葉酸檢測(cè)方法研究進(jìn)展(一)

1、葉酸檢測(cè)方法研究進(jìn)展(一)    1942年，Stokstad首次成功地合成了葉酸，并闡明了葉酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。半個(gè)世紀(jì)過(guò)去了，葉酸一直是學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)。目前的研究證實(shí)，婦女孕前或妊娠早期缺乏葉酸是神經(jīng)管畸形發(fā)生的重要病因之一1。葉酸與同型半胱氨酸代謝關(guān)系密切，對(duì)預(yù)防心血管疾病的發(fā)生具有重要的生物學(xué)意義2。 葉酸是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，生化特性相近的化合物統(tǒng)稱，是由喋啶、對(duì)氨基苯甲酸和1個(gè)或多個(gè)谷氨酸結(jié)合而成。食物中的葉酸絕大多數(shù)是以喋酰多谷氨酸(或稱多谷氨酸葉酸)的形式存在的。食物葉酸經(jīng)小腸粘膜細(xì)胞內(nèi)特異葉酰多谷氨酸水解酶的作用，水解為喋酰單谷氨酸(或稱單谷

2、氨酸葉酸，PteGlu)后吸收。吸收后的單谷氨酸葉酸一部分又轉(zhuǎn)變?yōu)槎喙劝彼崛~酸，在肝臟、紅細(xì)胞及其他組織細(xì)胞內(nèi)貯存，其余部分則以單谷氨酸葉酸的形式分布于血漿、組織液、膽汁及尿液中。肝臟的葉酸濃度是血漿的幾百倍，但其單谷氨酸葉酸濃度與血漿相近。 葉酸以8種輔酶形式存在于生物體內(nèi)，為一碳單位的載體參與嘌呤、嘧啶等重要物質(zhì)的合成。用于評(píng)價(jià)人體葉酸營(yíng)養(yǎng)狀況最常用的檢測(cè)指標(biāo)是紅細(xì)胞葉酸及血清或血漿葉酸。目前，葉酸的檢測(cè)方法已有多種，其中微生物法、同位素放射免疫法的使用最為廣泛。 一、微生物法 微生物法是檢測(cè)生物體內(nèi)葉酸的經(jīng)典方法，通常所用的微生物有干酪樣乳酸桿菌（L.casei)、糞鏈球菌和啤酒小球菌屬

3、。此3種微生物對(duì)不同形式葉酸的敏感度不同。糞鏈球菌只對(duì)非甲基化葉酸敏感，如PteGlu、二氫葉酸(DHF)和四氫葉酸(THF)，可用于鑒別分析各種形式葉酸在不同檢測(cè)物的分布。L.casei對(duì)單谷氨酸葉酸、含2或3個(gè)谷氨酸葉酸(PteGlu2、PteGlu3)及其還原型衍生物均敏感，是3種微生物中反應(yīng)譜帶最寬的一種，也是最為常用的菌種。它對(duì)含7個(gè)谷氨酸葉酸(PteGlu7)的敏感度很小，約為對(duì)PteGlu敏感度的1，故有人認(rèn)為L(zhǎng).casei對(duì)超過(guò)3個(gè)谷氨酸基團(tuán)的多谷氨酸葉酸無(wú)響應(yīng)。但有研究發(fā)現(xiàn)，L.casei對(duì)PteGlu4、PteGlu5、PteGlu6和PteGlu7的敏感度分別為對(duì)PteG

4、lu的 65.6、19.9、3.5 及2.4，同時(shí)對(duì)某些形式的多谷氨酸葉酸的敏感度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其機(jī)理有兩種可能：其一，微生物在培養(yǎng)過(guò)程中合成水解酶，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，水解酶產(chǎn)量增加，促使部分長(zhǎng)鏈谷氨酸水解斷裂；其二，細(xì)菌在培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞壁對(duì)多谷氨酸葉酸的通透性增加。所以，盡管L.casei對(duì)葉酸的反應(yīng)譜帶較寬，但如檢測(cè)物中含有多谷氨酸葉酸須將樣品在檢測(cè)前加入多谷氨酸葉酸水解酶進(jìn)行水解，使各種形式葉酸均轉(zhuǎn)變成單谷氨酸葉酸，否則檢測(cè)結(jié)果不能代表其葉酸總含量。 盡管微生物法靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，但也有許多局限性，如整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，批間檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性差，檢測(cè)結(jié)果受樣品中所含抗葉酸藥物或抗生素成

5、分的影響等。用-乳酰胺酶處理樣品后，可消除青霉素和先鋒霉素等抗生素對(duì)葉酸檢測(cè)結(jié)果的干擾5。 微生物法除可用于檢測(cè)血清和全血葉酸外，還可用于檢測(cè)紙血片葉酸6，檢測(cè)結(jié)果為葉酸與血紅蛋白的比值。由于紙血片標(biāo)本制備技術(shù)簡(jiǎn)單，紙血片葉酸穩(wěn)定性較好，故該法對(duì)大規(guī)模人群葉酸營(yíng)養(yǎng)狀況的流行病學(xué)調(diào)查具有重要的意義。 二、同位素放射免疫法 盡管微生物法得到各種改進(jìn)，但仍因耗時(shí)大，操作復(fù)雜而不能得到廣泛使用。70年代初，有學(xué)者提出 同位素放射免疫法檢測(cè)血清葉酸。該方法具有快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，同時(shí)由于葉酸放射免疫試劑盒的出現(xiàn)，很快得到普及，尤其廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室。 放射免疫法與微生物法檢測(cè)葉酸，除原理不同外，檢測(cè)結(jié)果

6、的意義也有所不同。對(duì)大量標(biāo)本總體而言，兩種方法結(jié)果相關(guān)性較好，但對(duì)個(gè)體標(biāo)本，兩種方法結(jié)果的差異較大。微生物法對(duì)多谷氨酸葉酸響應(yīng)值低，不能直接用于檢測(cè)葉酸含量。但微生物法對(duì)所有單谷氨酸葉酸及其衍生物的反應(yīng)靈敏度相同，故在用葉酸水解酶處理樣品使所有葉酸形式轉(zhuǎn)變?yōu)閱喂劝彼崛~酸后進(jìn)行檢測(cè)，可得到準(zhǔn)確的葉酸值。同位素放射免疫法對(duì)多谷氨酸葉酸反應(yīng)的相對(duì)靈敏度有較大的差別，隨著葉酸濃度增加，反應(yīng)的相對(duì)靈敏度增加，但多谷氨酸葉酸的反應(yīng)曲線不可能與單谷氨酸葉酸的反應(yīng)曲線重合；另一方面，多谷氨酸葉酸與結(jié)合蛋白的親合性與單谷氨酸葉酸相比較高，不同的單谷氨酸葉酸衍生物反應(yīng)靈敏度不同，放射免疫法也不適用于檢測(cè)單谷氨酸葉

7、酸衍生混合物。由于上述原因，盡管放射免疫法可用于檢測(cè)和評(píng)價(jià)葉酸的營(yíng)養(yǎng)狀況，但從定量檢測(cè)的角度來(lái)講，難以得到準(zhǔn)確的葉酸含量值。 目前用于檢測(cè)葉酸的放射免疫試劑盒已有數(shù)種，其原理基本相同，但不同的試劑盒檢測(cè)結(jié)果也有差異7,主要區(qū)別有如下幾方面：競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合蛋白不同，或?yàn)樨i血清結(jié)合蛋白，或?yàn)榕Ｄ探Y(jié)合蛋白，或?yàn)?乳球蛋白。(l)-5-甲基四氫葉酸與豬血清結(jié)合蛋白的親合力好于多谷氨酸葉酸，后者又略好于單谷氨酸葉酸的其他衍生物，而5-甲基四氫葉酸的d型異構(gòu)體不能與豬血清結(jié)合蛋白結(jié)合；牛奶結(jié)合蛋白與單谷氨酸葉酸和（d,l）-5-甲基四氫葉酸具有相同的親合力，但對(duì)單谷氨酸葉酸的其他衍生物的親合力各不相同，對(duì)多谷氨

8、酸葉酸的親合力高于對(duì)其單谷氨酸葉酸衍生物；-乳球蛋白則對(duì)(d,l)-四氫葉酸的結(jié)合力較差。配制標(biāo)準(zhǔn)系列的溶液不同，主要有兩種，即緩沖液和血清。用血清作配制溶液與用緩沖液作配制溶液的試劑盒相比，檢測(cè)結(jié)果偏低。放射免疫法檢測(cè)葉酸結(jié)果與試劑盒選擇哪一種形式葉酸作標(biāo)準(zhǔn)品有關(guān)，如選擇的標(biāo)準(zhǔn)品為(d,l)-5-甲基四氫葉酸，則使用此類試劑盒的前提便是假設(shè)檢測(cè)物中絕大多數(shù)葉酸是以此單一輔酶形式存在的，從而使檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際含量間的誤差增大。以上所述的各種因素可能是造成目前各類試劑盒檢測(cè)結(jié)果間差別較大的主要原因。所以，盡管各類試劑盒均有其相應(yīng)的正常值參考范圍，但各實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)結(jié)合與葉酸營(yíng)養(yǎng)狀況有關(guān)的其他指標(biāo)，來(lái)確

9、定本實(shí)驗(yàn)室的紅細(xì)胞或血漿、血清葉酸正常值。 三、其他方法 1.氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)：血清或紅細(xì)胞葉酸是目前用于評(píng)價(jià)葉酸營(yíng)養(yǎng)狀況的兩個(gè)重要指標(biāo)，且紅細(xì)胞葉酸是反映體內(nèi)葉酸貯存狀況的客觀指標(biāo)，對(duì)診斷葉酸缺乏具有更為重要意義。微生物法、放射免疫法可以實(shí)現(xiàn)血清或血漿及溶血液葉酸含量的檢測(cè)，紅細(xì)胞葉酸均是通過(guò)某種數(shù)學(xué)公式，從溶血液葉酸、血清葉酸和紅細(xì)胞壓積等指標(biāo)計(jì)算出來(lái)的。1995年，Santhosh-Kumar等8提出用氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)的方法(GC-MS)檢測(cè)紅細(xì)胞葉酸含量，填補(bǔ)了直接檢測(cè)樣品紅細(xì)胞葉酸濃度的空白，該方法特異性好，靈敏度高，且結(jié)果準(zhǔn)確。 2色譜分析法:以上所述各種葉酸的檢測(cè)方法，其檢測(cè)

10、結(jié)果均為單或和多谷氨酸葉酸及其衍生物混合物的總量。即使是微生物法也因不同微生物對(duì)不同形式葉酸的生物利用率不同，無(wú)法進(jìn)行某一種或某幾種單谷氨酸葉酸衍生物的分析檢測(cè)。70年代，有學(xué)者提出應(yīng)用色譜分析法，包括高效離子交換層析、離子對(duì)分配層析和高效液相色譜分析(HPLC)技術(shù)分離提取各種形式的葉酸，但由于葉酸濃度低于檢測(cè)器檢測(cè)下限，人們不得不在應(yīng)用色譜技術(shù)分離提取葉酸后，再用微生物學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行定量檢測(cè)。因該方法費(fèi)時(shí)，需要樣品量較大，故其實(shí)際應(yīng)用受到限制。HPLC-電化學(xué)檢測(cè)方法對(duì)單谷氨酸葉酸及其衍生物的檢測(cè)靈敏度高于紫外或熒光檢測(cè)方法9，對(duì)四氫葉酸及5-甲基四氫葉酸的檢測(cè)靈敏度是微生物法的1050倍

11、。此方法可用于人類及大鼠等多種生物樣品葉酸檢測(cè)，且檢測(cè)前無(wú)需樣品濃縮處理。這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用對(duì)體內(nèi)葉酸吸收、代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)等基礎(chǔ)理論的研究具有重要意義。1996年，Gunter等7發(fā)現(xiàn)，HPLC對(duì)全血葉酸的檢測(cè)結(jié)果與Bio-Rad放射免疫試劑盒對(duì)同份樣品葉酸的測(cè)定結(jié)果相近，但血漿葉酸的測(cè)定結(jié)果僅為其他方法測(cè)定結(jié)果的一半，作者認(rèn)為盡管HPLC對(duì)5-甲基四氫葉酸特異性好，但在洗脫過(guò)程中有葉酸丟失的可能。HPLC技術(shù)復(fù)雜，不適用于臨床常規(guī)檢測(cè)。 3離子捕獲法:Wilson等10提出離子 捕獲法檢測(cè)葉酸，該技術(shù)可謂葉酸檢測(cè)技術(shù)中的最新方法，即在實(shí)驗(yàn)中，樣品加入變性劑后葉酸與內(nèi)源性結(jié)合蛋白分離，釋放后的葉酸再與

12、帶有大量陰離子的親合試劑結(jié)合，合成產(chǎn)物經(jīng)過(guò)離子捕獲池而與陽(yáng)離子纖維結(jié)合，最后通過(guò)堿性磷酸酶與喋酸(葉酸的類似物)結(jié)合物對(duì)葉酸結(jié)合蛋白上游離結(jié)合位點(diǎn)的探查，定量分析樣品的葉酸含量。該研究證實(shí)，離子捕獲法測(cè)定血清或紅細(xì)胞葉酸，其結(jié)果與同位素放射免疫法的結(jié)果具有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.96 和0.93。 4其他方法:80年代后期90年代，有學(xué)者相繼提出用非放射性標(biāo)記蛋白結(jié)合技術(shù)檢測(cè)血液葉酸，其中包括克隆酶供體免疫測(cè)定法(CEDIA)11、酶聯(lián)配體吸附試驗(yàn)(ELLSA)12、化學(xué)發(fā)光受體實(shí)驗(yàn)等13。CEDIA方法的原理在激素、地高辛及其他維生素的檢測(cè)中已有應(yīng)用，其血清葉酸檢測(cè)結(jié)果與放射免疫法相

13、近，該方法檢測(cè)速度約為放射免疫法的兩倍，又無(wú)離子輻射，操作簡(jiǎn)單，可作為一般實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查。不足之處為費(fèi)用高，約為放射免疫法的23倍。化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)重現(xiàn)性好，靈敏度較高，對(duì)低濃度葉酸樣品檢測(cè)結(jié)果明顯高于其他方法7。 20家研究所或臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)目前用于檢測(cè)血清及全血葉酸的幾種方法進(jìn)行了比較研究7，結(jié)果顯示，血清葉酸和全血葉酸檢測(cè)結(jié)果平均變異系數(shù)分別為27.6和35.7，部分樣品用不同方法檢測(cè)的結(jié)果可相差29倍，表明不同實(shí)驗(yàn)室的葉酸檢測(cè)結(jié)果差異較大，不同檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果之間可比性較差。這種差異不利于正確地客觀地評(píng)價(jià)某人群葉酸營(yíng)養(yǎng)狀況，同時(shí)也給制定每日膳食葉酸供給量帶來(lái)困難。隨著葉酸在巨幼紅細(xì)胞貧血

14、、高同型半胱氨酸血癥及神經(jīng)管畸形的預(yù)防中的作用進(jìn)一步明確，確定統(tǒng)一的檢測(cè)方法和參照標(biāo)準(zhǔn)，提高葉酸檢測(cè)準(zhǔn)確率的需求也日益緊迫。目前美國(guó)疾病控制中心(CDC)、美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院和美國(guó)農(nóng)業(yè)部等機(jī)構(gòu)已開(kāi)始這方面的工作。 參考文獻(xiàn) 1MRC Vitamin Study Research Group.Prevention of neural tube defects: results of the Medical Research Council vitamin study.Lancet，1991，338:131-137. 2Green R, Jacobsen DW. Clinical impli

15、cations of hyperhomocysteinemia. In: Bailey LB, ed. Folate in health and disease. New York：Marcel Dekker, 1995.99-102. 3Newman EM, Tsai JF.Microbiological analysis of 5 -formyltetrahydrofolic acid and other folates using an automatic 96-well reader.Anal Biochem, 1986,154:509-515. 4Horne DW ,Patterso

16、n D. Lactobacillus casei microbiological assay of folic acid derivatives in 96-Well microtiter plates.Clin Chem,1988,34:2357-2359. 5OBroin S,Kelleher B.Mi crobiological assay on microtitre plates of folate in serum and red cells. J Clin Pathol,1992,45:344-347. 6OBroin SD,Kelleher BP, Davare A,et al.

17、 Field -study screening of blood folate concentrations :specimen stability and finger-stick sampling. Am J Clin Nutr,1997,66:1398-1405. 7Gunter EW,Bowman BA, Caudill SP,et al.Results of an international round robin for serum and whole-blood folate. Clin Chem,1996,42:1689-1694. 8Santhosh-Kumar CR,Deu

18、tsch JC,Hassell KL,et al.Quantitation of red blood cell folates by stable isotope dilution gas chromatography-mass spectrometry utilizing a folate internal standard.Anal Biochem,1995,225:1-9. 9Kohashi M,Inoue K,Sotobayashi H,et al.Microdetermination of folate monoglutamates in serum by liquid chromatography with electrochemical detection. J Chromatogr,1986,382:303-307. 10Wilson DH,Herrmann R,Hsu S,et al.Ion capture assay for folate with the abbott IMx analyzer.Clin Chem,1995,41:1780-1781. 11van der Weide J,Homan HC,Cozijnsen-van Rheenen E,et al.Nonisotopic binding assay for measuring vitam