核酸檢測技術及其在國內外血液篩檢中的應用

1、核酸檢測技術及其在國內外血液篩檢中的應用輸血相關傳染病的預防和控制已經(jīng)成為全社會關注的焦點,新技術的引進是進一步提高血液安全性的重要一環(huán)。本文就病原體核酸檢測技術(nucleic acid testing, NAT)及其在國內外血液篩檢中的應用情況和結果作一介紹,并對該方法在我國推廣和應用的必要性和可行性作初步探討。1.NAT在血液篩檢中的必要性酶免檢測(EIA)技術已經(jīng)廣泛運用于血液篩檢,該方法的靈敏度和特異性也在不斷地改進和提高,但每年仍有少數(shù)新發(fā)輸血后肝炎病例報道,如美國無償獻血者每單位供血傳播HBV、HCV和HIV的危險性分別為166000、1103000和16760001。這些危險的

2、主要原因是: 病毒感染者“窗口期”獻血,病毒變異,免疫靜默感染(immuno silent infection)以及人工操作錯誤2。所謂“窗口期”,是指從感染病原開始,直至用某種檢測方法能夠檢測到該病原存在為止的這一段時間3。血清學抗原、抗體檢測的“窗口期”較長, 如HBsAg、抗-HIV、抗-HCV檢測的“窗口期”分別為45-56、22、724,5,故美國90%以上輸血傳播HIV和HBV以及75%以上輸血傳播HCV的危險性來自“窗口期”感染獻血6。EIA“窗口期”漏檢是當前影響血液安全性進一步提高的瓶頸,對于獻血者的篩選,單純抗原或抗體血清學檢測不能有效地保障血液安全。 NAT檢測是直接檢測

3、病原體核酸的一系列技術的總稱。其基本步驟包括核酸提取、擴增、和檢測。NAT敏感性高,可檢出標本中極微量的核酸,在病毒感染后數(shù)天即能檢出,可大大縮短“窗口期”。初步研究表明,混合血樣NAT檢測可將HBV、HCV和HIV感染的平均“窗口期”縮短9d(縮短“窗口期”20%)、59d(82%)和11d(50%)5,7;此外NAT還可以檢出因上述其它3種原因而漏檢的被感染獻血。如法國應用NAT,從大約150萬份獻血中篩檢出4份HCV RNA陽性、抗體陰性的樣本,其中1份即為免疫靜默感染8。盡管NAT從理論上并不能完全消除感染“窗口期”,但病毒核酸轉陽之前的血液傳染性極低,可以有效地預防經(jīng)輸血傳播病毒性疾

4、病9。因此,NAT的引入可使輸血傳播疾病的危險性降到最低10。2.NAT檢測的技術方法1985年具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)的發(fā)明,標志著NAT的誕生。隨后,在PCR的基礎上,派生出許多其它原理的體外NAT方法 11。這些技術靈敏度和特異性或高或低,操作或簡單或復雜,適合在各自不同的領域運用，目前適用于大樣本量血液篩查并能滿足高靈敏度要求的擴證擴增技術主要為PCR技術和TMA技術。2.1PCR擴增方法PCR是一種體外模擬自然DNA復制過程的核酸擴增技術,以其高敏感性、高特異性和快速簡便等優(yōu)勢得到了廣泛的應用。通過簡單的技術改進和聯(lián)

5、合,涌現(xiàn)出了各種各樣不同的PCR方法,如檢測RNA的逆轉錄PCR(RT PCR)、敏感性和特異性均較高的巢式PCR (nested PCR)、可對靶序列進行定量檢測的定量PCR、檢測基因超長分布的多重PCR以及PCR結合酶標技術(PCR ELISA)、PCR結合寡核酸探針雜交技術(PCR SSOP)、熒光PCR和免疫PCR等。目前在臨床檢測中使用較多的是熒光定量PCR,主要用于各種傳染病的診斷、病毒滴度監(jiān)測以及療效評估,因采用熒光標記的探針雜交或直接使用能和雙鏈DNA結合的熒光素檢測PCR擴增產(chǎn)物,進一步提高了檢測的敏感性和特異性。若加入已知濃度的內標或外標,便能進行定量檢測。由于該方法實現(xiàn)了

6、反應體系的全封閉和操作的全自動,不僅減少了污染,還提高了效率。雖然國內許多生物技術企業(yè)已經(jīng)利用熒光PCR方法開發(fā)出成熟的NAT定量檢測產(chǎn)品,如深圳匹基、廣州達安、上海復星、上?？迫A、上海浩源等,但這些產(chǎn)品均只獲得我國食品和藥品監(jiān)督部門的臨床診斷使用許可證。而臨床診斷和血液篩檢是2個不同的應用領域, 血液篩檢對試劑的要求要比臨床診斷高很多。迄今為止正式通過美國FDA認證可用于血液篩檢的試劑僅有2種,即Roche COBAS Ampli Screen HBV/HCV/HIV和 HIV 1/HCV檢測系統(tǒng),FDA評判這些試劑是否能用于血液篩檢的標準之一: 必須對50copies/ml的病毒核酸的檢出

7、率>95%。相當一部分國產(chǎn)熒光定量PCR檢測試劑或許能在某些標本上獲得20copies/ml的靈敏度,但一般都很難滿足95%檢出低病毒載量標本的要求。相信不斷提高檢測靈敏度,早日研發(fā)并注冊成功我國自己的NAT血液篩檢用試劑也是國內生物技術企業(yè)的發(fā)展目標。2.2轉錄介導的擴增方法包括轉錄介導的擴增系統(tǒng)(transcription mediated amplification,TMA)和核酸序列依賴擴增系統(tǒng)(nucleic acidsequence based amplification,NASBA)。TMA是一種利用Money 鼠白血病病毒（MMLV）逆轉錄酶和T7 RNA多聚酶2種酶的共

8、同作用,在等溫條件下來擴增RNA或DNA的反應系統(tǒng),主要擴增原理為: 目標序列在逆轉錄酶作用下,以引物為引導進行逆轉錄, 逆轉錄酶的RNA酶H活性將雜合鏈上的RNA降解以后,合成雙鏈的DNA,并在T7 RNA多聚酶作用下,轉錄出成千上萬個目標RNA序列,這些RNA又可以作為模板進行下一個循環(huán),整個反應是一個自催化過程。NASBA的原理與TMA相似,只是在核酸提取和擴增產(chǎn)物檢測的方法上有所不同。這兩種方法的特異性強,靈敏度高,反應條件簡單,擴增效率高,無需專門的擴增儀器,且因整個反應在1個試管中進行,也減少了污染。2.3 其它NAT技術包括支鏈DNA檢測技術(branched DNA signa

9、l amplification assay,bDNA)、環(huán)介導的等溫擴增技術(loop mediated isothermal amplification,LAMP)、連接酶鏈技術(ligase chain reaction, LCR)和鏈置換擴增(strand displacement amplification,SDA)等。這些技術或因為自身原因,或因為剛研發(fā)出來尚未進入臨床,均未在血液篩檢中應用。如bDNA技術，在1995年左右推出,其信號放大是通過堿性磷酸酶(AP)標記的探針雜交結合到一個樹枝狀核酸枝狀體上而實現(xiàn)的。bDNA技術對待測DNA無擴增,特異性較好,能進行病毒定量檢測,動態(tài)地

10、揭示病毒滴度水平的變化,不僅在預測干擾素療效方面可為臨床提供更為有用的信息,還可作為丙肝病人對干擾素完全應答的標志反應。但也正因為bDNA技術沒有擴增待測核酸,其檢測靈敏度遠遠低于PCR,故該項技術實際上不適合用于血液篩檢,目前國內主要將bDNA技術用于HBV或HCV病毒滴度的定量分析。3.NAT在國內外血液篩檢中的應用3.1 開展NAT檢測的國家及所用的技術NAT是一種新興的檢測方法,許多國家及輸血機構都進行了一系列的研究,在國外特別是一些發(fā)達國家和地區(qū)已普遍應用于血液篩檢12，例如,日本是世界上最早在全國范圍內對血液進行HBV、HCV、HIV NAT篩檢的國家13,新加坡、中國香港也已經(jīng)分

11、別采用不同的方式對血液進行NAT篩檢; 德國和荷蘭從1997年起就開始NAT篩檢的嘗試,英國和法國的部分血站也從2000年起開始了NAT血液篩檢; 美國則從1999年3月開始在FDA新藥審核程序下使用不同的試劑進行常規(guī)血液篩檢。開展NAT檢測的國家及其所采用的技術見表1：表1.開展NAT檢測的國家及所用技術匯總國家或地區(qū)技術混合檢測單檢 Germany德國(1997年起部分,1999年月起，全部） Netherlands荷蘭(1997年起） U.K. 英國(2000年起） Switzerland瑞士 Japan日本(1997年月起對原料漿；1999年初起獻血者） Canada加拿大 USA美國

12、(1999年3月起） New Zealand新西蘭 Australia澳大利亞 Singapore新加坡 Portugal葡萄牙 France法國(2000年起） Spain西班牙 Italy意大利 Hong Kong香港 臺灣（2005年準備中） 韓國（2005年1月起） PCR PCR PCR PCR PCR PCR TMA/PCR TMA TMA TMA TMA TMA / PCR TMA / PCR TMA / PCR TMA TMA / PCR TMA/PCR Pool Pool Pool Pool Pool pool pool/IDT IDT pool / IDT IDT IDT

13、Pool / IDT Pool Pool pool Pool Pool各國采用的技術各不相同（參見表1）。日本使用的方法為羅氏公司與日本紅十字會共同開發(fā)的全自動的Ampli NAT NPX系統(tǒng)（為熒光PCR技術，可同時聯(lián)合檢測HBV,HCV和HIV），目前正在考慮使用Chiron公司的TMA技術;美國ARC和新加坡使用的是Chiron公司的TMA技術;美國血液中心(ABC)系統(tǒng)則使用羅氏COBAS Ampli Screen; 荷蘭及部分歐洲國家將荷蘭阿克蘇公司推出的Nucliesens全自動核酸提取方法同羅氏的COBAS Ampli Screen擴增體系結合起來使用;而英國和法國的部分血站在2

14、000年采用的是Qiagen的全自動核酸提取系統(tǒng)與羅氏的COBAS Ampli Screen擴增體系結合起來的方法, 隨后部分血站又更換成Chiron的TMA技術。各血站根據(jù)自身特色, 正在對各種不同的技術組合進行評估, 目的是尋求一種最適合的NAT技術,既保障血液安全,又能保證血液的及時供給,還要做到省時省力。3.2 國外獻血員中NAT檢測結果從各國公布的NAT檢出的陽性標本資料總結中可以看出,盡管世界發(fā)達國家的血液安全水平已經(jīng)大幅度提高,但是由于EIA“窗口期”所致的漏檢概率仍然有幾百萬分之一、幾十萬分之一甚至幾萬分之一，具體檢測結果見表2。表2國外獻血員中NAT檢測結果匯總國家試劑檢測方

15、式血清學陰性、NAT單獨陽性檢出情況文獻美國Chiron Procleix TMA HIV-1/HCV assay;RocheCobas AmpliScreen HIV-1 and HCV testsChiron: 16人份，TMA, 化學發(fā)光檢測；Roche：24人份混合，PCR-ELISA1999.03-2002.03: HCV NAT+：170/39,721,404，即1/ 23萬；HIV-1 NAT+：12/37,164,054，即1/310萬文獻14 日本Multiplex HBV/HCV/HIV-1 reagent( Roche 與日本共同研制) 1999年7月1日-2000年1月

16、31日，500人份；2002年2月1日起，50人份混樣;合格血液檢測2000.4：HBV NAT+：262560977，即1/9.8萬；HCV NAT+：92560977,即1/28.4萬；HIV-1 NAT+：0256.1萬。2002.12.31：HBV NAT+：308 16012175，即1/5.2萬；HCV NAT+：46 16012175,即1/34.8萬；HIV-1 NAT+：61601217文獻15,16 澳大利亞Chiron Procleix TMA HIV-1/HCV assay; 2個點單人份，3個點16人份，TMA, 化學發(fā)光檢測；2000.-2004：HCV NAT+-

17、：9/4,489,550，即萬；HIV-1 NAT+：1/4,489,5504，即萬4,489,550文獻17及個人交流（文獻18）中歐HCV PCR: Roche Cobas Amplicon; HIV PCR: 自己研制的PCR 96人份混合HCV NAT+：6/360萬，1/60萬；HIV NAT+：2/360萬，1/180萬 文獻19 法國Chiron Procleix TMA HIV-1/HCV；或Roche Cobas Ampliscreen HIV-1 and HCV結合the Organon Nuclisens 核酸提取儀 單檢，或8人份，或16人份,不考慮血清學2001.07

18、-2003.12：HCV NAT+：3/614萬，即1/205萬；HIV NAT+：2/614萬，即1/307萬文獻20 新加坡Chiron Procleix TMA HIV-1/HCV assay; 單人份檢測 .10:HCV NAT+：4304,715,即萬；HIV-1 NAT+：0304,715，即萬個人交流（文獻21）韓國Chiron Procleix TMA HIV-1/HCV assay; 16人份2004，前期評估：單采獻漿者24599，獻血者15597: HCV NAT+：1/40196；HIV NAT陽性：1/40196；2005起，常規(guī)檢測個人交流（文獻22）南非Chiro

19、n Procleix TMA HIV-1/HCV assay; 單人份1999年:HIV NAT+: 2/19709,即1/1.0萬；HCVNAT: 0/19709文獻23 我國核酸篩查技術應用研究情況3.3.1 我國核酸篩查技術應用我國有關NAT血液篩檢研究的報道還比較少見。比較規(guī)范的血液篩檢研究更少，有的單位利用國產(chǎn)PCR試劑加電泳檢測的方法進行檢測，其實驗室交叉污染的問題很難控制。有關我國獻血者及原料漿中NAT檢測工作的情況總結于表3和表4。表3 國內血液中心開展NAT檢測研究的情況單位試劑檢測方式NAT陽性文獻深圳保安區(qū)中心血站美國Biotronics TechHBV,HCV Ampl

20、iSensor試劑盒20人份混合15000rpm離心濃縮，半自動熒光定量PCR檢測HCV NAT+: 1/8805(ALT 390U/L)；HBV NAT+: 抗-HBc陽性中：1/946；單項抗-HBc陽性中：5/495(1)文獻24 廈門血液中心自行設計引物，HCV50人份混合，NucliSensExtractor 提取核酸，NASBA技術，混擴增，ECL 檢測HCV NAT+: 2/10000,即 15000文獻25江蘇省血液中心華美HCV RNA試劑盒單人份，PCR,電泳HCV NAT+: 2/750，即1375文獻26 上海血液中心美國Chiron Procleix HIV-1/HC

21、V8人份或24 人份混合；TMA技術；化學發(fā)光檢測HCV NAT+: 0103539;HIV NAT+: 0103539;文獻7 北京血液中心匹基HCV/HIV-1 熒光PCR核酸檢測試劑24人份混合，26000g離心濃縮，Roche核酸提取柱，熒光PCRHCV NAT+: 0/34373;HIV NAT+: 0/34373文獻27多單位參加的國際合作美國Chiron Procleix HIV/HCV16 人份混合；無菌采血管EDTA抗凝，TEAN自動混樣；TMA技術；化學發(fā)光檢測HCV NAT+：2 /80259 (其中1個ALT 254 IU/ml) HIV NAT +：0/80259文獻

22、28深圳血液中心Roche Ampliscreen HBV/HCV/HIV24人份混合，STAR2000自動混樣;Roche MPLC自動提取 核酸；Roche COBAS Amplicor 擴增和檢測HCV NAT+: 0/16512; HIV NAT+: 0/16512; HBV NAT+: 8/16512,即1/2064文獻29及個人交流(深圳血液中心,王良華，2005年月)沈陽血液中心匹基HCV 熒光PCR核酸檢測試劑24人份混合，26000g離心濃縮，Roche核酸提取柱，熒光PCR萬個人交流(沈陽血液中心，李劍平博士，2005年6月)中山中心血站及蕪湖中心血站廈門長城，無錫三星，上

23、海正業(yè) HCV PCR單人份，PCR,電泳HCV NAT+: 77/28098(1/365)文獻30表4國內原料漿開展NAT檢測研究情況單位試劑檢測方式NAT陽性文獻中國藥品生物制品檢定所匹基HCV/HIV-1 熒光PCR核酸檢測試劑24人份混合，26000g離心濃縮，Roche核酸提取柱，熒光PCRHCV NAT+: 0/19196;HIV NAT+: 0/19196文獻31上海萊士血制品匹基HBV/HCV/HIV-1 熒光PCR核酸檢測試劑48人份混合，26000g離心濃縮，Roche核酸提取柱，熒光PCRHBV NAT+: 1/1401718 (1/140萬);萬) ;萬)文獻32中國藥

24、品生物制品檢定所Chiron Procleix HCV/HIV-1 Assay16人份混合，TMA技術；化學發(fā)光檢測HCV NAT+ : 1/10032;HIV NAT+: 0/10032個人交流（檢定所，白堅石博士，2005年1月） 3.3.2 我國核酸篩查技術應用工作小結：1）NAT檢出率：有限的研究數(shù)據(jù)表明，我國獻血者血液NAT檢出 率HCVNAT+檢出率結果差異很大，從1/365（國產(chǎn)試劑,電泳）萬不等； HIV NAT+檢出率 < 萬；HBV NAT+為 1/946（anti-HBc+ 獻血者中) 1/2088。我國原料漿NAT檢出率：HCV NAT+萬萬; HIV NAT+：

25、萬；HBV NAT+： 1/140萬（48人份混合）。2）必須重視核酸檢測的質量控制體系：² 注重避免交叉污染：n 檢測方法：傳統(tǒng)的電泳檢測為開放式，不適合；n 嚴格的核酸檢測實驗室設置和管理。² 注重試劑質量：為適應血液混樣檢測對靈敏度的要求，一些國產(chǎn)血篩試劑在臨床診斷試劑的基礎上已做樣品處理的改良，靈敏度（如匹基）在考察期間不錯。但仍有待完善，表現(xiàn)在：n 靈敏度、重復性、特異性：進口NAT血篩試劑質量穩(wěn)定，各批質量波動?。粐a(chǎn)試劑批間差異問題；特異性問題。n 內標：進口試劑每個檢測管均有內標，保證陰性結果的可靠性；國產(chǎn)試劑由于尚無法解決加入內標后靈敏度降低的問題，未加內

26、標，因此存在假陰性問題。n 自動化：進口試劑已有配套的檢測系統(tǒng)和軟件，便于大規(guī)模篩查；國產(chǎn)試劑尚在起步階段，尚不能實現(xiàn)自動化，沒有配套軟件。² 標本留樣和處理：也是核酸檢測質量控制體系中的重要環(huán)節(jié)，否則在檢測之前病毒核酸已降解，造成假陰性檢測結果。根據(jù)我們的研究結果，用于NAT檢測的標本應用無菌留樣管采集。4. 血液核酸篩查發(fā)展趨勢4.1 NAT檢測先從原料漿開始實施，再在獻血者中實施:NAT血液篩檢方法總是從血漿制品的原料漿的篩檢開始的,積累了充分的經(jīng)驗后,才逐步應用到血站的采供血系統(tǒng)。例如, 日本從97年11月起在原料漿中進行NAT篩檢，1999年7月在東京都試用于獻血者中33；

27、歐洲醫(yī)療產(chǎn)品規(guī)范委員會(CPMP)規(guī)定從1999年7月起所有的血漿制品的原料、中試產(chǎn)品和最終產(chǎn)品都應進行HCVPCR檢測,當時NAT只在少數(shù)血站進行評估,而大部分血站供血系統(tǒng)至今仍未進行NAT篩檢; 美國早在1994年FDA就曾提出血漿蛋白生產(chǎn)的原料漿必須進行NAT篩檢,而血站系統(tǒng)則從1999年才開始全面進行NAT的可行性評估34。自動化，集中化檢測 以地域為單位建立幾個大型的集中式的NAT血篩中心,既便于質量管理,又能節(jié)省檢測成本。例如,全日本只設3家NAT檢測中心,分區(qū)域對77家血液中心的標本進行HCV、HBV、HIV核酸檢測和分析35。又如美國紅十字會(ARC)在全美成立了3個NAT檢測中心,每天將所有ARC血站采集的血液集中到這3個檢測中心進行NAT檢測,據(jù)測算,盡管血液標本的冷鏈運輸消耗一