高效液相色譜儀原理

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上，流動(dòng)相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達(dá)4.9107Pa）；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬） ； 同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。一、高效液相色譜儀有哪些特點(diǎn)？1 高壓：液相色譜法以液體為流動(dòng)相（稱為載液）， 液體流經(jīng)色譜柱， 受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對(duì)載液施加高壓。一般可達(dá)150350 105Pa。2高速：流動(dòng)相在柱內(nèi)的流速較經(jīng)典色譜快得多，一般可達(dá)110ml/min。高效液相色譜法所需的分析

2、時(shí)間較之經(jīng)典液相色譜法少得多，一般少于1h 。3高效：近年來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。4高靈敏度：高效液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測(cè)器，進(jìn)一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測(cè)器靈敏度可達(dá)10-11g。另外，用樣量小，一般幾個(gè)微升。5適應(yīng)范圍寬：氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優(yōu)點(diǎn)， 但是受技術(shù)條件的限制，沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行分析。而高效液相色譜法只要求試樣能制成溶液，而技術(shù)平臺(tái) 高效液相色譜儀原理不需要汽化，因此不受試樣揮發(fā)性的限制。對(duì)于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對(duì)分子量大（大于400

3、 以上）的有機(jī)物（這些物質(zhì)幾乎占有機(jī)物總數(shù)的 75% 80%）原則上都可應(yīng)用高效液相色譜法來進(jìn)行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70%80%。二、高效液相色譜法可分為哪幾種主要類型？各自的分離原理是什么？高效液相色譜按其固定相的性質(zhì)可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等類型。用不同類型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對(duì)應(yīng)的普通液相層析的原理相似。其不同之處是高效液相色譜靈敏、快速、分辨率高、重復(fù)性好，且須在色譜儀中進(jìn)行。根據(jù)分離機(jī)制的不同，

4、高效液相色譜法可分為下述幾種主要類型：1液液分配色譜法及化學(xué)鍵合相色譜法流動(dòng)相和固定相都是液體。流動(dòng)相與固定相之間應(yīng)互不相溶 （極性不同， 避免固定液流失），有一個(gè)明顯的分界面。當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。a正相液液分配色譜法：流動(dòng)相的極性小于固定液的極性。b反相液液分配色譜法：流動(dòng)相的極性大于固定液的極性。c液液分配色譜法的缺點(diǎn)：盡管流動(dòng)相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動(dòng)相中仍有微量溶解；流動(dòng)相通過色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊力，會(huì)造成固定液流失。上世紀(jì)70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合固定相，可克服上述缺點(diǎn)，現(xiàn)在應(yīng)用很廣泛（70%80%）。2液固色譜法流動(dòng)相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠

5、、氧化鋁等）。這是根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來進(jìn)行分離的。其作用機(jī)制是：當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱時(shí)，溶質(zhì)分子(X) 和溶劑分子(S)對(duì)吸附劑表面活性中心發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附（未進(jìn)樣時(shí)，所有的吸附劑活性中心吸附的是S）。3離子交換色譜法離子交換色譜法是以離子交換劑作為固定相。離子交換色譜法是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，依據(jù)這些離子交換劑具有不同的親和力而將它們分離。凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來進(jìn)行分離。4離子對(duì)色譜法離子對(duì)色譜法是將一種(或多種)與溶質(zhì)分子電荷相反的離子(稱為對(duì)離子或反離子)加到流動(dòng)相或固定相中， 使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型

6、離子對(duì)化合物，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為。離子對(duì)色譜法(特別是反相)解決了針對(duì)乳制品中三聚氰胺的檢測(cè)，國家質(zhì)檢總局日前建議采用三種檢測(cè)方法，高效液相色譜法是其中之一。本文主要介紹高效液相色譜法及高效液相色譜儀相關(guān)原理。 “ ”乳制品生產(chǎn)監(jiān)管 11 September 2008以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物堿以及藥物等分離。5離子色譜法以離子交換樹脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動(dòng)相。以電導(dǎo)檢測(cè)器為通用檢測(cè)器，為消除流動(dòng)相中強(qiáng)電解質(zhì)背景離子對(duì)電導(dǎo)檢測(cè)器的干擾， 設(shè)置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應(yīng)原理與離子交換色譜法相同。

7、離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法，也可用于陽離子分析。6空間排阻色譜法空間排阻色譜法以凝膠(gel)為固定相。它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數(shù)納米到數(shù)百納米。溶質(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進(jìn)行分離，而是按分子大小進(jìn)行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流動(dòng)力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。試樣進(jìn)入色譜柱后，隨流動(dòng)相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現(xiàn)，一些很小的分子可以進(jìn)入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現(xiàn)。三、高效液相色譜儀各個(gè)系統(tǒng)的組成和特點(diǎn)是

8、什么？高效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，下面將分別敘述其各自的組成與特點(diǎn)。1進(jìn)樣系統(tǒng) 一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作， 進(jìn)樣量是恒定的。這對(duì)提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。2輸液系統(tǒng)該系統(tǒng)包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l.474.4107Pa， 流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動(dòng)相通過層析柱時(shí)， 可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動(dòng)速度，這對(duì)提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動(dòng)相貯存器和梯度儀可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、pH值，或改用競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑

9、或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)（即使僅有一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體）都能獲得有效分離。3分離系統(tǒng)該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長(zhǎng)度為1050cm（需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管），內(nèi)徑為25mm，由優(yōu)質(zhì)不銹鋼、厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，柱內(nèi)裝有直徑為510m粒度的固定相（由基質(zhì)和固定液構(gòu)成）。 固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性、 多孔性和比表面積大的特點(diǎn)，加之其表面經(jīng)過機(jī)械涂漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣）， 或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長(zhǎng)度碳鏈的烷基等）或配體的有機(jī)化合物。因此，這類固定相對(duì)結(jié)構(gòu)不

10、同的物質(zhì)有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來。另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)?；|(zhì)粒度小，微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。 這些對(duì)縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度越小，塔板理論數(shù)N就越大，這也進(jìn)一步證明了基質(zhì)粒度小，會(huì)提高分辨率的道理。此外，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60，通過改善傳質(zhì)速度，縮短分析時(shí)間，就可增加層析柱的效率。4檢測(cè)系統(tǒng)高效液相色譜常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器三種。（1）紫外檢測(cè)器該檢測(cè)器適用于對(duì)紫外光（或可

11、見光）有吸收性能樣品的檢測(cè)。其特點(diǎn)是，使用面廣（如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）、 靈敏度高（檢測(cè)下限為10-10gml）、線性范圍寬、對(duì)溫度和流速變化不敏感、可檢測(cè)梯度溶液洗脫的樣品。（2）示差折光檢測(cè)器凡具有與流動(dòng)相折光率不同的樣品組分， 均可使用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。 目前，糖類化合物的檢測(cè)大多使用此檢測(cè)系統(tǒng)。這一系統(tǒng)通用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，但靈敏度低（檢測(cè)下限為10-7gml）， 流動(dòng)相的變化會(huì)引起折光率的變化， 因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測(cè)。（3）熒光檢測(cè)器凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下，其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比。因此，這一檢測(cè)器只適用于具有熒光的有機(jī)化合物（如多環(huán)芳烴、氨基酸