大腸菌群檢驗(yàn)操作規(guī)程

1、大腸菌群計數(shù)檢驗(yàn)操作規(guī)程頒發(fā)部門質(zhì)量部新訂哦訂友審口頁數(shù)共2頁文件性質(zhì)管理標(biāo)準(zhǔn)峨作標(biāo)準(zhǔn)口技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)口文件編碼原編編碼起草年月日審核年月日批準(zhǔn)年月日QC年月日執(zhí)行日期年月日分發(fā)部門質(zhì)量管理部、QC一、目的建立大腸菌群計數(shù)檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，使操作過程規(guī)范化。二、適用范圍適用于大腸菌群計數(shù)的檢驗(yàn)操作。三、職責(zé)1 .檢驗(yàn)人員嚴(yán)格按檢驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行檢驗(yàn)。2 .QC主管監(jiān)督檢查執(zhí)行情況。四、程序1 .范圍本方法適用于大腸菌群計數(shù)（coliforms）的測定2 .術(shù)語和定義2.1 大腸菌群：在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。3 .設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)

2、設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：3.1 恒溫培養(yǎng)箱：36C±1C,30C±1CO3.2 冰箱：2c5C。3.3 恒溫水浴箱：46C±TCo3.4 天平：感量為0.1g。3.5 均質(zhì)器。3.6 振蕩器。3.7 無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸3.8 無菌錐形瓶：容量500mL03.9 無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。3.10 pH計或pH比色管或精密pH試紙。3.11 菌落計數(shù)器。4 .培養(yǎng)基和試劑中A.1oA.24.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白陳(LaurylSulfateTryptose,LST)肉湯：見附錄A4.2 煌綠乳糖

3、膽鹽(BrilliantGreenLactoseBile,BGLB)肉湯：見附錄A中4.3 磷酸鹽緩沖液：見附錄A中A.3o4.4 無菌生理鹽水：見附錄A中A.4。4.5 無菌1mol/LNaOH:見附錄A中A.5。4.6 無菌1mol/LHCl:見附錄A中A.6。5才僉驗(yàn)程序大腸菌群MPN計數(shù)的檢驗(yàn)程序見圖1圖1大腸菌群MPN計數(shù)法檢驗(yàn)程序6.操作步驟樣品的稀釋固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min10000r/min均質(zhì)1min2min,或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min2min,制成1:1

4、0的樣品勻液。液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。樣品勻液的pH值應(yīng)在6.57.5之間，必要時分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)節(jié)。用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL

5、無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。初發(fā)酵試驗(yàn)每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白陳（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL,則用雙料LST肉湯），36C±1C培養(yǎng)24h±2h,觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24h±2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h,產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36C±1C培養(yǎng)4

6、8h土2h,觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報告按6.3確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表，報告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。附錄A（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑附錄A.1月桂基硫酸鹽胰蛋白陳（LST）肉湯A.1.1成分20.0g5.0g5.0g2.75g2.75g0.1g1000mLpH。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL胰蛋白陳或胰酪陳氯化鈉乳糖磷酸氫二鉀（K2HPO4）磷酸二氫鉀（KH2PO4）月桂基硫酸鈉蒸儲水pH6.8±0.2A.1.2制法將上述成分溶解于蒸儲水中，調(diào)節(jié)121C高壓滅菌15min。A.2煌綠乳糖膽鹽（B

7、GLG）肉湯A.2.1成分10.0g10.0g200mL13.3mL800mL蛋白陳乳糖牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液0.1%煌綠水溶液蒸儲水pH7.2±0.1A.2.2制法將蛋白陳、乳糖溶于約500mL蒸儲水中，加入牛膽粉溶液200mL（將20.0g脫水牛膽粉溶于200mL蒸儲水中，調(diào)節(jié)pH至7.07.5）,用蒸儲水稀釋到975mL,調(diào)節(jié)pH,再加入0.1%煌綠水溶液13.3mL,用蒸儲水補(bǔ)足到1000mL,用棉花過濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL。121C高壓滅菌15min。A.3磷酸鹽緩沖液A.3.1成分磷酸二氫鉀（KH2P。4）34.0g蒸儲水500mLpH7.2A.3.2制法貯存液：稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸儲水中，用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH,用蒸儲水稀釋至1000mL后貯存于冰箱。稀釋液：取貯存液1.25mL,用蒸儲水稀釋至1000mL,分裝于適宜容器中，121c高壓滅菌15min。A.4無菌生理鹽水A.4.1成分氯化鈉8.5g蒸儲水1000mLA.4.2制法：稱取8.5g氯化鈉溶于1000mL蒸儲水中，121c高壓滅菌15min。A.51mol/LNaOHA.5.1成分NaOH40.0g蒸儲水1000mLA