早期干預(yù)對宮內(nèi)感染致腦損傷仔鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的影響

1、早期干預(yù)對宮內(nèi)感染致腦損傷仔鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的影響【摘要】目的研究早期干預(yù)對宮內(nèi)感染致腦損傷新生大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞原位增殖能力的影響。方法30只孕17d大鼠連續(xù)2d腹腔注射脂多糖(450g/kg)，設(shè)為脂多糖組,制備宮內(nèi)感染腦損傷動物模型，生理鹽水組6只注射等量生理鹽水。將脂多糖組所產(chǎn)足月新生仔鼠用隨機數(shù)字表法分為損傷組和訓(xùn)練組，生理鹽水組所產(chǎn)仔鼠為對照組，每組各30只。對訓(xùn)練組進(jìn)行早期干預(yù)至日齡28d,對照組、損傷組常規(guī)飼養(yǎng);選取1，3，7，14，28d各組仔鼠用免疫組織化學(xué)方法動態(tài)檢測海馬齒狀回顆粒層，BrdU陽性細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果(1)出生后1d對照組、訓(xùn)練組、損傷組新生大鼠海馬齒狀

2、回顆粒層均存在BrdU，對照組顯著高于訓(xùn)練組、損傷組(P0.01)。(2)對照組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)3d開始增加，7d達(dá)到高峰，14d后下降，28d接近正常成年大鼠水平。(3)早期豐富環(huán)境刺激后，訓(xùn)練組大鼠海馬齒狀回顆粒層BrdU陽性細(xì)胞數(shù)在3d開始增加，14d達(dá)高峰，峰值顯著高于對照組水平(P0.01)，28d后下降，但仍高于對照組，BrdU陽性細(xì)胞數(shù)在時間上均呈一過性增高表達(dá)。結(jié)論宮內(nèi)感染致大鼠腦損傷可導(dǎo)致內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力降低，并較長時間內(nèi)難以自然恢復(fù);早期干預(yù)可激活腦損傷鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞原位增殖能力，推遲高峰出現(xiàn)，延長作用“時間窗”?！娟P(guān)鍵詞】腦損傷;宮內(nèi)感染;神經(jīng)膠質(zhì)增生;干預(yù)

3、;大鼠;動物，實驗【Abstract】ObjectiveTostudytheimpactofearlyinterventiononproliferationofneuralstemcellsinbraindamageratsafterintrauterineinfection.MethodsTotally36Wistarpregnantratswererandomlydividedintotwogroups:LPS(n=30)andsaline(n=6).PregnantratswereconsecutivelyinjectedwithLPS(450g/kg)orsalineongestati

4、on17d.SalineneonatalratswererandomlyselectedassalinegroupN(n=30),LPSneonatalratastraininggroupT(n=30)andinjurygroupI(n=30).The1dTgroupratswereinterferedbyearlyinterventiont.Atthesametime,theN,Igroupratswerefedintheroutineway.Theexpressionofbromodeoxyuridind(BrdU)weredeterminedbyimmunohistochemistrya

5、t1，7，14，28dofallgroups.BrdUwasusedtomarkdividingneuralstemcells(NSCs)inhippocampdentategyrussubgranularzone(SGZ).Results(1)BrdUlabeledcellscouldbeobservedinallgroups;IgroupsandTgroupsweremarkedlylessthanNgroup(P0.01).(2)ThenumberofpositivecellsofNgroupincreasedat3day(P0.05),approximatelysixfoldwitha

6、peakat7day,markedlydecreasedat28dayandapprochednormallevelofmaturerats.(3)ComparedwiththeNgroup,thenumberofpositivecellsofTgroupincreasedstrikinglyat3day(P0.01),exceedingNgroupandapproximatelysixfoldwithapeakat14day,thengraduallydecreased,butstillhigherthanNgroupat28day.Theappearanceofincreasingpeak

7、inTgroupwaslengthened，valueascended.ConclusionsOurresultsindicatethatthebraindamagecausedbyintrauterineinfectioncanleadtothedecreaseofproliferationofinherentNSCs.Thedamagewillnotrecoveritself.EarlyinterventioncanstimulatetheproliferationofinherentNSCs.Earlyperiodenrichedenvironmentcanprolongthedevel

8、opmentwindowphaseofinherentNSCs.【Keywords】Braindamage;Intrauterineinfection;Glialproliferation;Intervention;Rat;Animal，experiment神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells,NSCs)在一定病理條件和干預(yù)作用下可以增殖、分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，參與修復(fù)缺損的神經(jīng)功能1。腦性癱瘓(簡稱腦癱)是指出生前到出生后發(fā)育時期非進(jìn)行性腦損傷所致綜合征，是繼小兒麻痹后兒童肢體嚴(yán)重殘疾的主要疾病之一，孕期感染所致的腦損傷是腦癱的高危因素2。因此,探討宮內(nèi)感染致腦損傷的發(fā)生機制，控

9、制病情發(fā)展已經(jīng)成為當(dāng)前研究中的重點。本研究旨在觀察早期干預(yù)對宮內(nèi)感染致腦損傷后內(nèi)源性NSCs的反應(yīng)過程，為腦損傷后機體自我修復(fù)提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1實驗動物與試劑清潔級成熟Wistar大鼠60只，雌性40只，雄性20只，體質(zhì)量180240g，由佳木斯大學(xué)實驗動物中心提供。脂多糖(脂多糖血清型055：B5，美國SIGMA公司)。5BrdU免疫組織化學(xué)試劑盒(北京博奧森生物工程有限公司)。1.2動物模型制備與分組運用李曉捷等3所建的宮內(nèi)感染致腦損傷動物模型，將研究對象常規(guī)飼養(yǎng),飲食自由,明暗周期12h/12h,室溫(183)。于下午17時以21合籠,次日上午8時查陰道涂片,查到精子記為妊

10、娠0d,孕鼠另籠飼養(yǎng)。隨機數(shù)字表法選取孕鼠分為脂多糖組30只和生理鹽水組6只。脂多糖組孕17d大鼠連續(xù)2d腹腔注射脂多糖,劑量為每次450g/kg;生理鹽水組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。觀察兩組大鼠的分娩時間,孕22d前分娩的仔鼠為早產(chǎn)鼠,去除早產(chǎn)鼠。仔鼠出生后，取胎盤做蘇木精伊紅染色觀察宮內(nèi)感染情況。將脂多糖組所產(chǎn)足月新生仔鼠用隨機數(shù)字表法分為損傷組、訓(xùn)練組，生理鹽水組所產(chǎn)仔鼠為對照組，每組各30只。設(shè)生后1，3，7，14，28d5個時間點，每個時間點6只，測定BrdU水平變化，進(jìn)一步分析探討早期干預(yù)對腦損傷內(nèi)源性NSCs增殖能力的影響機制。1.3早期干預(yù)方法對照組和損傷組分別飼養(yǎng)于20cm3

11、0cm45cm標(biāo)準(zhǔn)籠內(nèi)，不予早期干預(yù)。1.4BrdU標(biāo)記和染色1.5BrdU免疫組織化學(xué)結(jié)果判定光鏡(1020)下以細(xì)胞核內(nèi)有棕褐色或棕黃色顆粒且密度不均者為BrdU陽性細(xì)胞，觀察陽性細(xì)胞在腦內(nèi)分布情況;在顯微鏡400倍視野下計數(shù)陽性細(xì)胞,共計數(shù)5個視野,取其平均值。計算機圖像分析系統(tǒng)軟件(Imagemacro4.0)計數(shù)腦損傷后不同時間段海馬齒狀回顆粒層陽性細(xì)胞。1.6統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)以s表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計。兩樣本均數(shù)兩兩比較采用LSDt檢驗，多樣本均數(shù)兩兩比較采用q檢驗。檢驗水準(zhǔn)取=0.05。2結(jié)果2.1各組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)變化結(jié)果BrdU定位于細(xì)胞核，為棕色顆

12、粒狀，標(biāo)記的是全部的新生細(xì)胞，訓(xùn)練組、損傷組、對照組大鼠海馬齒狀回顆粒層周邊均存在BrdU陽性細(xì)胞，對照組出生1d大鼠的數(shù)量較多，排列較為規(guī)律，顯著高于損傷組及訓(xùn)練組(P0.01);損傷組及訓(xùn)練組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量稀少，無明顯差異。見圖1。2.2對照組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)各時間點變化結(jié)果對照組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)在出生3d開始增加，7d達(dá)到高峰，14d后下降，28d接近正常成年大鼠水平。見表1。2.3早期干預(yù)后各時間點各組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)變化結(jié)果早期干預(yù)后，訓(xùn)練組大鼠海馬齒狀回顆粒層BrdU陽性細(xì)胞數(shù)在3d開始增加，14d達(dá)高峰，峰值顯著高于對照組水平(P0.01)，28d后下降，但仍高于對照

13、組，BrdU陽性細(xì)胞數(shù)在時間上均呈一過性增高表達(dá)。見表1。表1各時間點各組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)變化注：與對照組比較，aP0.05，bP0.01;與訓(xùn)練組比較，cP0.05，dP0.01。3討論近年來隨著圍產(chǎn)技術(shù)的迅猛發(fā)展,未成熟兒的成活率大大提高,早產(chǎn)、低出生體重兒致腦癱呈上升趨勢6。腦癱的主要病理類型包括：腦室周圍白質(zhì)軟化、腦室周圍白質(zhì)出血及梗死,以前者更為多見2，目前的研究亦著重于此。然而，雖然對可能導(dǎo)致腦癱的腦損傷患兒采取了積極的干預(yù)處理，腦癱的發(fā)生率仍然較高。NSCs具有自我更新，定向遷移，分化成神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的潛能，可參與修復(fù)缺損的神經(jīng)功能。在發(fā)育和成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在著

14、NSCs7，前腦室下帶、海馬齒狀回顆粒層是最具代表性的區(qū)域。大部分NSCs在體內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)，損傷等病理條件可激發(fā)NSCs增殖，以彌補神經(jīng)功能和組織學(xué)喪失，這顯示NSCs可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后自我修復(fù)中有潛在的治療作用8。3.1宮內(nèi)感染對新生大鼠BrdU陽性細(xì)胞的影響B(tài)rdU是一種胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，在細(xì)胞增殖周期的S期嵌入細(xì)胞核的DNA，因而BrdU陽性細(xì)胞被看作具有增殖活性的細(xì)胞，是內(nèi)源性NSCs增殖的標(biāo)記物9。本實驗發(fā)現(xiàn)，3組新生鼠在任何時間點海馬齒狀回顆粒層均存在BrdU陽性細(xì)胞，對照組BrdU陽性細(xì)胞在生后逐漸增多，2周左右達(dá)高峰，隨后開始減少，到生后4周明顯減少，呈現(xiàn)出胎齡越

15、大，BrdU陽性細(xì)胞越少的趨勢，這與文獻(xiàn)10的研究結(jié)果相一致。損傷組及訓(xùn)練組在未干預(yù)前BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目少于對照組，且損傷組各時間點BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目均低于對照組，峰值低平。此結(jié)果與駱健明等11新生大鼠急性缺血缺氧性腦病模型內(nèi)源性NSCs數(shù)目一過性上升不同，可能是由于本實驗與前者急性損傷性質(zhì)不同，宮內(nèi)感染致腦損傷是仔鼠胎齡晚期受到的慢性損傷，腦內(nèi)微環(huán)境的改變，各種起調(diào)控作用的神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏或改變引起調(diào)控干細(xì)胞分化功能障礙;腦發(fā)育過程中膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育障礙而導(dǎo)致“腳手架”引導(dǎo)功能的紊亂等原因，導(dǎo)致了NSCs和少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞受到破壞而數(shù)量不足。出生后，隨未受損NSCs增殖發(fā)育，脫離不良的

16、宮內(nèi)環(huán)境及各種外界環(huán)境的刺激，仔鼠BrdU陽性細(xì)胞在一定程度和一定時間內(nèi)上升，體現(xiàn)了新生腦神經(jīng)系統(tǒng)可塑性。本實驗結(jié)果與Levison等12幼鼠腦癱模型結(jié)果相似，Levison等通過對新生鼠進(jìn)行缺氧缺血的處理，形成幼鼠腦癱模型，觀察到腦癱鼠腦組織中少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞及NSCs在一過性缺氧缺血后受到的影響是一個慢性的過程，NSCs數(shù)目減少，且在較長時間內(nèi)難以自然恢復(fù)。由于NSCs與室周白質(zhì)相關(guān)，破壞NSCs有可能導(dǎo)致室周白質(zhì)再生困難，同時導(dǎo)致神經(jīng)元的增生及分化障礙以及髓鞘的形成障礙，繼而出現(xiàn)腦癱13。這樣可以解釋產(chǎn)前因素和不明因素所導(dǎo)致的腦癱患兒腦室周圍白質(zhì)軟化及囊泡化的現(xiàn)象，繼而出現(xiàn)永久性損傷并

17、伴以特殊性的神經(jīng)肌肉體征的原因。3.2早期干預(yù)對宮內(nèi)感染致腦損傷仔鼠內(nèi)源性NSCs影響早期干預(yù)是通過有組織有目的的豐富環(huán)境(視覺、觸覺、嗅覺、味覺、聽覺等各方面豐富的環(huán)境刺激)來減少發(fā)育期腦損傷及神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，促進(jìn)腦損傷康復(fù)的一種手段。大量研究證明生后早期暴露于豐富環(huán)境，給予多感覺刺激可使運動皮質(zhì)和視覺皮質(zhì)樹突長度增加及分支增多，并使腦組織代謝增強、腦血流變化及結(jié)構(gòu)發(fā)生改變;腦癱大鼠肌力、興奮性、環(huán)境適應(yīng)能力、記憶能力明顯增強，達(dá)到正常化水平;平衡能力、協(xié)調(diào)能力、學(xué)習(xí)能力得到明顯增強，可以顯著改善腦癱大鼠預(yù)后，降低傷殘發(fā)生率4。早期干預(yù)促進(jìn)宮內(nèi)感染致腦損傷動物NSCs增殖的機制可能是通過改變

18、腦內(nèi)影響干細(xì)胞生存的微環(huán)境，如調(diào)節(jié)眾多神經(jīng)營養(yǎng)因子或激素的分泌等，從而進(jìn)一步激活處于靜止?fàn)顟B(tài)的干細(xì)胞1。眾多研究已經(jīng)表明，早期干預(yù)能刺激腦損傷大鼠的熱休克蛋白70陽性神經(jīng)元明顯增加，熱休克蛋白70是大腦對不良刺激的反應(yīng)性蛋白，它可以保護(hù)腦梗死灶周邊區(qū)(半暗帶)的神經(jīng)元，同時也保護(hù)了遷移至該區(qū)的NSCs，以防其受自由基、興奮性氨基酸的損傷5。同時神經(jīng)生長因子/營養(yǎng)因子，遷移相關(guān)蛋白如神經(jīng)肽Y、神經(jīng)營養(yǎng)因子3、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、表皮細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子1、神經(jīng)生長因子受體(Trk)、reelin蛋白的合成也明顯增強14。這些因子對干細(xì)胞增生、分化潛能的激發(fā)具有重要的作用。如往實驗動物的

19、紋狀體、側(cè)腦室等部位灌注外源性的生長因子能明顯促進(jìn)內(nèi)源性NSCs的增殖、分化和遷移15。此外，早期干預(yù)還有促進(jìn)降鈣素基因相關(guān)肽、一氧化氮等血管舒張因子的合成和釋放改善腦血管循環(huán)，減輕腦細(xì)胞缺氧，抑制傷灶局部炎癥反應(yīng)，改善大腦電生理活動等功效，這些條件的變化也會進(jìn)一步影響NSCs的增殖分化16。Johansson等17的研究結(jié)果也證實了該觀點，他們發(fā)現(xiàn)豐富環(huán)境可以促進(jìn)腦缺血大鼠前腦室下帶NSCs的增殖。本研究結(jié)果提示早期干預(yù)在降低宮內(nèi)感染所致腦癱神經(jīng)組織再生方面有積極的作用，可能是腦損傷大鼠運動和學(xué)習(xí)能力恢復(fù)的重要機制之一，也為宮內(nèi)感染所致新生兒腦損傷康復(fù)提供一種有效治療手段。【參考文獻(xiàn)】1Su

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