IPTG誘導蛋白表達的原理

1、IPTG誘導蛋白表達的原理IPTG誘導的產物是重組后表達載體中的插入序列所能夠翻譯的蛋白，并可視載體構建情況翻譯后續(xù)的標簽序列。用乳糖操縱子作為啟動子進行蛋白質表達的時候，需要誘導物進行誘導（相當于點火）,但乳糖可以被細胞利用掉，所以利用IPTG異丙基-&D-硫代半乳糖昔）在結構上與乳糖的相似性也可以將基因表達啟動，但它不能被細胞利用掉，從而實現(xiàn)持續(xù)的表達.IPTG是一種誘導外源基因表達的誘導劑，它不僅僅如我們學過的作為乳糖的類似物誘導大腸桿菌表達半乳糖昔酶，它是一種普遍應用的誘導劑，能誘導菌種表達多種外源基因。但是它能誘導基因表達的具體原理我卻了解的不是很多，我在網上查到以下一些內容

2、，供查閱者借鑒。最早應用于的表達系統(tǒng)是Lac乳糖操縱子，乳糖的類似物IPTG可以和lacI產物結合，使其構象改變離開lacO，從而激活轉錄.這種可誘導的轉錄調控成為了大腸桿菌表達系統(tǒng)載體構建的常用元件。tac啟動子是trp啟動子和lacUV5的拼接雜合啟動子，且轉錄水平更高，比lacUV5更優(yōu)越。trc啟動子是trp啟動子和lac啟動子的拼合啟動子，同樣具有比trp更高的轉錄效率和受lacI阻遏蛋白調控的強啟動子特性。在常規(guī)的大腸桿菌中，lacI阻遏蛋白表達量不高，僅能滿足細胞白身的lac操縱子，無法應付多拷貝的質粒的需求，導致非誘導條件下較高的本底表達，為了讓表達系統(tǒng)嚴謹調控產物表達，能過量

3、表達lacI阻遏蛋白的lacIq突變菌株常被選為Lac/Tac/trc表達系統(tǒng)的表達菌株。現(xiàn)在的Lac/Tac/trc載體上通常還帶有l(wèi)aclq基因，以表達更多l(xiāng)acI阻遏蛋白實現(xiàn)嚴謹?shù)恼T導調控。IPTG廣泛用于誘導表達系統(tǒng)，但是IPTG有一定毒性，有人認為在制備醫(yī)療目的的重組蛋白并不合適，因而也有用乳糖代替IPTG作為誘導物的研究。另外一種研究方向是用lacI的溫度敏感突變體，30度下抑制轉錄，42度開發(fā)。熱誘導不用添加外來的誘導物，成本低，但是由于發(fā)酵過程中加熱升溫比較慢而影響誘導效果，而且熱誘導本身會導致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會影響產物穩(wěn).T7啟動子是當今大腸桿菌表達系統(tǒng)的

4、主流，這個功能強大兼專一性高的啟動子經過巧妙的設計而成為原核表達的首選，尤其以Novagen公司的pET系統(tǒng)為杰出代表。強大的T7啟動子完全專一受控于T7RNA聚合酶，而高活性的T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍當二者同時存在時，宿主本身基因的轉錄競爭不過T7表達系統(tǒng)，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；誘導表達后僅幾個小時目的蛋白通?？梢哉嫉郊毎偟鞍椎?0%以上。由于大腸桿菌本身不含T7RNA聚合酶，需要將外源的T7RNA聚合酶引入宿主菌，因而T7RNA聚合酶的調控模式就決定了T7系統(tǒng)的調控模式一|一非誘導條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉錄，從而避

5、免目的基因毒性對宿主細胞以及質粒穩(wěn)定性的影響；通過控制誘導條件控制T7RNA聚合酶的量，就可以控制產物表達量，某些情況下可以提高產物的可溶性部分。有幾種方案可用于調控T7RNA聚合酶的合成，從而調控T7表達系統(tǒng).1.噬菌體DE3是lambda噬菌體的衍生株，含有l(wèi)acI抑制基因和位于lacUV5啟動子下的T7RNA聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表達菌株，構建好的表達載體可以直接轉入表達菌株中，誘導調控方式和lac一樣都是IPTG誘導.2.另一種策略是用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白對宿主細胞的潛在毒性而造成的質粒不穩(wěn)定。然后用入

6、CE印筮菌體侵染宿主細胞一一CE6是lambda噬菌體含溫度敏感突變(cI857ts)和pL/pR啟動子控制T7RNA聚合酶的衍生株，在熱誘導條件下可以激活T7RNA聚合酶的合成.此了噬菌體之外，還可以通過共轉化質粒提供T7RNA聚合酶。比如有人用受溶氧濃度控制的啟動子調控T7RNA聚合酶合成，據說這比較適合工業(yè)化發(fā)酵的條件控制.由于T7RNA聚合酶的調控方式仍有可能有痕量的本底表達，控制基礎表達的手段之一是培養(yǎng)基外加葡萄糖，有助于控制本底表達水平。2.是采用帶有T7lac啟動子的載體一一在緊鄰T7啟動子的下游有一段lacI操縱子序列編碼表達lac阻遏蛋白(lacI),lac阻遏蛋白可以作用于宿主染色體上T7RNA聚合酶前的lacUV5啟動子并抑制其表達，也作用于載體T7lac啟動子，以阻斷任何T7RNA聚合酶導致的目的基因轉錄。pLacI工轉化也是同樣的原理.如果這還不夠，更為嚴謹調控手段還有一一在宿主菌中表達另一個可以結合并抑制T7RNA聚合酶的基因一一T7融菌酶，降低本底。常用的帶溶菌酶質粒有pLysS和pLysE,相容的ori都不會影響后繼的表達質粒轉化，前者表達的溶菌酶的水平要比后者低得多，對細胞生長影響小，而pLysE會明顯降低宿主菌的生長水平，容易出現(xiàn)過度調節(jié)，增加蛋白表達的滯后時間，從而降低表達水平通過幾種不同方法來巧妙調控T7聚合酶合成，T7