多糖各種提取方法

1、共享知識(shí)分享快樂(lè)一、植物多糖的提取1 溶劑提取法11 水提法水對(duì)植物組織的穿透力強(qiáng)，提取效率高，在生產(chǎn)上使用安全、經(jīng)濟(jì)。用水作溶劑來(lái)提取多糖時(shí)， 可以用熱水浸煮提取， 也可以用冷水浸提。 一般植物多糖提取采用熱水浸提法， 該法所得多糖提取液可直接或離心除去小溶物； 或者利用多糖不溶于高濃度乙醇的性質(zhì)， 沉淀提純多糖； 但由于不同性質(zhì)或不同相對(duì)分子質(zhì)量的多糖沉淀所需乙醇濃度不同， 它也可以用于樣品中不同多糖組分的分級(jí)分離； 還可按多糖不同性質(zhì)在粗分階段利用混合溶劑提取法對(duì)植物中不同的多糖進(jìn)行分離；其中，以乙醇沉淀最為普遍。但以根莖為主的植物體 ,細(xì)胞壁多糖含量高 ,熱水直接提取率不高。此時(shí)為破壞

2、細(xì)胞壁 ,增加多糖的溶出，有兩種處理方法 :一為酶解 ,二為弱堿溶解。12 酸堿提法有些多糖適合用稀酸提取， 并且能得到更高的提取率。 但酸提法只在一些特定的植物多糖提取中占有優(yōu)勢(shì)， 目前報(bào)道的并不多。 而且即使有優(yōu)勢(shì)， 在操作上還應(yīng)嚴(yán)格控制酸度，因?yàn)樗嵝詶l件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂。有些多糖在堿液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。采用的稀堿多位為 01mol L 氫氧化鈉、氫氧化鉀，為防止多糖降解，常通以氮?dú)饣蚣尤肱饸浠c或硼氫化鉀。 同樣，堿提優(yōu)勢(shì)也是因多糖類(lèi)的不同而異。 與酸提類(lèi)似，堿提中堿的濃度也應(yīng)得到有效控制， 因?yàn)橛行┒嗵窃趬A性較強(qiáng)時(shí)會(huì)水解。另外，稀酸、稀

3、堿提取液應(yīng)迅速中和或迅速透析，濃縮與醇析而獲得多糖沉淀。14 生物酶提取法酶技術(shù)是近年來(lái)廣泛應(yīng)用到有效成份提取中的一項(xiàng)生物技術(shù)， 在多糖的提取過(guò)程中，使用酶可降低提取條件， 在比較溫和的條件中分解植物組織， 加速多糖的釋放或提取。此外，使用酶還可分解提取液中淀粉、果膠、蛋白質(zhì)等的產(chǎn)物，常用的酶有蛋白酶，纖維素酶，果膠酶等。15 超聲提取法超聲波是一種高頻率的機(jī)械波，其主要原理是利用超聲波產(chǎn)生的 “空化作用 ”對(duì)細(xì)胞膜的破壞，有利用植物有效成分的釋放， 而且超聲波能形成強(qiáng)大的沖擊波或高速射流，有效地減小、消除與水相之間的阻滯層，加大了傳質(zhì)效率，有助于溶質(zhì)的擴(kuò)散。另外，超聲波的熱效應(yīng)使水溫基本在5

4、7，對(duì)原料有水浴作用。超聲AAAAAAAA共享知識(shí)分享快樂(lè)波提取與傳統(tǒng)的提取方法相比，有提取效率高、時(shí)間短、耗能低等優(yōu)點(diǎn)。超聲提取的影響因素有：超聲時(shí)間、超聲頻率（一般低頻中提取效率高， 但也有例外）、料液比和溫度等。16 微波提取微波是頻率介于 300MHz 和 300GHz 之間的非電離電磁波，微波提取的原理是微射線(xiàn)輻射于溶劑并透過(guò)細(xì)胞壁到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部， 由于溶劑及細(xì)胞液吸收微波能細(xì)胞內(nèi)部溫度升高，壓力增大，當(dāng)壓力超過(guò)細(xì)胞壁的承受能力時(shí)，細(xì)胞壁破裂，位于細(xì)胞內(nèi)部的有效成份從細(xì)胞中釋放出來(lái)， 傳遞轉(zhuǎn)移到溶劑周?chē)蝗軇┤芙狻?微波技術(shù)應(yīng)用于植物細(xì)胞破壁，有效地提高了收率。具有穿透力強(qiáng)、選擇性高、

5、加熱效率高等特點(diǎn)。 影響微波浸提的主要因素為浸提時(shí)間、 樣品和提取溶劑的含水量，溶劑的介電常數(shù)和電導(dǎo)率（介電常數(shù)和電導(dǎo)率的溶劑對(duì)微波的吸收較好）、微波功率等。 但是由于微波泄漏對(duì)操作者影響很大， 因而對(duì)設(shè)備的要求較高， 這對(duì)微波的研究及應(yīng)用帶來(lái)了一定的困難。二、植物多糖的分離純化在多糖提取物中，常會(huì)有無(wú)機(jī)鹽、蛋白質(zhì)、色素及小分子物質(zhì)等雜質(zhì)，必須分別除去一般是先脫除非多糖組分，再對(duì)多糖組分進(jìn)行分級(jí)21 除蛋白除蛋白質(zhì)時(shí)一般選擇能使蛋白質(zhì)沉淀而不使多糖沉淀的試劑來(lái)處理， 如酚、三氯乙酸、鞣酸等。但必須處理時(shí)間短， 溫度低，避免多糖降解。 Sevage 法（氯仿：戊醇 /丁醇 =4：1）和三氟三氯乙

6、烷法在避免降解上有較好效果但要達(dá)到除盡游離蛋白質(zhì)的目的仍需反復(fù)處理。 如能加入蛋白質(zhì)水解酶， 使蛋白質(zhì)大分子進(jìn)行一定程度的降解，再用 Sevage 法處理，一般效果更好。為了避免使用有機(jī)溶劑也可采用反復(fù)凍融的方法除蛋白，將多糖液濃縮后，一20 室溫反復(fù)凍融 78 次，離心除去蛋白質(zhì)。另外，蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小，用氫氧化鈣飽和液調(diào) pH10 pH11 可除去偏堿性的蛋白質(zhì)，然后再用硫酸調(diào) pH5 pH6 ，可除去偏酸性的蛋白質(zhì)。 凍融和等電點(diǎn)沉淀除蛋白質(zhì)操作簡(jiǎn)單，但多糖液里往往有低濃度的蛋白質(zhì)殘留，應(yīng)與其它方法結(jié)合使用。22 脫色植物多糖提取物中含有酚類(lèi)化合物而使其顏色較深，可用吸附劑 (

7、纖維素、硅藻土、活性炭等 )、離子交換柱 (DEAE 一纖維素 )、氧化劑 (H2O2) 等脫除?；钚蕴緼AAAAAAA共享知識(shí)分享快樂(lè)比表面積大，吸附能力強(qiáng)，在進(jìn)行當(dāng)歸多糖的提取時(shí)只向多糖液中加入了 01左右的活性炭，煮沸后濾過(guò)即完成了脫色操作。 此法成本低廉，適合工業(yè)化生產(chǎn)。23 除小分子雜質(zhì)小分子雜質(zhì)如低聚寡糖的殘留往往影響多糖的生物活性，需要進(jìn)一步脫除， 提高純度。傳統(tǒng)的方法是透析法，該法操作簡(jiǎn)單、技術(shù)成熟，但周期長(zhǎng)，往往需要2一 3 天，常溫下操作有可能造成多糖的霉變， 必要時(shí)需加入少量防腐劑或需在低溫條件下進(jìn)行。 隨著膜分離技術(shù)的發(fā)展， 纖維濾器透析法已經(jīng)發(fā)展起來(lái)了， 它利用不同孔

8、徑的膜使大小不同的分子分級(jí)， 這種方式可縮短生產(chǎn)周期， 而且條件溫和，無(wú)疑是多糖脫除雜質(zhì)的一條新途徑。24多糖的分級(jí)純化采用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物，分級(jí)的方法可達(dá)到純化的目的可按溶解性不同進(jìn)行分級(jí)、按分子大小和形狀分級(jí) (如分級(jí)沉淀、超濾、分子篩、層析等 )，也可按分子所帶基團(tuán)的性質(zhì)分級(jí)241 按溶解性不同分離分步沉淀法分步沉淀法是根據(jù)不同多糖在不同濃度低級(jí)醇、 酮中具有不同溶解度的性質(zhì)， 從小到大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮進(jìn)行分步沉淀鹽析法鹽析法是根據(jù)不同多糖在不同鹽濃度中溶解度不同而將其分離的一種方法。 常用的鹽析劑有氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨等，其中以硫酸銨最佳。按電離性質(zhì)不同

9、分離季胺鹽沉淀法季胺氫氧化物是一類(lèi)乳化劑， 能與酸性多糖形成不溶性化合物季銨絡(luò)合物， 此絡(luò)合物在低離子強(qiáng)度的水溶液中不溶解而產(chǎn)生沉淀。 若提高多糖液 pH 值或加入硼砂緩沖液，也可使中性多糖沉淀分離。 常用季銨鹽有十六烷基三甲基季銨鹽的溴化物及其氫氧化物和十六烷基吡啶。243柱層析法凝膠柱層析法AAAAAAAA共享知識(shí)分享快樂(lè)凝膠柱層析法常用的凝膠有葡聚糖凝膠 (Sephadex) 和瓊脂糖凝膠 (Sepharose) ，以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑， 從而使不同大小的多糖分子得到分離純化，但不適宜粘多糖的分離。纖維素陰離子交換劑柱層析法纖維素陰離子交換劑柱層析法常用的交換劑為 DE

10、AE 一纖維素和 ECTEOLA 一纖維素，分類(lèi)硼砂型和堿型兩種，洗脫劑可用不同濃度堿溶液、硼砂溶液、鹽溶液，其優(yōu)點(diǎn)可吸附雜質(zhì)、 純化多糖，并適用于分離各種酸性、 中性多糖和粘多糖。如百合多糖、北沙參多糖、太子參多糖等?；钚蕴恐鶎游龇ɑ钚蕴课搅看?、 效率高，是分離水溶性物質(zhì)的常用吸附劑。 柱層析時(shí)活性炭中常拌入等量的硅藻土作稀釋劑， 以增加溶液的流速。 糖溶液上柱后先用水洗脫無(wú)機(jī)鹽、單糖等再依次增加乙醇濃度進(jìn)行洗脫。離子交換柱層析和普通凝膠柱層析聯(lián)用法有些植物的多糖成分復(fù)雜， 除中性多糖外， 還含有糖醛酸等， 因此往往兩種不同性質(zhì)的色譜柱聯(lián)用才能得到單一多糖組分。三種層析柱聯(lián)用采用離子交換葡

11、聚糖凝膠柱、 丙烯葡聚糖凝膠柱和葡聚糖凝膠柱三者聯(lián)用， 即先進(jìn)行 DEAE SephadexA 柱層析，用蒸餾水洗脫。水洗組分進(jìn)一步用 SephacrylS 柱層析，得到主要組分再用 SephadexG 一 100 柱層析，有時(shí)會(huì)有較高的得率。三、多糖的純度鑒定經(jīng)過(guò)分級(jí)純化的多糖在測(cè)定結(jié)構(gòu)前須進(jìn)行純度鑒定 而且多糖的純度不能用通?；衔锏募兌葮?biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量， 因?yàn)榧幢闶嵌嗵羌兤罚?其微觀(guān)也并不均一， 僅代表相似鏈長(zhǎng)的多糖分子的平均分布， 通常所謂的多糖純品也只是一定相對(duì)分子質(zhì)量范圍的多糖的均一組分 目前常用于多糖純度的鑒定方法有： 高效液相、凝膠層析法、電泳法、色譜法、旋光度法等四、常見(jiàn)問(wèn)題AAAAAAAA共享知識(shí)分享快樂(lè)多糖制備過(guò)程中蛋白質(zhì)的脫除是目前分離純化多糖的難點(diǎn)。 Sevag 法需要消耗大量的有機(jī)溶劑， 且操作煩瑣； 三