葉酸檢測方法研究進展(一)

1、葉酸檢測方法研究進展(一)    1942年，Stokstad首次成功地合成了葉酸，并闡明了葉酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。半個世紀過去了，葉酸一直是學(xué)術(shù)界的研究熱點。目前的研究證實，婦女孕前或妊娠早期缺乏葉酸是神經(jīng)管畸形發(fā)生的重要病因之一1。葉酸與同型半胱氨酸代謝關(guān)系密切，對預(yù)防心血管疾病的發(fā)生具有重要的生物學(xué)意義2。 葉酸是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，生化特性相近的化合物統(tǒng)稱，是由喋啶、對氨基苯甲酸和1個或多個谷氨酸結(jié)合而成。食物中的葉酸絕大多數(shù)是以喋酰多谷氨酸(或稱多谷氨酸葉酸)的形式存在的。食物葉酸經(jīng)小腸粘膜細胞內(nèi)特異葉酰多谷氨酸水解酶的作用，水解為喋酰單谷氨酸(或稱單谷

2、氨酸葉酸，PteGlu)后吸收。吸收后的單谷氨酸葉酸一部分又轉(zhuǎn)變?yōu)槎喙劝彼崛~酸，在肝臟、紅細胞及其他組織細胞內(nèi)貯存，其余部分則以單谷氨酸葉酸的形式分布于血漿、組織液、膽汁及尿液中。肝臟的葉酸濃度是血漿的幾百倍，但其單谷氨酸葉酸濃度與血漿相近。 葉酸以8種輔酶形式存在于生物體內(nèi)，為一碳單位的載體參與嘌呤、嘧啶等重要物質(zhì)的合成。用于評價人體葉酸營養(yǎng)狀況最常用的檢測指標(biāo)是紅細胞葉酸及血清或血漿葉酸。目前，葉酸的檢測方法已有多種，其中微生物法、同位素放射免疫法的使用最為廣泛。 一、微生物法 微生物法是檢測生物體內(nèi)葉酸的經(jīng)典方法，通常所用的微生物有干酪樣乳酸桿菌（L.casei)、糞鏈球菌和啤酒小球菌屬

3、。此3種微生物對不同形式葉酸的敏感度不同。糞鏈球菌只對非甲基化葉酸敏感，如PteGlu、二氫葉酸(DHF)和四氫葉酸(THF)，可用于鑒別分析各種形式葉酸在不同檢測物的分布。L.casei對單谷氨酸葉酸、含2或3個谷氨酸葉酸(PteGlu2、PteGlu3)及其還原型衍生物均敏感，是3種微生物中反應(yīng)譜帶最寬的一種，也是最為常用的菌種。它對含7個谷氨酸葉酸(PteGlu7)的敏感度很小，約為對PteGlu敏感度的1，故有人認為L.casei對超過3個谷氨酸基團的多谷氨酸葉酸無響應(yīng)。但有研究發(fā)現(xiàn)，L.casei對PteGlu4、PteGlu5、PteGlu6和PteGlu7的敏感度分別為對PteG

4、lu的 65.6、19.9、3.5 及2.4，同時對某些形式的多谷氨酸葉酸的敏感度隨培養(yǎng)時間的延長而增加，其機理有兩種可能：其一，微生物在培養(yǎng)過程中合成水解酶，隨培養(yǎng)時間延長，水解酶產(chǎn)量增加，促使部分長鏈谷氨酸水解斷裂；其二，細菌在培養(yǎng)過程中細胞壁對多谷氨酸葉酸的通透性增加。所以，盡管L.casei對葉酸的反應(yīng)譜帶較寬，但如檢測物中含有多谷氨酸葉酸須將樣品在檢測前加入多谷氨酸葉酸水解酶進行水解，使各種形式葉酸均轉(zhuǎn)變成單谷氨酸葉酸，否則檢測結(jié)果不能代表其葉酸總含量。 盡管微生物法靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，但也有許多局限性，如整個實驗周期長，批間檢測結(jié)果重復(fù)性差，檢測結(jié)果受樣品中所含抗葉酸藥物或抗生素成

5、分的影響等。用-乳酰胺酶處理樣品后，可消除青霉素和先鋒霉素等抗生素對葉酸檢測結(jié)果的干擾5。 微生物法除可用于檢測血清和全血葉酸外，還可用于檢測紙血片葉酸6，檢測結(jié)果為葉酸與血紅蛋白的比值。由于紙血片標(biāo)本制備技術(shù)簡單，紙血片葉酸穩(wěn)定性較好，故該法對大規(guī)模人群葉酸營養(yǎng)狀況的流行病學(xué)調(diào)查具有重要的意義。 二、同位素放射免疫法 盡管微生物法得到各種改進，但仍因耗時大，操作復(fù)雜而不能得到廣泛使用。70年代初，有學(xué)者提出 同位素放射免疫法檢測血清葉酸。該方法具有快速、簡便的特點，同時由于葉酸放射免疫試劑盒的出現(xiàn)，很快得到普及，尤其廣泛應(yīng)用于臨床實驗室。 放射免疫法與微生物法檢測葉酸，除原理不同外，檢測結(jié)果

6、的意義也有所不同。對大量標(biāo)本總體而言，兩種方法結(jié)果相關(guān)性較好，但對個體標(biāo)本，兩種方法結(jié)果的差異較大。微生物法對多谷氨酸葉酸響應(yīng)值低，不能直接用于檢測葉酸含量。但微生物法對所有單谷氨酸葉酸及其衍生物的反應(yīng)靈敏度相同，故在用葉酸水解酶處理樣品使所有葉酸形式轉(zhuǎn)變?yōu)閱喂劝彼崛~酸后進行檢測，可得到準(zhǔn)確的葉酸值。同位素放射免疫法對多谷氨酸葉酸反應(yīng)的相對靈敏度有較大的差別，隨著葉酸濃度增加，反應(yīng)的相對靈敏度增加，但多谷氨酸葉酸的反應(yīng)曲線不可能與單谷氨酸葉酸的反應(yīng)曲線重合；另一方面，多谷氨酸葉酸與結(jié)合蛋白的親合性與單谷氨酸葉酸相比較高，不同的單谷氨酸葉酸衍生物反應(yīng)靈敏度不同，放射免疫法也不適用于檢測單谷氨酸葉

7、酸衍生混合物。由于上述原因，盡管放射免疫法可用于檢測和評價葉酸的營養(yǎng)狀況，但從定量檢測的角度來講，難以得到準(zhǔn)確的葉酸含量值。 目前用于檢測葉酸的放射免疫試劑盒已有數(shù)種，其原理基本相同，但不同的試劑盒檢測結(jié)果也有差異7,主要區(qū)別有如下幾方面：競爭結(jié)合蛋白不同，或為豬血清結(jié)合蛋白，或為牛奶結(jié)合蛋白，或為-乳球蛋白。(l)-5-甲基四氫葉酸與豬血清結(jié)合蛋白的親合力好于多谷氨酸葉酸，后者又略好于單谷氨酸葉酸的其他衍生物，而5-甲基四氫葉酸的d型異構(gòu)體不能與豬血清結(jié)合蛋白結(jié)合；牛奶結(jié)合蛋白與單谷氨酸葉酸和（d,l）-5-甲基四氫葉酸具有相同的親合力，但對單谷氨酸葉酸的其他衍生物的親合力各不相同，對多谷氨

8、酸葉酸的親合力高于對其單谷氨酸葉酸衍生物；-乳球蛋白則對(d,l)-四氫葉酸的結(jié)合力較差。配制標(biāo)準(zhǔn)系列的溶液不同，主要有兩種，即緩沖液和血清。用血清作配制溶液與用緩沖液作配制溶液的試劑盒相比，檢測結(jié)果偏低。放射免疫法檢測葉酸結(jié)果與試劑盒選擇哪一種形式葉酸作標(biāo)準(zhǔn)品有關(guān)，如選擇的標(biāo)準(zhǔn)品為(d,l)-5-甲基四氫葉酸，則使用此類試劑盒的前提便是假設(shè)檢測物中絕大多數(shù)葉酸是以此單一輔酶形式存在的，從而使檢測結(jié)果與實際含量間的誤差增大。以上所述的各種因素可能是造成目前各類試劑盒檢測結(jié)果間差別較大的主要原因。所以，盡管各類試劑盒均有其相應(yīng)的正常值參考范圍，但各實驗室還應(yīng)結(jié)合與葉酸營養(yǎng)狀況有關(guān)的其他指標(biāo)，來確

9、定本實驗室的紅細胞或血漿、血清葉酸正常值。 三、其他方法 1.氣相色譜-質(zhì)譜檢測：血清或紅細胞葉酸是目前用于評價葉酸營養(yǎng)狀況的兩個重要指標(biāo)，且紅細胞葉酸是反映體內(nèi)葉酸貯存狀況的客觀指標(biāo)，對診斷葉酸缺乏具有更為重要意義。微生物法、放射免疫法可以實現(xiàn)血清或血漿及溶血液葉酸含量的檢測，紅細胞葉酸均是通過某種數(shù)學(xué)公式，從溶血液葉酸、血清葉酸和紅細胞壓積等指標(biāo)計算出來的。1995年，Santhosh-Kumar等8提出用氣相色譜-質(zhì)譜檢測的方法(GC-MS)檢測紅細胞葉酸含量，填補了直接檢測樣品紅細胞葉酸濃度的空白，該方法特異性好，靈敏度高，且結(jié)果準(zhǔn)確。 2色譜分析法:以上所述各種葉酸的檢測方法，其檢測

10、結(jié)果均為單或和多谷氨酸葉酸及其衍生物混合物的總量。即使是微生物法也因不同微生物對不同形式葉酸的生物利用率不同，無法進行某一種或某幾種單谷氨酸葉酸衍生物的分析檢測。70年代，有學(xué)者提出應(yīng)用色譜分析法，包括高效離子交換層析、離子對分配層析和高效液相色譜分析(HPLC)技術(shù)分離提取各種形式的葉酸，但由于葉酸濃度低于檢測器檢測下限，人們不得不在應(yīng)用色譜技術(shù)分離提取葉酸后，再用微生物學(xué)檢測方法進行定量檢測。因該方法費時，需要樣品量較大，故其實際應(yīng)用受到限制。HPLC-電化學(xué)檢測方法對單谷氨酸葉酸及其衍生物的檢測靈敏度高于紫外或熒光檢測方法9，對四氫葉酸及5-甲基四氫葉酸的檢測靈敏度是微生物法的1050倍

11、。此方法可用于人類及大鼠等多種生物樣品葉酸檢測，且檢測前無需樣品濃縮處理。這項技術(shù)的應(yīng)用對體內(nèi)葉酸吸收、代謝及轉(zhuǎn)運等基礎(chǔ)理論的研究具有重要意義。1996年，Gunter等7發(fā)現(xiàn)，HPLC對全血葉酸的檢測結(jié)果與Bio-Rad放射免疫試劑盒對同份樣品葉酸的測定結(jié)果相近，但血漿葉酸的測定結(jié)果僅為其他方法測定結(jié)果的一半，作者認為盡管HPLC對5-甲基四氫葉酸特異性好，但在洗脫過程中有葉酸丟失的可能。HPLC技術(shù)復(fù)雜，不適用于臨床常規(guī)檢測。 3離子捕獲法:Wilson等10提出離子 捕獲法檢測葉酸，該技術(shù)可謂葉酸檢測技術(shù)中的最新方法，即在實驗中，樣品加入變性劑后葉酸與內(nèi)源性結(jié)合蛋白分離，釋放后的葉酸再與

12、帶有大量陰離子的親合試劑結(jié)合，合成產(chǎn)物經(jīng)過離子捕獲池而與陽離子纖維結(jié)合，最后通過堿性磷酸酶與喋酸(葉酸的類似物)結(jié)合物對葉酸結(jié)合蛋白上游離結(jié)合位點的探查，定量分析樣品的葉酸含量。該研究證實，離子捕獲法測定血清或紅細胞葉酸，其結(jié)果與同位素放射免疫法的結(jié)果具有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.96 和0.93。 4其他方法:80年代后期90年代，有學(xué)者相繼提出用非放射性標(biāo)記蛋白結(jié)合技術(shù)檢測血液葉酸，其中包括克隆酶供體免疫測定法(CEDIA)11、酶聯(lián)配體吸附試驗(ELLSA)12、化學(xué)發(fā)光受體實驗等13。CEDIA方法的原理在激素、地高辛及其他維生素的檢測中已有應(yīng)用，其血清葉酸檢測結(jié)果與放射免疫法相

13、近，該方法檢測速度約為放射免疫法的兩倍，又無離子輻射，操作簡單，可作為一般實驗室常規(guī)檢查。不足之處為費用高，約為放射免疫法的23倍。化學(xué)發(fā)光法檢測重現(xiàn)性好，靈敏度較高，對低濃度葉酸樣品檢測結(jié)果明顯高于其他方法7。 20家研究所或臨床實驗室對目前用于檢測血清及全血葉酸的幾種方法進行了比較研究7，結(jié)果顯示，血清葉酸和全血葉酸檢測結(jié)果平均變異系數(shù)分別為27.6和35.7，部分樣品用不同方法檢測的結(jié)果可相差29倍，表明不同實驗室的葉酸檢測結(jié)果差異較大，不同檢測方法的檢測結(jié)果之間可比性較差。這種差異不利于正確地客觀地評價某人群葉酸營養(yǎng)狀況，同時也給制定每日膳食葉酸供給量帶來困難。隨著葉酸在巨幼紅細胞貧血

14、、高同型半胱氨酸血癥及神經(jīng)管畸形的預(yù)防中的作用進一步明確，確定統(tǒng)一的檢測方法和參照標(biāo)準(zhǔn)，提高葉酸檢測準(zhǔn)確率的需求也日益緊迫。目前美國疾病控制中心(CDC)、美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院和美國農(nóng)業(yè)部等機構(gòu)已開始這方面的工作。 參考文獻 1MRC Vitamin Study Research Group.Prevention of neural tube defects: results of the Medical Research Council vitamin study.Lancet，1991，338:131-137. 2Green R, Jacobsen DW. Clinical impli

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