雜的微生物群體中分用來(lái)將某種或某類(lèi)微生物從混雜的微生物群體中分離出來(lái)的培養(yǎng)基離出來(lái)的培養(yǎng)基用于鑒別不同類(lèi)型微生物的培養(yǎng)基用于鑒別不同類(lèi)型微生物的培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基微生物產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，與培養(yǎng)基中的特殊化微生物產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征變學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征變化化在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)，抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，有利于所需微生物的抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，有利于所需微生物的生長(zhǎng)生長(zhǎng)2 2、分類(lèi)、分類(lèi)選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基應(yīng)用應(yīng)用加入青霉素加入青霉素加入高

6、濃度食鹽加入高濃度食鹽不加氮源不加氮源不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基養(yǎng)基加入青霉素等抗生素加入青霉素等抗生素延伸：延伸：分離酵母菌、霉菌等真菌分離酵母菌、霉菌等真菌分離金黃色葡萄球菌分離金黃色葡萄球菌分離固氮菌分離固氮菌分離自養(yǎng)型微生物分離自養(yǎng)型微生物分離導(dǎo)入了目的基因的分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞受體細(xì)胞鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基:l加入伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（加入伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMS培養(yǎng)基）培養(yǎng)基）l鑒別大腸桿菌鑒別大腸桿菌l現(xiàn)象：藍(lán)紫色金屬光澤現(xiàn)象：藍(lán)紫色金屬光澤按成分不同劃分按成分不同劃分天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基化學(xué)成分不恒定的天然有機(jī)物化學(xué)成分不恒定的天

7、然有機(jī)物牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基。用于工業(yè)生產(chǎn)麥芽汁培養(yǎng)基。用于工業(yè)生產(chǎn)化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基成的培養(yǎng)基高氏高氏1 1號(hào)培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基。號(hào)培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基。用于分類(lèi)和鑒定用于分類(lèi)和鑒定2 2、分類(lèi)、分類(lèi)一一. .培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：3.3.基本營(yíng)養(yǎng)：基本營(yíng)養(yǎng)： 碳源、氮源、水、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子（能源）碳源、氮源、水、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子（能源）碳源碳源無(wú)機(jī)碳源：無(wú)機(jī)碳源：有機(jī)碳源：有機(jī)碳源：COCO2 2、COCO3 32 2- -、HCOHCO3 3- -牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物異養(yǎng)微

8、生物氮源氮源無(wú)機(jī)氮源：無(wú)機(jī)氮源：有機(jī)氮源：有機(jī)氮源：NHNH4 4、NONO3 3- -牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含注：含CHONCHON的有機(jī)物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源的有機(jī)物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源（3 3）能源）能源一一. .培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：（4 4） （牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量有機(jī)物微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量有機(jī)物 如：維生素、氨基酸、堿基等如：維生素、氨基酸、堿基等 生長(zhǎng)因子：生長(zhǎng)因子： 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基應(yīng)用最廣泛和

9、最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基組分培養(yǎng)基組分作用瓊脂瓊脂 20g 20g 牛肉膏牛肉膏 5g5g蛋白胨蛋白胨 10g10gNaCl 5gNaCl 5gH H2 2O O 定容至定容至1000ml1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方凝固劑凝固劑提供碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子提供碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子碳源、氮源、生長(zhǎng)因子、能源碳源、氮源、生長(zhǎng)因子、能源無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽水、溶劑水、溶劑4.培養(yǎng)基要滿(mǎn)足微生物對(duì)環(huán)境條件的需求培養(yǎng)基要滿(mǎn)足微生物對(duì)環(huán)境條件的需求 ：真菌真菌 微酸性（）微酸性（）細(xì)菌細(xì)菌 中性（）中性（）放線(xiàn)菌放線(xiàn)菌 微堿性（）微堿性（）大多數(shù)微生物適

10、宜生長(zhǎng)的溫度在大多數(shù)微生物適宜生長(zhǎng)的溫度在25-4025-40之間之間厭氧菌需提供無(wú)氧條件厭氧菌需提供無(wú)氧條件pH：溫度：溫度：氧氣：氧氣：（1 1）滅菌：）滅菌：使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。所有的微生物，包括芽孢和孢子。二二. .無(wú)菌技術(shù)：無(wú)菌技術(shù)：泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，防止外來(lái)雜菌的泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，防止外來(lái)雜菌的污染的方法污染的方法灼燒灼燒滅菌滅菌干熱滅菌箱干熱滅菌箱高壓蒸汽滅菌鍋高壓蒸汽滅菌鍋（2 2）消毒：）消毒：使用較為溫和的物理或化學(xué)方法殺死使用較為溫和的物理或化學(xué)方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物（不包括

11、芽物體表面或內(nèi)部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）孢和孢子）煮沸消毒法：煮沸消毒法：100 5-6min巴氏消毒法：巴氏消毒法：70-75 30min或或80 15min化學(xué)藥劑消毒法：酒精、氯氣化學(xué)藥劑消毒法：酒精、氯氣紫外線(xiàn)消毒：實(shí)驗(yàn)前紫外線(xiàn)消毒：實(shí)驗(yàn)前30min煮沸煮沸消毒消毒法法巴氏消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥劑（化學(xué)藥劑（70%酒精等）酒精等）紫外線(xiàn)紫外線(xiàn)針對(duì)不耐高溫的液體針對(duì)不耐高溫的液體接種室、超凈工作臺(tái)接種室、超凈工作臺(tái)能耐高溫的，需要保持干燥的物品能耐高溫的，需要保持干燥的物品灼燒法灼燒法干熱滅菌干熱滅菌高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌接種工具（接種環(huán)等）接種工具（接種環(huán)等）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手

12、實(shí)驗(yàn)操作者的雙手培養(yǎng)皿等玻璃器皿培養(yǎng)皿等玻璃器皿培養(yǎng)基培養(yǎng)基消毒方法消毒方法滅菌方法滅菌方法實(shí)驗(yàn)操作者的衣服實(shí)驗(yàn)操作者的衣服單個(gè)單個(gè)或少數(shù)菌體或少數(shù)菌體2.2.特征特征：大小、形狀、光澤度、大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。顏色、透明度等。3.3.功能：功能：1.1.定義：定義：三三. .菌落菌落鑒定菌種的重要依據(jù)鑒定菌種的重要依據(jù)固體培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)基上大量繁殖大量繁殖子細(xì)胞群體子細(xì)胞群體四、大腸桿菌的分離和純培養(yǎng)四、大腸桿菌的分離和純培養(yǎng)分散成單個(gè)細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞, ,形成單個(gè)菌落形成單個(gè)菌落1 1、制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基、制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（大腸桿菌分離和純培養(yǎng)）（大腸桿

13、菌分離和純培養(yǎng)）計(jì)算、稱(chēng)量（配制固體培養(yǎng)基要加入瓊脂）計(jì)算、稱(chēng)量（配制固體培養(yǎng)基要加入瓊脂）溶化溶化調(diào)調(diào)pH(pH(注意：滅菌前調(diào)注意：滅菌前調(diào)PH)PH)分裝、包扎分裝、包扎滅菌（高壓蒸汽滅菌）滅菌（高壓蒸汽滅菌）倒平板倒平板倒平板技術(shù)倒平板技術(shù)1234使瓶口迅速使瓶口迅速通過(guò)火焰通過(guò)火焰在火焰旁打開(kāi)在火焰旁打開(kāi)錐形瓶錐形瓶打開(kāi)一條稍大于打開(kāi)一條稍大于瓶口的縫隙，向培養(yǎng)皿中倒瓶口的縫隙，向培養(yǎng)皿中倒入入 約約10-20ml倒入培養(yǎng)皿，倒入培養(yǎng)皿，立即蓋上皿蓋。立即蓋上皿蓋。等待平板冷卻凝固等待平板冷卻凝固后倒置后倒置 1. 1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 50 左左

14、右時(shí)，才能用來(lái)倒平板。你用什么辦法來(lái)右時(shí)，才能用來(lái)倒平板。你用什么辦法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？ 可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺(jué)錐形瓶的溫度下降到剛剛不瓶，感覺(jué)錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。 2.2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？焰？ 通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。生物污染培養(yǎng)基。3.3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，為什么要將平板倒置？ 平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的

15、濕度也珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。造成污染。 4.4.在倒平板的過(guò)程中，如果不小心在倒平板的過(guò)程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為什這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為什么？么？ 空氣中的微生物可能在皿蓋與皿空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。要用這個(gè)

16、平板培養(yǎng)微生物。四四. .大腸桿菌的純化培養(yǎng)：大腸桿菌的純化培養(yǎng)：平板劃線(xiàn)法：平板劃線(xiàn)法：2.2.接種：接種：交叉劃線(xiàn)法交叉劃線(xiàn)法連續(xù)劃線(xiàn)法連續(xù)劃線(xiàn)法將接種環(huán)放在火焰上將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)灼燒，直到接種環(huán)_在在_旁冷卻旁冷卻接種環(huán)，并打開(kāi)棉接種環(huán)，并打開(kāi)棉塞塞 將試管口通過(guò)火焰將試管口通過(guò)火焰 .將已將已_的接種環(huán)伸入菌的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液液中蘸取一環(huán)菌液 左手將皿蓋打開(kāi)一條縫隙，右手將沾左手將皿蓋打開(kāi)一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃劃_條平行線(xiàn)，蓋上皿蓋。注條平行線(xiàn)，蓋上皿蓋。注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。.將試

17、管通過(guò)火焰，將試管通過(guò)火焰，并塞上棉塞并塞上棉塞 火焰火焰冷卻冷卻三至五三至五灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線(xiàn)的一區(qū)域劃線(xiàn)的_開(kāi)始往第開(kāi)始往第二區(qū)域內(nèi)劃線(xiàn)。重復(fù)以上操作，二區(qū)域內(nèi)劃線(xiàn)。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線(xiàn)。注意在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線(xiàn)。注意不要將最后一區(qū)的劃線(xiàn)與第一區(qū)不要將最后一區(qū)的劃線(xiàn)與第一區(qū)相連。相連。末端末端燒紅燒紅將平板將平板_放入放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 倒置倒置為什么在操作的第一步以及每次劃線(xiàn)之前都要灼燒接為什么在操作的第一步以及每次劃線(xiàn)之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線(xiàn)操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為種環(huán)？在劃線(xiàn)操作結(jié)束時(shí)，仍然

18、需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？什么？操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物在的微生物污染培養(yǎng)物殺死上次殘留的菌種，保證使下一次劃線(xiàn)時(shí)，菌種直殺死上次殘留的菌種，保證使下一次劃線(xiàn)時(shí)，菌種直接來(lái)源于上次劃線(xiàn)的末端，從而通過(guò)劃線(xiàn)次數(shù)的增加接來(lái)源于上次劃線(xiàn)的末端，從而通過(guò)劃線(xiàn)次數(shù)的增加，使每次劃線(xiàn)時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落，使每次劃線(xiàn)時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。感染操作者。6 6支試管，分別加入支試管，分別加入9m

19、l9ml無(wú)菌水無(wú)菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106稀釋涂布平板法：稀釋涂布平板法：a.a.梯度稀釋菌液：梯度稀釋菌液：菌液菌液b.涂布平坂l(xiāng)取取0.1ml菌懸液菌懸液微量微量 移液器移液器 將接種后的培養(yǎng)基和一個(gè)未接種的培養(yǎng)基，放入將接種后的培養(yǎng)基和一個(gè)未接種的培養(yǎng)基，放入3737恒溫箱中倒置培養(yǎng)恒溫箱中倒置培養(yǎng)12h-24h,12h-24h,直到長(zhǎng)出菌落為止。直到長(zhǎng)出菌落為止。3 3、培養(yǎng)、培養(yǎng)Pour plate(3).稀釋倒平板法稀釋倒平板法四四. .大腸桿菌的純化培養(yǎng)：大腸桿菌的純化培養(yǎng)：1.1.制備培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基2.2.接種：接種：3.3.

20、培養(yǎng)：培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)基和一個(gè)未接種的培養(yǎng)基將接種后的培養(yǎng)基和一個(gè)未接種的培養(yǎng)基放入放入3737恒溫箱中培養(yǎng)恒溫箱中培養(yǎng)12h12h24h24h后，后，觀察并記錄觀察并記錄4 4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察、實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察5 5、菌株的保存方法、菌株的保存方法固體斜面培養(yǎng)基固體斜面培養(yǎng)基甘油管藏甘油管藏臨時(shí)保存：臨時(shí)保存：長(zhǎng)期保存：長(zhǎng)期保存：擱置斜面擱置斜面微生物數(shù)量的計(jì)算直接計(jì)數(shù)法直接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法（一）直接計(jì)數(shù)法（一）直接計(jì)數(shù)法 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法顯微鏡直接計(jì)數(shù)法 將待測(cè)樣品制成懸液，然后取一定量的懸液放在顯微將待測(cè)樣品制成懸液，然后取一定量的懸液放在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)在顯微鏡下觀察到的

21、微生物數(shù)目來(lái)計(jì)鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來(lái)計(jì)算出體積內(nèi)的微生物總數(shù)。一般適用于純培養(yǎng)懸浮液中單算出體積內(nèi)的微生物總數(shù)。一般適用于純培養(yǎng)懸浮液中單細(xì)胞菌體的計(jì)數(shù)。細(xì)胞菌體的計(jì)數(shù)。v優(yōu)點(diǎn)：直觀、快速、操作簡(jiǎn)單優(yōu)點(diǎn)：直觀、快速、操作簡(jiǎn)單v缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌，所得為總數(shù)，結(jié)果往往偏高不能區(qū)分死菌與活菌，所得為總數(shù)，結(jié)果往往偏高不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察1 1、血球計(jì)數(shù)板、血球計(jì)數(shù)板 計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚玻璃計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚玻璃片，玻片上有四個(gè)槽構(gòu)成三

22、個(gè)平片，玻片上有四個(gè)槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)，中央平臺(tái)又由一短槽隔成兩臺(tái)，中央平臺(tái)又由一短槽隔成兩半，其上各刻有一小方格網(wǎng)。半，其上各刻有一小方格網(wǎng)。 每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)大格每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)大格，中央的一大格作為計(jì)數(shù)用，中央的一大格作為計(jì)數(shù)用，稱(chēng)為計(jì)數(shù)室。稱(chēng)為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室體積為計(jì)數(shù)室體積為l l0.10.10.1mm0.1mm3 3。( (注意：注意：1 ml 1 ml 1000 mm1000 mm3 3 ) )*#血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室有兩種刻度血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室有兩種刻度1大格大格=16中格中格2516=400小格小格1大格大格=25中格中格16 25 =400小格小格1 1、稀釋、稀釋 用無(wú)菌生理鹽水

23、將待測(cè)菌稀釋成適當(dāng)濃度的菌懸液。用無(wú)菌生理鹽水將待測(cè)菌稀釋成適當(dāng)濃度的菌懸液。2 2、鏡檢計(jì)數(shù)室、鏡檢計(jì)數(shù)室 加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢，若有污物，則用自來(lái)水沖洗，加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢，若有污物，則用自來(lái)水沖洗，95%95%乙醇棉球輕輕乙醇棉球輕輕擦洗，然后用吸水紙吸干或電吹風(fēng)吹干。擦洗，然后用吸水紙吸干或電吹風(fēng)吹干。3 3、加樣、加樣 取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊，蓋上蓋玻片。將菌懸液搖勻，用無(wú)菌滴管吸取少許，沿蓋玻片邊取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊，蓋上蓋玻片。將菌懸液搖勻，用無(wú)菌滴管吸取少許，沿蓋玻片邊緣滴入一小滴，讓菌液利用液體的表面張力充滿(mǎn)計(jì)數(shù)區(qū)，靜置緣滴入一小滴，讓菌液利用

24、液體的表面張力充滿(mǎn)計(jì)數(shù)區(qū)，靜置5min5min。 注：取樣時(shí)先要搖勻菌液，加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生注：取樣時(shí)先要搖勻菌液，加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生2、操作步驟4 4、顯微鏡計(jì)數(shù)（以、顯微鏡計(jì)數(shù)（以1616小格小格 2525中格的中格的 規(guī)格為例）規(guī)格為例） 在高倍下在高倍下(40X)(40X)計(jì)數(shù)對(duì)兩個(gè)計(jì)數(shù)室記數(shù)，方法：每個(gè)計(jì)數(shù)室選計(jì)數(shù)對(duì)兩個(gè)計(jì)數(shù)室記數(shù)，方法：每個(gè)計(jì)數(shù)室選5 5個(gè)中格個(gè)中格(4(4個(gè)角和中央的一個(gè)中格個(gè)角和中央的一個(gè)中格) )中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)，求得每個(gè)中方格的平均值，再乘中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)，求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上上2525即為大方格中的總菌數(shù)，最后換算成即為大方格中的

25、總菌數(shù)，最后換算成1ml1ml菌液中的總菌數(shù)。菌液中的總菌數(shù)。 注：依照注：依照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右“的原則進(jìn)行計(jì)數(shù)的原則進(jìn)行計(jì)數(shù) 計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)不時(shí)調(diào)節(jié)焦距，才能觀察到不同深度的菌體計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)不時(shí)調(diào)節(jié)焦距，才能觀察到不同深度的菌體 一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5 51010個(gè)菌體為宜個(gè)菌體為宜 計(jì)數(shù)的結(jié)果是兩個(gè)計(jì)數(shù)室所記菌數(shù)的平均值計(jì)數(shù)的結(jié)果是兩個(gè)計(jì)數(shù)室所記菌數(shù)的平均值5 5、清洗血球計(jì)數(shù)板、清洗血球計(jì)數(shù)板 計(jì)數(shù)完畢，將血球計(jì)數(shù)板在水龍頭下流水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，計(jì)數(shù)完畢，將血球計(jì)數(shù)板在水龍頭下流水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后電吹風(fēng)

26、吹干，鏡檢確認(rèn)計(jì)數(shù)區(qū)無(wú)殘留菌體或其它沉淀。若不干凈，洗完后電吹風(fēng)吹干，鏡檢確認(rèn)計(jì)數(shù)區(qū)無(wú)殘留菌體或其它沉淀。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。3、計(jì)數(shù)方法v所統(tǒng)計(jì)的所統(tǒng)計(jì)的5 5個(gè)中格的總菌數(shù)個(gè)中格的總菌數(shù)A A，菌液的稀釋倍數(shù)為，菌液的稀釋倍數(shù)為B B，則，則1ml1ml菌液含有的菌數(shù)為：菌液含有的菌數(shù)為： 1大格子大格子=25中格中格（二）間接計(jì)數(shù)法（二）間接計(jì)數(shù)法 稀釋平板計(jì)數(shù)法稀釋平板計(jì)數(shù)法 將待測(cè)樣品按比例做一系列稀釋后，將其中的微生物充分分散將待測(cè)樣品按比例做一系列稀釋后，將其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定稀釋度、一定量的稀釋樣液接種到平板上，使成單

27、個(gè)細(xì)胞，取一定稀釋度、一定量的稀釋樣液接種到平板上，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)；或是將一定量的稀釋液，與溶化其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)；或是將一定量的稀釋液，與溶化后冷卻至后冷卻至4545左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，傾入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，搖勻、靜置待左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，傾入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，搖勻、靜置待凝。凝。 經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，由單個(gè)微生物生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見(jiàn)的菌落，即經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，由單個(gè)微生物生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見(jiàn)的菌落，即一個(gè)菌落代表樣品中的一個(gè)微生物個(gè)體。統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)基中的出現(xiàn)的菌一個(gè)菌落代表樣品中的一個(gè)微生物個(gè)體。統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)基中的出現(xiàn)的菌落，即可推算出樣品中的活菌數(shù)。落，即可推算出樣品中的活菌數(shù)。l能檢測(cè)活菌數(shù)和雜菌數(shù)能檢測(cè)活菌數(shù)和雜