IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的原理

1、IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的原理IPTG誘導(dǎo)的產(chǎn)物是重組后表達(dá)載體中的插入序列所能夠翻譯的蛋白，并可視載體構(gòu)建情況翻譯后續(xù)的標(biāo)簽序列。用乳糖操縱子作為啟動(dòng)子進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)的時(shí)候，需要誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)（相當(dāng)于點(diǎn)火）,但乳糖可以被細(xì)胞利用掉，所以利用IPTG異丙基-&D-硫代半乳糖昔）在結(jié)構(gòu)上與乳糖的相似性也可以將基因表達(dá)啟動(dòng)，但它不能被細(xì)胞利用掉，從而實(shí)現(xiàn)持續(xù)的表達(dá).IPTG是一種誘導(dǎo)外源基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑，它不僅僅如我們學(xué)過(guò)的作為乳糖的類似物誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)半乳糖昔酶，它是一種普遍應(yīng)用的誘導(dǎo)劑，能誘導(dǎo)菌種表達(dá)多種外源基因。但是它能誘導(dǎo)基因表達(dá)的具體原理我卻了解的不是很多，我在網(wǎng)上查到以下一些內(nèi)容

2、，供查閱者借鑒。最早應(yīng)用于的表達(dá)系統(tǒng)是Lac乳糖操縱子，乳糖的類似物IPTG可以和lacI產(chǎn)物結(jié)合，使其構(gòu)象改變離開lacO，從而激活轉(zhuǎn)錄.這種可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控成為了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)載體構(gòu)建的常用元件。tac啟動(dòng)子是trp啟動(dòng)子和lacUV5的拼接雜合啟動(dòng)子，且轉(zhuǎn)錄水平更高，比lacUV5更優(yōu)越。trc啟動(dòng)子是trp啟動(dòng)子和lac啟動(dòng)子的拼合啟動(dòng)子，同樣具有比trp更高的轉(zhuǎn)錄效率和受lacI阻遏蛋白調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子特性。在常規(guī)的大腸桿菌中，lacI阻遏蛋白表達(dá)量不高，僅能滿足細(xì)胞白身的lac操縱子，無(wú)法應(yīng)付多拷貝的質(zhì)粒的需求，導(dǎo)致非誘導(dǎo)條件下較高的本底表達(dá)，為了讓表達(dá)系統(tǒng)嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控產(chǎn)物表達(dá)，能過(guò)量

3、表達(dá)lacI阻遏蛋白的lacIq突變菌株常被選為L(zhǎng)ac/Tac/trc表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)菌株。現(xiàn)在的Lac/Tac/trc載體上通常還帶有l(wèi)aclq基因，以表達(dá)更多l(xiāng)acI阻遏蛋白實(shí)現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼T導(dǎo)調(diào)控。IPTG廣泛用于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，但是IPTG有一定毒性，有人認(rèn)為在制備醫(yī)療目的的重組蛋白并不合適，因而也有用乳糖代替IPTG作為誘導(dǎo)物的研究。另外一種研究方向是用lacI的溫度敏感突變體，30度下抑制轉(zhuǎn)錄，42度開發(fā)。熱誘導(dǎo)不用添加外來(lái)的誘導(dǎo)物，成本低，但是由于發(fā)酵過(guò)程中加熱升溫比較慢而影響誘導(dǎo)效果，而且熱誘導(dǎo)本身會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會(huì)影響產(chǎn)物穩(wěn).T7啟動(dòng)子是當(dāng)今大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的

4、主流，這個(gè)功能強(qiáng)大兼專一性高的啟動(dòng)子經(jīng)過(guò)巧妙的設(shè)計(jì)而成為原核表達(dá)的首選，尤其以Novagen公司的pET系統(tǒng)為杰出代表。強(qiáng)大的T7啟動(dòng)子完全專一受控于T7RNA聚合酶，而高活性的T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍當(dāng)二者同時(shí)存在時(shí)，宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競(jìng)爭(zhēng)不過(guò)T7表達(dá)系統(tǒng)，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾個(gè)小時(shí)目的蛋白通?？梢哉嫉郊?xì)胞總蛋白的50%以上。由于大腸桿菌本身不含T7RNA聚合酶，需要將外源的T7RNA聚合酶引入宿主菌，因而T7RNA聚合酶的調(diào)控模式就決定了T7系統(tǒng)的調(diào)控模式一|一非誘導(dǎo)條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉(zhuǎn)錄，從而避

5、免目的基因毒性對(duì)宿主細(xì)胞以及質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響；通過(guò)控制誘導(dǎo)條件控制T7RNA聚合酶的量，就可以控制產(chǎn)物表達(dá)量，某些情況下可以提高產(chǎn)物的可溶性部分。有幾種方案可用于調(diào)控T7RNA聚合酶的合成，從而調(diào)控T7表達(dá)系統(tǒng).1.噬菌體DE3是lambda噬菌體的衍生株，含有l(wèi)acI抑制基因和位于lacUV5啟動(dòng)子下的T7RNA聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表達(dá)菌株，構(gòu)建好的表達(dá)載體可以直接轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株中，誘導(dǎo)調(diào)控方式和lac一樣都是IPTG誘導(dǎo).2.另一種策略是用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的潛在毒性而造成的質(zhì)粒不穩(wěn)定。然后用入

6、CE印筮菌體侵染宿主細(xì)胞一一CE6是lambda噬菌體含溫度敏感突變(cI857ts)和pL/pR啟動(dòng)子控制T7RNA聚合酶的衍生株，在熱誘導(dǎo)條件下可以激活T7RNA聚合酶的合成.此了噬菌體之外，還可以通過(guò)共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒提供T7RNA聚合酶。比如有人用受溶氧濃度控制的啟動(dòng)子調(diào)控T7RNA聚合酶合成，據(jù)說(shuō)這比較適合工業(yè)化發(fā)酵的條件控制.由于T7RNA聚合酶的調(diào)控方式仍有可能有痕量的本底表達(dá)，控制基礎(chǔ)表達(dá)的手段之一是培養(yǎng)基外加葡萄糖，有助于控制本底表達(dá)水平。2.是采用帶有T7lac啟動(dòng)子的載體一一在緊鄰T7啟動(dòng)子的下游有一段lacI操縱子序列編碼表達(dá)lac阻遏蛋白(lacI),lac阻遏蛋白可以作用于宿主染色體上T7RNA聚合酶前的lacUV5啟動(dòng)子并抑制其表達(dá)，也作用于載體T7lac啟動(dòng)子，以阻斷任何T7RNA聚合酶導(dǎo)致的目的基因轉(zhuǎn)錄。pLacI工轉(zhuǎn)化也是同樣的原理.如果這還不夠，更為嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控手段還有一一在宿主菌中表達(dá)另一個(gè)可以結(jié)合并抑制T7RNA聚合酶的基因一一T7融菌酶，降低本底。常用的帶溶菌酶質(zhì)粒有pLysS和pLysE,相容的ori都不會(huì)影響后繼的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，前者表達(dá)的溶菌酶的水平要比后者低得多，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響小，而pLysE會(huì)明顯降低宿主菌的生長(zhǎng)水平，容易出現(xiàn)過(guò)度調(diào)節(jié)，增加蛋白表達(dá)的滯后時(shí)間，從而降低表達(dá)水平通過(guò)幾種不同方法來(lái)巧妙調(diào)控T7聚合酶合成，T7