酶失活動(dòng)力學(xué)

1、編輯課件酶的失活動(dòng)力學(xué)酶的失活動(dòng)力學(xué)編輯課件 酶是一種不穩(wěn)定的物質(zhì)，常因溫度，pH等因素的影響而產(chǎn)生不可逆的活力下降。 一般胞外酶較為穩(wěn)定，而胞內(nèi)酶在外部環(huán)境中容易失活。 酶在保存和參與反應(yīng)時(shí)均可能失活；酶在保存過程中的失 活又稱為酶的穩(wěn)定性，失活越快，說明酶的穩(wěn)定性降低。 酶的熱失活熱失活是最重要的一種酶失活形式，下面主要討論此種失活的動(dòng)力學(xué)。編輯課件一、未反應(yīng)時(shí)的熱失活動(dòng)力學(xué)一、未反應(yīng)時(shí)的熱失活動(dòng)力學(xué)測(cè)定酶未反應(yīng)時(shí)的熱失活動(dòng)力學(xué)方法測(cè)定酶未反應(yīng)時(shí)的熱失活動(dòng)力學(xué)方法：在一定條件下，使酶溶液恒溫保持一定時(shí)間，然后在最適宜的pH和溫度下測(cè)定殘存的酶活力，即殘存酶活力。在不同溫度下反復(fù)測(cè)定，即可得

2、到一條曲線。該曲線可以表示酶的失活特性，稱為酶的熱失活曲線酶的熱失活曲線。若改變保溫時(shí)間，則會(huì)得到不同的熱失活曲線（圖1-1)。如果要了解酶在未反應(yīng)時(shí)的失活速率，可將殘存的酶活力對(duì)其失活時(shí)間作圖，則又可得到一條曲線（圖1-2）。編輯課件圖1-1 不同溫度下的酶失活曲線圖1-2 不同時(shí)間下的酶失活曲線這些曲線反應(yīng)了酶的生活規(guī)律。酶的熱變性失活很復(fù)雜，一般將其分為可逆失活與不可逆失活兩類，并提出了多種失活動(dòng)力學(xué)模型。下面主要介紹一步失活模型。編輯課件1.一步失活模型一步失活模型（one step model)式中：式中：E活性酶活性酶D失活酶失活酶kd正反應(yīng)的速率常數(shù)正反應(yīng)的速率常數(shù)kr負(fù)反應(yīng)的速

3、率常數(shù)負(fù)反應(yīng)的速率常數(shù)編輯課件則活性酶的濃度隨時(shí)間的凈減少率或失活反應(yīng)方程式可表示為：DrEdEckckdtdctt系統(tǒng)中酶的總濃度若以cE0表示，則存在下述關(guān)系式： cE0=cEt+cD (a)(b)將式(b)代入式(a)，并利用邊界條件t=0，cE0=cEt積分，經(jīng)整理可得下式：tkkkkkkccrddrrdEEtexp0(c)編輯課件對(duì)不可逆失活反應(yīng)，kr=0,可得 cEt=cE0exp(-kdt) (d)多數(shù)酶的熱失活服從式(d)，kd可稱為一步失活常數(shù)一步失活常數(shù)或衰變常數(shù)衰變常數(shù)，單位為(時(shí)間)-1。kd的倒數(shù)稱為時(shí)間常數(shù)td。當(dāng)cEt為cE0的一半的時(shí)間稱為半半衰期衰期，用t1/

4、2表示。kd、td和t1/2之間的關(guān)系為：21ddtln2t1k編輯課件2.多步失活模型多步失活模型（multi-step model)A 多半串聯(lián)失活模型多半串聯(lián)失活模型：酶的失活經(jīng)歷多步，即DFE。B 同步失活模型同步失活模型：全部酶分子可劃分為熱穩(wěn)定性不同的若干個(gè)組分，每個(gè)組分均符合一步失活模型。該模型全部酶中殘存酶活力的比率為： ktexpxcctiEE0式中：cE0表示酶的初始濃度；xi表示失活速率常數(shù)為ki的酶組分的分率。因此，1ix編輯課件3.溫度對(duì)酶失活的影響溫度對(duì)酶失活的影響 RTEAkdddexp對(duì)一級(jí)失活模型，有失活反應(yīng)Arrihenius方程式中：kd表示衰變常數(shù)；Ad

5、表示失活反應(yīng)Arrihenius方程的前指因子； Ed表示失活反應(yīng)活化能。一般蛋白質(zhì)的變性或失活的活化能為125kJ.mol-1，高于一般化學(xué)反應(yīng)的活化能（2083kJ.mol-1）,這意味著酶失活對(duì)溫度十分敏感。同時(shí)考慮溫度和時(shí)間對(duì)酶失活影響的關(guān)系式 RTEtACCTtAddEEexpexp),(0編輯課件二、反應(yīng)時(shí)的酶熱失活動(dòng)力學(xué)二、反應(yīng)時(shí)的酶熱失活動(dòng)力學(xué)酶在反應(yīng)中的穩(wěn)定性稱為操作穩(wěn)定性操作穩(wěn)定性，可通過分批測(cè)定、連續(xù)測(cè)定及圓二色譜分析等方法測(cè)定。作不同溫度下反應(yīng)轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的變化曲線，即反應(yīng)過程曲線反應(yīng)過程曲線，如圖2-1所示。圖2-1 不同溫度下酶促反應(yīng)過程曲線(a) 以溫度T為參數(shù)，

6、轉(zhuǎn)化率X與時(shí)間t的關(guān)系曲線；(b) 以時(shí)間t為參數(shù)，轉(zhuǎn)化率X與溫度T的關(guān)系曲線編輯課件由圖(a)知時(shí)間一定時(shí)，隨著溫度的升高，反應(yīng)速率增大，因而轉(zhuǎn)化率增大；但當(dāng)溫度高到某一值時(shí)。其轉(zhuǎn)化率反而減少。因?yàn)楫?dāng)溫度升高到某一值時(shí)，酶的熱失活速率也在加速，致使有活力酶的量在減少，因而反應(yīng)速率下降，最終為零。由圖(b)知：對(duì)于某一反應(yīng)時(shí)間，存在一轉(zhuǎn)化率最高的溫度，該溫度稱為最佳溫度最佳溫度。不同的反應(yīng)時(shí)間，有不同的最佳溫度。最佳溫度是溫度對(duì)酶催化速率和酶失活速率雙重作用的結(jié)果。編輯課件就底物濃度的變化對(duì)酶失活的影響，提出了下述模型：從上述機(jī)制看出，無論是游離酶，還是酶的復(fù)合物，均有可能失活，其失活速率方程

7、可表示為:tEsmsmdEccKcKkdtdct式中：121mkkkKsftEEEccc表示底物對(duì)酶失活的影響系數(shù)；cEf表示游離酶濃度。編輯課件根據(jù)上述模型可知：（1）當(dāng)=0時(shí)，反應(yīng)時(shí)酶失活速率達(dá)到最低。從反應(yīng)機(jī)制中可以看出，復(fù)合物ES完全不失活，或者說酶完全被底物所保護(hù)酶完全被底物所保護(hù)。（2）當(dāng)=1時(shí)，反應(yīng)時(shí)與未反應(yīng)時(shí)酶的失活速率完全相同。從反應(yīng)機(jī)制中可以看出，復(fù)合物ES與游離酶E失活速率常數(shù)完全相同，或者說底物對(duì)酶底物對(duì)酶失活沒有影響。失活沒有影響。 （3）01時(shí)，反應(yīng)時(shí)酶失活速率高于未反應(yīng)時(shí)酶失活速率。從反應(yīng)機(jī)制中可以看出，復(fù)合物ES失活速率常數(shù)大于游離酶E，或者說底物加速酶的失活底

8、物加速酶的失活。由上述分析可見，反映了底物對(duì)酶失活速率的影響，因此稱為底物對(duì)酶底物對(duì)酶失活影響系數(shù)失活影響系數(shù)（也稱為穩(wěn)定性影響系數(shù)穩(wěn)定性影響系數(shù)）。編輯課件若只有游離酶失活時(shí)，其分批反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程為對(duì)于零級(jí)不可逆反應(yīng)，cs值趨于無窮大，因此有：對(duì)該式積分，得到ss2mdEsms2scclnkKkccKckdtdc00tE2sckdtdct0E2ssdtckcctt0編輯課件當(dāng)cs值足夠大時(shí)，可簡(jiǎn)化為：tttEdEdEckckdtdc進(jìn)行積分得到：代入式中積分得式中，k2,kd均為溫度的函數(shù)。t)kexp(ccdEE0tct kexp1kckccddE2ss0t0編輯課件三、失活動(dòng)力學(xué)研究實(shí)

9、例三、失活動(dòng)力學(xué)研究實(shí)例 以青蟹N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在甲醛溶液中的失活動(dòng)力學(xué)的研究為例，通過在酶活力測(cè)定體系中加入不同濃度的甲醛，檢測(cè)酶的剩余活力(2-2)。研究顯示酶在甲醛溶液中的失活作用是一種可逆過程。建立失活動(dòng)力學(xué)模型，可以測(cè)定游離酶(E)和結(jié)合酶(ES)的微觀失活速度常數(shù)(表d)。 圖2-2 酶在不同濃度甲醛中的失活作用動(dòng)力學(xué) (a)動(dòng)力學(xué)過程；(b)半對(duì)數(shù)作圖。04代表不同濃度的甲醛編輯課件表d 青蟹N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在甲醛溶液中的失活速度常數(shù)從表d中可以看出，在相同濃度的甲醛溶液中，游離酶的正向微觀失活速度常數(shù)(k+0)是酶底物絡(luò)合物的失活速率常數(shù)(k+0)的35倍，表明游離酶比結(jié)合酶更容