設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)—細(xì)胞融合與紅細(xì)胞膜滲透性觀察

1、細(xì)胞融合與紅細(xì)胞膜滲透性觀察細(xì)胞融合與紅細(xì)胞膜滲透性觀察一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理 1. 細(xì)胞融合（細(xì)胞融合（cell fusion）又稱細(xì)胞雜交（）又稱細(xì)胞雜交（cell hybridization），是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞融合成一個(gè)），是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞的現(xiàn)象。細(xì)胞融合術(shù)是細(xì)胞遺傳學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)、病細(xì)胞的現(xiàn)象。細(xì)胞融合術(shù)是細(xì)胞遺傳學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)、病毒學(xué)、腫瘤學(xué)等研究的一重要手段，也是制備單克隆細(xì)胞毒學(xué)、腫瘤學(xué)等研究的一重要手段，也是制備單克隆細(xì)胞株的重要技術(shù)。株的重要技術(shù)。 2.在誘導(dǎo)物（如仙臺(tái)病毒，聚乙二醇）作用下，相互融在誘導(dǎo)物（如仙臺(tái)病毒，聚乙二醇）作用下，相互融

2、合的細(xì)胞發(fā)生凝集，隨后在質(zhì)膜接觸處發(fā)生質(zhì)膜成份的一合的細(xì)胞發(fā)生凝集，隨后在質(zhì)膜接觸處發(fā)生質(zhì)膜成份的一系列變化，主要是某些化學(xué)鍵的斷裂與重排，最后打通兩系列變化，主要是某些化學(xué)鍵的斷裂與重排，最后打通兩質(zhì)膜，形成雙核或多核細(xì)胞。質(zhì)膜，形成雙核或多核細(xì)胞。細(xì)胞融合細(xì)胞融合 病毒是最早采用的融合劑。常用于誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的病病毒是最早采用的融合劑。常用于誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的病毒有仙臺(tái)病毒、新城雞瘟病毒、皰疹病毒等，其中仙臺(tái)病毒最毒有仙臺(tái)病毒、新城雞瘟病毒、皰疹病毒等，其中仙臺(tái)病毒最常用。用作融合劑的病毒必須事先用紫外線或常用。用作融合劑的病毒必須事先用紫外線或-丙內(nèi)酯滅活，丙內(nèi)酯滅活，使病毒的感染活性

3、喪失而保留病毒的融合活性。使病毒的感染活性喪失而保留病毒的融合活性。優(yōu)點(diǎn)：融合率較高，對(duì)各種動(dòng)物細(xì)胞都適宜，且仙臺(tái)病毒能在優(yōu)點(diǎn)：融合率較高，對(duì)各種動(dòng)物細(xì)胞都適宜，且仙臺(tái)病毒能在雞胚中大量繁殖，容易培養(yǎng)；雞胚中大量繁殖，容易培養(yǎng)；缺點(diǎn)：仙臺(tái)病毒不穩(wěn)定，在保存過(guò)程中融合活性會(huì)降低，并且缺點(diǎn)：仙臺(tái)病毒不穩(wěn)定，在保存過(guò)程中融合活性會(huì)降低，并且制備過(guò)程比較煩瑣。此外，制備過(guò)程比較煩瑣。此外，病毒引進(jìn)細(xì)胞后，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的病毒引進(jìn)細(xì)胞后，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的生命活動(dòng)產(chǎn)生干擾生命活動(dòng)產(chǎn)生干擾。病毒誘導(dǎo)融合病毒誘導(dǎo)融合 在不同種類的動(dòng)物細(xì)胞混合液中加入聚乙在不同種類的動(dòng)物細(xì)胞混合液中加入聚乙二醇，就會(huì)發(fā)生細(xì)胞凝集作

4、用；聚乙二醇誘導(dǎo)二醇，就會(huì)發(fā)生細(xì)胞凝集作用；聚乙二醇誘導(dǎo)細(xì)胞融合的機(jī)理，目前還不太清楚。聚乙二醇細(xì)胞融合的機(jī)理，目前還不太清楚。聚乙二醇是化學(xué)試劑，使用起來(lái)很方便，誘導(dǎo)細(xì)胞融合是化學(xué)試劑，使用起來(lái)很方便，誘導(dǎo)細(xì)胞融合的頻率比較高，的頻率比較高，但是它有一定毒性，對(duì)有些細(xì)但是它有一定毒性，對(duì)有些細(xì)胞胞( (如卵細(xì)胞如卵細(xì)胞) )不適用不適用。聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG誘導(dǎo)融合誘導(dǎo)融合 1. 1. 器具器具: : 顯微鏡顯微鏡 離心機(jī)離心機(jī) 天平天平 離心管離心管 細(xì)滴管細(xì)滴管 載片、蓋片載片、蓋片 2. 2. 試劑試劑: : 50%50%聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)：稱取一定量的：稱取

5、一定量的PEG(MW=4000)PEG(MW=4000)放入刻度試管，在酒精燈火或沸水中加放入刻度試管，在酒精燈火或沸水中加熱溶化。待冷至熱溶化。待冷至5050時(shí)，加入等體積并預(yù)熱至?xí)r，加入等體積并預(yù)熱至5050的的GKNGKN液混勻。液混勻。AlsverAlsver液液：葡萄糖：葡萄糖2.05g 2.05g 檸檬酸鈉檸檬酸鈉0.8g NaCl 0.42g0.8g NaCl 0.42g，加重蒸水至加重蒸水至100ml100ml。GKN GKN 液液：NaCl 8gNaCl 8g，KCl 0.4gKCl 0.4g，NaNa2 2HPOHPO4 4.2H.2H2 2O 1.77gO 1.77g，N

6、aHNaH2 2POPO4 4.2H.2H2 2O 0.69gO 0.69g，葡萄糖，葡萄糖2g2g，酚紅，酚紅0.01g0.01g，溶于，溶于1000ml1000ml重蒸水中。重蒸水中。0.85%NaCl0.85%NaCl液液二、實(shí)驗(yàn)器材與試劑二、實(shí)驗(yàn)器材與試劑 1. 1.用注射器取用注射器取2ml Alsver2ml Alsver液，再?gòu)囊硐蚂o脈取鴨血液，再?gòu)囊硐蚂o脈取鴨血2ml2ml，注，注入入管內(nèi)，再加管內(nèi)，再加6ml Alsver6ml Alsver液，混勻后置液，混勻后置44冰箱中可備作冰箱中可備作3-43-4用。用。 2. 2. 實(shí)驗(yàn)時(shí)取實(shí)驗(yàn)時(shí)取“1”1”液液1ml1ml于離心管

7、中，加入于離心管中，加入4ml4ml 0.85% 0.85%的的NaClNaCl液，混勻平衡后以液，混勻平衡后以1200rpm1200rpm離心離心5min5min。 3. 3. 去上清液。再重復(fù)去上清液。再重復(fù)“2”2”兩次，最后一次離心兩次，最后一次離心10min10min。 4. 4. 在沉降血球中加入在沉降血球中加入1ml1mlGKNGKN液，混勻使之成為細(xì)胞懸液。液，混勻使之成為細(xì)胞懸液。 5. 5. 在在“4”4”液中加入液中加入6868滴滴（約（約0.5ml0.5ml）50%50%的的PEGPEG液，迅速液，迅速混勻，常溫下混勻，常溫下2-3min2-3min滴片鏡檢。滴片鏡檢。

8、三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法四、結(jié)果觀察四、結(jié)果觀察 在高倍鏡下可以看到有兩個(gè)或兩個(gè)以上的鴨血細(xì)在高倍鏡下可以看到有兩個(gè)或兩個(gè)以上的鴨血細(xì)胞膜融合在一起，形成一個(gè)異核體細(xì)胞。要注意辨別胞膜融合在一起，形成一個(gè)異核體細(xì)胞。要注意辨別融合細(xì)胞與重疊的鴨血細(xì)胞。融合細(xì)胞與重疊的鴨血細(xì)胞。五、融合率的計(jì)算五、融合率的計(jì)算 在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200200個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞( (包括融合的與未包括融合的與未融合的細(xì)胞融合的細(xì)胞) )，以融合細(xì)胞，以融合細(xì)胞( (含兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞含兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞核的細(xì)胞核的細(xì)胞) )的細(xì)胞核數(shù)除以總細(xì)胞核數(shù)的細(xì)胞核數(shù)除以總細(xì)胞核數(shù)( (包括融

9、合與未包括融合與未融合的細(xì)胞核融合的細(xì)胞核) )即得出融合率。即得出融合率。作業(yè)：描述顯微鏡下細(xì)胞融合的變化，計(jì)算融合率。作業(yè)：描述顯微鏡下細(xì)胞融合的變化，計(jì)算融合率。細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的結(jié)構(gòu)，它可選細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的結(jié)構(gòu)，它可選擇性地讓某些物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。而對(duì)于不同性質(zhì)的物質(zhì)，擇性地讓某些物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。而對(duì)于不同性質(zhì)的物質(zhì)，細(xì)胞膜的通透性有所不同。當(dāng)細(xì)胞與所處的環(huán)境存在滲細(xì)胞膜的通透性有所不同。當(dāng)細(xì)胞與所處的環(huán)境存在滲透壓差別時(shí)，水分子可從滲透壓低的一側(cè)向高的一側(cè)擴(kuò)透壓差別時(shí)，水分子可從滲透壓低的一側(cè)向高的一側(cè)擴(kuò)散，以至于在高滲環(huán)境中，細(xì)胞會(huì)失水而皺縮；而在低

10、散，以至于在高滲環(huán)境中，細(xì)胞會(huì)失水而皺縮；而在低滲環(huán)境中，細(xì)胞會(huì)吸水膨脹直至破裂。滲環(huán)境中，細(xì)胞會(huì)吸水膨脹直至破裂。一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理紅細(xì)胞膜滲透性觀察紅細(xì)胞膜滲透性觀察兔紅細(xì)胞滲透壓的觀察兔紅細(xì)胞滲透壓的觀察 1.取一小燒杯，用肝素液（取一小燒杯，用肝素液（1mg/ml生理鹽水）濕潤(rùn)，生理鹽水）濕潤(rùn)， 然后加入兔血，以然后加入兔血，以10倍生理鹽水稀釋，制成兔血細(xì)倍生理鹽水稀釋，制成兔血細(xì) 胞懸浮液胞懸浮液. 2.取取5支試管，編碼后依次向各試管加入支試管，編碼后依次向各試管加入1.5%NaCl液液 5,3,2,1,0 ml,然后分別加入蒸餾水，使每管總體積然后分別加入蒸餾水，使每管總體積 達(dá)到達(dá)到5ml，配成一濃度梯度的，配成一濃度梯度的NaCl液。液。 3.向每一試管加入向每一試管加入0.5ml兔紅細(xì)胞懸浮液，混勻。兔紅細(xì)胞懸浮液，混勻。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容試管編號(hào)試管編號(hào)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目1.5% NaCl1.5% NaCl（mlml） 5 3 2 1 05 3 2 1 0蒸餾水（蒸餾水（mlml） 0 2