啤酒酵母選育

1、啤酒酵母選育紫外誘變及其突變株的性能測(cè)試1 材料與方法1.1 材料菌種：四鈴啤酒酵母儀器：分光光度計(jì)、恒溫振蕩器、水浴鍋、離心機(jī)、顯微鏡、蒸餾裝置、分析天平。培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基，麥芽汁固體培養(yǎng)基。（麥芽汁由四鈴啤酒廠提供）1.2 試驗(yàn)方法酵母菌的活化取菌種接種至裝有麥芽汁液體培養(yǎng)基的錐形瓶130r/min 振蕩培養(yǎng)，于28恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)14h，得到正常生長(zhǎng)時(shí)期的釀酒酵母菌懸液。然后接種于斜面麥芽汁固體培養(yǎng)基上，采納28恒溫培養(yǎng) 14h，得到完全活化的正常生長(zhǎng)的酵母菌。釀酒酵母菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的測(cè)定菌懸液的制備取 1OmL 菌液離心收集菌體，洗滌 2 次后，菌體懸浮于 1OmL 生理鹽水中，制得菌

2、懸液。取活化的菌懸液各 1mL 接種于 36 支含 9mL 的麥芽汁液體培養(yǎng)基中，搖勻， 130r/min 振蕩培養(yǎng)，每隔 2h 取試管 3 個(gè)，放入冰箱，全部培養(yǎng)終止用 722 型分光光度計(jì)于波長(zhǎng) 600nm 處測(cè)各管菌液的吸光度值，以空白的麥芽汁培養(yǎng)液為對(duì)比，按照所得數(shù)據(jù)做出釀酒酵母菌的生長(zhǎng)曲線。（此圖視為參考）紫外線誘變?cè)囼?yàn)用麥芽汁液體培養(yǎng)基將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液稀釋，使菌種的濃度達(dá)到lx106個(gè) mL。(此處菌懸液濃度的確定采納三種方法：1.顯微鏡直截了當(dāng)計(jì)數(shù)法;2.平板菌落計(jì)數(shù)法；3.光電比濁計(jì)數(shù)法)備注：平板直截了當(dāng)計(jì)數(shù)法：如果過少菌液不易涂布開，過多則在涂布完后或在培養(yǎng)時(shí)菌液仍

3、會(huì)在平板表面流淌，不易形成單菌落，且培養(yǎng)周期長(zhǎng)，耗時(shí)多，工作量大，然而也是我們的強(qiáng)項(xiàng)，能夠錘煉大一的動(dòng)手能力。2：顯微鏡直截了當(dāng)計(jì)數(shù)法：比較直觀，我們能夠直截了當(dāng)顯微觀看，多人工作計(jì)數(shù)。耗時(shí)較短，且工作量較小，同時(shí)我系其他實(shí)驗(yàn)組采納此方法計(jì)數(shù)，可供參考。3：光電比濁法：盡管繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線要求較高，然而工作量較小，且一次繪制好標(biāo)準(zhǔn)曲線好后，以后能夠用，準(zhǔn)確率較高。比較三種方法，我傾向于第一種和第三種，二者相比較，能夠校正方案。實(shí)驗(yàn)步驟：打開 30W 紫外燈預(yù)熱 30min，使其功率達(dá)到穩(wěn)固。1 取斜面菌苔一環(huán)于2OmL 麥汁中混勻， 28活化培養(yǎng) 14h。2 取 4mL 培養(yǎng)液以 3000r/mi

4、n 的速度離心 15min，棄上清液加入4mL生理鹽水洗滌，在電磁振蕩儀上震蕩 10min 左右，重復(fù) 2 次，制成 5mL 懸液，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直截了當(dāng)計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度。3 取誘變前的 1mL 菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，分離出3 個(gè)合適的稀釋度傾注瓊脂平板，約為10-3、10-4、10-5，每一個(gè)梯度 3 個(gè)平板，每一個(gè)平板加0.2mL 菌液，進(jìn)行培養(yǎng)后平板計(jì)數(shù)法，作為對(duì)比。4 取菌懸液 5mL 移入無菌培養(yǎng)皿中，加入一無菌磁力轉(zhuǎn)子，置于磁力攪拌器上。5 30W 紫外燈下 30cm 處照耀，調(diào)整照耀時(shí)刻。此次預(yù)設(shè)為 0，30，45，60，90，120，180，600.（單位 s）6 取一

5、定稀釋梯度的紫外照耀菌液0.1（視具體情形而定）用無菌涂布棒涂布平均，每組做三個(gè)平行線培養(yǎng)記錄菌落數(shù)，運(yùn)算各照耀時(shí)刻下的致死率。（選在 75%-80%）。致死率 =未經(jīng)照耀菌落數(shù) -紫外照耀菌落數(shù)未經(jīng)紫外照耀菌落數(shù)7 挑取平板上生長(zhǎng)迅速菌落比較大的菌株進(jìn)行斜面培養(yǎng)， 然后重復(fù) 1-5，再重復(fù)第 5 步，挑取平板上生長(zhǎng)迅速、菌落比較大的菌株進(jìn)行斜面培養(yǎng)，連續(xù)進(jìn)行 5 次，28培養(yǎng) 20h 左右，運(yùn)算其突變率和致死率。 （上述時(shí)刻等數(shù)字視為參考數(shù)值）初篩誘變后選擇在麥芽汁固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落呈中等大小、乳白色、表面光滑和邊緣整齊的菌落移接斜面供復(fù)篩。復(fù)篩供復(fù)篩的菌株進(jìn)行500ml 三角瓶低溫

6、發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液中的雙乙酰含量并以此作為復(fù)篩的標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中雙乙酰含量最低的幾株酵母的其它性能。雙乙酰含量測(cè)定：初篩獲得的菌株經(jīng)500ml 三角瓶?jī)?nèi)裝 300ml 120Bx 麥芽汁發(fā)酵 8d 后，測(cè)定發(fā)酵液中的雙乙酰含量，選擇發(fā)酵液中雙乙酰含量低的菌株進(jìn)行二次發(fā)酵，將雙乙酰含量明顯降低的4 株菌分不編號(hào)為FB-E1、FB-E2、FB-E3和 FB-E4 。結(jié)果見表 1表 1 發(fā)酵液中雙乙酰含量的比較菌株F BFB-E1 FB-E2 FB-E3 FB-E4雙乙酰含量 (mg/L) 0.12330.0706 0.0926 0.0776 0.0870降低率 (%)042.724.937.1

7、 29.4（此處繪制表格樣式視為參考）降低前驅(qū)物質(zhì) -乙酰乳酸的生產(chǎn)量措施：改良酵母菌種提升麥汁中 -氨基氮含量，能夠抑制合成酶的活性2 加速雙乙酰的還原措施：提升酵母的細(xì)胞密度（增大酵母菌的接種量）提升還原溫度（封罐后高溫還原）限制后期酵母的出芽率（封罐）國(guó)標(biāo)中關(guān)于啤酒中雙乙酰的量的要求二級(jí)啤酒： 0.2mg/L一級(jí)啤酒： 0.13mg/L方法：國(guó)標(biāo) GB4927-2001 檢測(cè)培養(yǎng)條件：恒溫12 度發(fā)酵栓培養(yǎng)8d 后檢測(cè)發(fā)酵液中雙乙酰的含量。原理：雙乙酰的測(cè)定方法采納比色法。鄰苯二胺比色法是連二酮類都能發(fā)生顯色反應(yīng)的方法，因此，此法測(cè)得之值為雙乙酰與戊二酮的總量，結(jié)果偏高。但此法快速簡(jiǎn)便。

8、用蒸汽將雙乙酰從樣品中蒸餾出來，加鄰苯二胺，形成 2，3二甲基喹喔琳，其鹽酸鹽在335nm 波長(zhǎng)下有一最大吸取峰，可進(jìn)行定量測(cè)定。1 儀器：帶有加熱套管的雙乙酰蒸餾器，蒸汽發(fā)生瓶（ 2000mL 或 3000 mL）或者錐形瓶，平底燒瓶，容量瓶 25mL2 試劑和溶液鹽酸溶液（ 4moL/L ），鄰苯二銨溶液： 10g/L（稱取鄰苯二銨0.1g 用鹽酸溶液溶解并定容至10mL 搖勻，放于陰暗處，注意此溶液即用即配）消泡劑3 實(shí)驗(yàn)步驟(1)把雙乙酰蒸餾器安裝好，把夾套蒸餾器下端的排氣夾子打開。(2)將內(nèi)裝 2.5mL 蒸餾水的容量瓶 (或量筒 )放于冷凝器下，使出口尖端浸沒在水面下，外加冰水冷卻

9、。(3)加熱蒸汽發(fā)生器至沸，通汽加熱夾套，備用。(4)于 100mL 量筒中加入 24 滴消泡劑，再注入 5左右未除氣啤酒100mL。(5)待夾套蒸餾器下端冒大汽時(shí)，打開進(jìn)樣口瓶塞，將啤酒迅速注入蒸餾器內(nèi)，再用約 10mL 蒸餾水沖洗量筒，同時(shí)倒入，迅速蓋好進(jìn)樣口塞子，用水封口。(6)待夾套蒸餾器下端再次冒大汽時(shí)，將排氣夾子夾住，開始蒸餾，到餾出液接近 25mL 時(shí)取下容量瓶， 用水定容至 25mL，搖勻 (蒸餾應(yīng)在 3 分鐘內(nèi)完成 )。(7)分不吸取餾出液 10mL 于兩支比色管中。一管作為樣品管加入0.5mL 鄰苯二胺溶液，另一管不加作空白，充分搖勻后，同時(shí)置于暗處放置20-30 分鐘，然

10、后于樣品管中加 2mL4N 鹽酸溶液，于空白管中加 2.5mL4N 鹽酸溶掖，混勻。(8)在 335nm 波長(zhǎng)處，用 1cm 比色皿以空白作對(duì)比測(cè)定樣品吸光度。(9)運(yùn)算：雙乙酰 (mgL) A335×2.4（用 20mm 石英比色皿時(shí)，吸光度與雙乙酰的換算系數(shù)）注：若用 20mm 的石英比色皿則換算系數(shù)則為1.2不同菌株的發(fā)酵性能測(cè)試（CO2 失重法）將發(fā)酵搖瓶置于26 度恒溫環(huán)境中，每天稱重1 次（直至日失重小于0.5g 為止），因每瓶用于發(fā)酵的麥芽汁體積相同，因此只需運(yùn)算發(fā)酵后單位時(shí)刻內(nèi) CO2 的開釋量，發(fā)酵6d，以 CO2 產(chǎn)生量為縱坐標(biāo)，發(fā)酵時(shí)刻為橫坐標(biāo)，繪制 C02 產(chǎn)

11、生量曲線。不同菌株發(fā)酵發(fā)酵液中殘留總糖含量測(cè)定從 8 個(gè)發(fā)酵后的發(fā)酵瓶中各取 0.2mL 發(fā)酵液并稀釋 500 倍，用硫酸 -苯酚法測(cè)定發(fā)酵液中殘留總糖的含量。附錄：硫酸 -苯酚法1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制準(zhǔn)確稱取干燥恒重的葡萄糖20mg，蒸餾水準(zhǔn)確定容500mL 得到 0.04mg/L 的葡萄糖液。2）試劑1）濃硫酸：分析純， 95.5%2）80%苯酚： 80 克苯酚（分析純重蒸餾試劑）加20 克水使之溶解，可置冰箱中避光長(zhǎng)期儲(chǔ)存。3）6%苯酚：臨用前以80%苯酚配制。（每次測(cè)定均需現(xiàn)配）4）15%三氯乙酸（ 15%TCA）：15 克 TCA 加 85 克水使之溶解，可置冰箱中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。5）5%

12、三氯乙酸（ 5%TCA ）：25 克 TCA 加 475 克水使之溶解，可置冰箱中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。6）6mol/L 氫氧化鈉： 120 克分析純氫氧化鈉溶于500ml 水。7）6mol/L 鹽酸表 1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作步驟管號(hào)012345678葡萄糖0.00.40.60.81.01.21.41.61.8蒸餾水2.01.61.41.21.00.80.60.40.2苯酚液1.01.01.01.01.01.01.01.01.0濃硫酸5.05.05.05.05.05.05.05.05.0取 8 支潔凈的具塞試管按表 2 方法操作 ,搖勻后放置 5min,置沸水浴中加熱 15min,取出迅速冷卻至室溫 ,以 0

13、號(hào)作為空白調(diào)零 ,在最大吸取波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以葡萄糖濃度 X 為橫坐標(biāo)（ ug/mL），吸光度 Y 為縱坐標(biāo)，從而來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖（或葡萄糖） 20mg 于 500ml容量瓶中，加水至刻度，分不吸取 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8,各以蒸餾水補(bǔ)至 2.0ml，然后加入 6%苯酚 1.0ml 及濃硫酸 5.0ml,搖勻冷卻，室溫放置 20 分鐘以后于 490nm 測(cè)光密度，以 2.0ml 水按同樣顯色操作為空白，橫坐標(biāo)為多糖微克數(shù)，縱坐標(biāo)為光密度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。2樣品含量測(cè)定：取樣品 1 克（濕樣）加 1mL15%TCA（三氯醋

14、酸）溶液研磨，再加少許 5TCA 溶液研磨，倒上清液于 10 毫升離心管中，再加少許 5TCA 溶液研磨，倒上清液，重復(fù) 3 次。最后一次將殘?jiān)黄鸬饺腚x心管。注意：總的溶液不要超出10 毫升。（既不要超出離心管的容量） 。離心，轉(zhuǎn)速 3000 轉(zhuǎn)/分鐘，共三次。第一次 15 分鐘，取上清液。后兩次各 5 分鐘取上清液到 25 毫升錐形比色管中。最后濾液保持 18 毫升左右。水浴，在向比色管中加入 2 毫升 6mol/L 鹽酸之后搖勻，在 96水浴鍋中水浴 2 小時(shí)。定容取樣。水浴后，用流水冷卻后加入 2 毫升 6mol/L 氫氧化鈉搖勻。定容至 25 毫升的容量瓶中。吸取 0.2ml 的樣品

15、液，以蒸餾補(bǔ)至 2.0ml，然后加入 6%苯酚 1.0ml 及濃硫酸 5.0ml,搖勻冷卻室溫放置 20 分鐘以后于 490nm 測(cè)光密度。每次測(cè)定取雙樣對(duì)比。以標(biāo)準(zhǔn)曲線運(yùn)算多糖含量。不同菌株產(chǎn)酒精能力（酒精度）測(cè)試快速氧化法乙醇在酸性條件下 ,通過量的、一定濃度的重鉻酸鉀作用，氧化生成醋酸。再將剩余的的重鉻酸鉀經(jīng)硫代硫酸鈉還原。由反應(yīng)過程中，通過消耗的硫代硫酸鈉的量運(yùn)算酒精含量。試劑：重鉻酸鉀溶液、硝酸溶液、堿性碘化鉀溶液、淀粉溶液、硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液方法：在蒸餾器的接收瓶中，加入10.00ml 重鉻酸鉀溶液和25ml 硝酸溶液。并將空氣冷凝器的出口插入此溶液中。在蒸餾瓶中加入12ml 水和

16、 1.00ml 試樣。接好裝置，迅速加熱至沸，并連續(xù)煮沸 3 分鐘，蒸餾即告完成。在同意瓶中，加入 300ml 水、 10ml 堿性碘化鉀溶液及 10ml 淀粉溶液，在電磁攪拌器攪拌下，用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡青色的淀粉終點(diǎn)。通過如下公式運(yùn)算酒精含量。酒精（ %， V/V ）=(20.00-0.6575V)/Vs式中 V硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定量Vs試樣取樣量方法二： 2.2 蒸餾密度瓶法儀器全玻璃蒸餾器 （500mL）、恒溫水?。ň?#177; 0.1）、容量瓶（100mL）、移液管（ 100 ml）分析天平（感量 0.1mg）、天平（感量 0.1g）、25 ml 附溫度計(jì)密度瓶操作方法

17、用 100mL 容量瓶準(zhǔn)確量取試樣 100ml，置于蒸餾瓶中， 用 50ml 水分三次沖洗容量瓶，洗液并入蒸餾瓶中，加玻璃珠數(shù)粒，裝上蛇型冷凝管，用原 100ml 容量瓶接收餾出液 (外加冰浴 ),慢慢加熱蒸餾， 收集約 96ml 餾出液(蒸餾應(yīng)在 30-60 分鐘內(nèi)完成 )，取下容量瓶，調(diào)溫到 20，補(bǔ)水定容， 混勻。用 25mL 附溫度計(jì)密度瓶測(cè)試樣餾出液 20的相對(duì)密度，按照相對(duì)密度查表，得到試樣餾出液的酒精度（ %，V/V ），即為試樣的酒精度。2.3蒸餾裝置試劑重鉻酸鉀溶液、優(yōu)級(jí)純無水乙醇2.4 操作方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備吸取 1ml 無水乙醇于 100ml 容量瓶中，稀釋至刻度，混勻。

18、分不吸取此稀釋液 0、1、2、3、4、5、6、 7ml 于 50 ml 容量瓶中，各加15.0 ml 重鉻酸鉀溶液，加水至刻度，混勻。此標(biāo)準(zhǔn)系列相當(dāng)于試樣中含有0.0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00(V/V) 的酒精。以空白標(biāo)準(zhǔn)作參比，在波長(zhǎng) 610nm，用 1cm 比色皿測(cè)定其余各標(biāo)準(zhǔn)的吸光度。用吸光度對(duì)酒精濃度作圖，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。試樣的測(cè)定在 500ml 蒸餾燒瓶中，加入 100.0ml 試樣。按 1.2 方法進(jìn)行蒸餾，最后加適量水將蒸餾液補(bǔ)足為 100.0ml。吸取 1.0ml 蒸餾液于 50 ml 容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備的操作測(cè)定其吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)

19、曲線查出酒精含量（ %、V /V ）。-氨基氮含量的測(cè)定水合茚三酮是一種氧化劑，可使氨基酸脫羧氧化，而本身被還原成還原型水合茚三酮。還原型水合茚三酮再與末還原的水合茚三酮及氨反應(yīng)，生成藍(lán)紫色縮合物，顏色深淺與游離氨基氮含量成正比，可在570nm下比色測(cè)定。(1)樣品稀釋 適當(dāng)稀釋樣品至含 13g氨基氮 /mL（麥汁一樣稀釋 100 倍，啤酒 50 倍，啤酒應(yīng)先除氣）。(2)測(cè)定取 9 支 10mL 比色管，其中 3 支吸入 2mL 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，另 3 支各吸入 2mL 試樣稀釋液，剩下 3 支吸入 2mL 蒸餾水。然后各加顯色劑 1 mL，蓋玻塞，搖勻，在沸水浴中加熱 l 6 分鐘。取出，

20、在 20冷水中冷卻 20 分鐘，分不加 5mL 碘酸鉀稀釋液，搖勻。在 30 分鐘內(nèi)，以水樣管為空白，在 570nm 波長(zhǎng)下測(cè)各管的光密度。運(yùn)算：氨基氮含量（ g/mL）=（樣品管平均 O.D./標(biāo)準(zhǔn)管平均 O.D.）×2×稀釋倍數(shù)講明：式中(樣品管平均 O.D./標(biāo)準(zhǔn)管平均 O.D.）：表示樣品管與標(biāo)準(zhǔn)管之間的 氨基氮之比；2：標(biāo)準(zhǔn)管的 氨基氮濃度（ g/mL ），即（ 0.1072×14/75）×100；方法二： -氨基氮的測(cè)定（茚三酮法）1、實(shí)驗(yàn)試劑a 顯色劑100 克磷酸氫二鈉（ Na2HPO4.12H2O）60 克磷酸二氫鉀（ KH2PO4）5

21、.00 克水合茚三酮3.00 克果糖用水溶液溶解后稀釋至1 升（此溶液在低溫下用棕色瓶可儲(chǔ)存2 周，pH 應(yīng)為 6.6-6.8。操作時(shí)能夠按比例配成100ml）。b 稀釋溶液： 2 克碘酸鉀溶于 600ml 水中，再加入 96%乙醇 400ml.c 標(biāo)準(zhǔn)溶液：溶107.2mg 甘氨酸于 100ml 水中， 0貯藏。用時(shí)按要求稀釋。該溶液含有200mg -氨基氮 /升。2、實(shí)驗(yàn)操作取糖化的麥芽汁1.00ml（或者是其他的合適量，使稀釋后的濃度為1-3mg-氨基氮 /升），放入 100ml 的容量瓶中，稀釋到刻度，搖勻。標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸溶液稀釋液：取1.00ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液，在 100ml 的容量瓶中稀釋

22、到刻度。取麥芽汁稀釋溶液、水、標(biāo)準(zhǔn)的甘氨酸溶液（三個(gè)）稀釋液各 2.00ml，放入比色管中，（水用于空白對(duì)比），各比色管中分不加入 1.00ml 的顯色劑，搖勻，在沸水中加熱 16min。（現(xiàn)在應(yīng)該預(yù)備 20的水浴）20水浴中冷卻 20min。加入 5.00ml 的碘酸鉀稀釋溶液，搖勻， 在 30min 內(nèi)于 570nm 處測(cè)定吸光度值。3、運(yùn)算游離的 -氨基氮（毫克 /升麥芽汁） =2×100×樣品溶液吸光度值/標(biāo)準(zhǔn)溶液平均吸光度絮凝性的測(cè)定良好的絮凝性不僅能夠減少發(fā)酵液的澄清時(shí)刻，降低酵母分離的能源消耗，還可防止酵母細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)刻懸浮于發(fā)酵液中致使細(xì)胞自溶，有損啤酒風(fēng)味。方

23、法：取發(fā)酵度試驗(yàn)沉淀的酵母，通過洗滌和離心，稱取10 g 置于帶刻度的錐形離心管內(nèi)，使其懸浮在10 mL pH45的醋酸緩沖液 (O.5l g硫酸鈣，68g 冰醋酸用水稀釋到1 L) 中，靜置5min后，將此懸浮液重新連續(xù)搖動(dòng)，使酵母重新全部懸浮起來，靜置觀看酵母凝聚沉降速度。表 2 不同菌株絮凝性的比較菌株FB FB-E1 FB-E2 FB-E3 FB-E4本斯值 (ml) 3.02.83.02.83.2分不稱取不同菌株酵母在離心管中搖勻，靜置沉降時(shí)，形成一清晰界面逐步下降。酵母在沉降時(shí)形成一清晰界面，講明該酵母是凝集性酵母，從圖 2 可見發(fā)酵度較高的菌株凝集性能稍差(做本試驗(yàn)時(shí)，室溫若超過

24、 20，這對(duì)酵母的凝集性可能稍有阻礙)。還原性糖的測(cè)定斐林試劑比色法測(cè)定還原糖(臨時(shí)不采納 )二、材料、儀器設(shè)備及試劑1. 分光光度計(jì)； 2.分析天平（感量 110000）；3.水浴鍋； 4. 具塞刻度試管； 5.刻度吸管； 6.容量瓶； 7.離心機(jī)1. 斐林試劑 A 液： 40gCuSO4.5H2O 溶解于蒸餾水定容至 1L。2.斐林試劑 B 液：200g 酒石酸鉀鈉（ KNaC4H4O6.5H2O）與 150gNaOH 溶于蒸餾水中，并定容至 1 升。A、B 兩液分不貯存，使用前等體積混合。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液： 取 80下烘至恒重的葡萄糖 0.1000g，加蒸餾水溶解， 定容至100ml。5.甲

25、基紅指示劑： 0.1g 甲基紅溶于 250mL60乙醇中。 6.10Pb（Ac）2。7.飽和 Na2SO4（2019.5g）。三、實(shí)驗(yàn)步驟2.對(duì)含蛋白質(zhì)較多的樣品，此間可加10Pb(Ac)2，除去蛋白質(zhì)，至不再產(chǎn)生白色絮狀沉淀時(shí)，加飽和Na2SO4 除去余外的鉛離子。3.樣品測(cè)定：吸取 6ml 待測(cè)液，加 4ml 斐林試劑，其它操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同，在 590nm 波長(zhǎng)下讀取吸光度。以不含樣品的空白管的吸光度減去樣品管的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出糖含量.按下式運(yùn)算還原糖的百分含量：還原糖（）查得的糖毫克數(shù)×樣品總體積×稀釋倍數(shù) /(測(cè)定時(shí)取用體積×樣品重×1000)×100方法 2：試劑與材料（臨時(shí)采納此方法）1.斐林試劑甲 69.3 CuSO4.5H2O1000mL50mL/ 組乙 346g 酒石酸鉀鈉 +100gN