新人教版生物選修1課題2《多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增dna片段》教學(xué)設(shè)計(jì)二(精品).doc

1、多聚酶鏈?zhǔn)椒错憯U(kuò)增DNA片段【課題目標(biāo)】本課題通過(guò)嘗試PCRDNA多聚酶鏈?zhǔn)椒错懠夹g(shù)的根本操作,使學(xué)生體驗(yàn)PCR這一常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,理解PCR的原理,討論P(yáng)CR的應(yīng)用【課題重點(diǎn)與難點(diǎn)】課題重點(diǎn)：PCR的原理和PCR的根本操作.課題難點(diǎn)：PCR的原理.導(dǎo)學(xué)誘思1 .PCR原理填寫(xiě)以下表格參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈合成子鏈的原料DNA聚合酶引物DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?通常將DNA的羥基末端稱(chēng)為,而磷酸基團(tuán)的末端稱(chēng)為.DNA聚合酶不能開(kāi)始合成DNA,而只能,因此,DNA復(fù)制需要引物.DNA的合成方向總是0在DNA的復(fù)制過(guò)程中,復(fù)制的前提是.在體外可通過(guò)限制來(lái)實(shí)現(xiàn).在

2、的溫度范圍內(nèi),DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體,雙鏈分開(kāi),這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為.PCR利用了DNA的原理,通過(guò)限制溫度來(lái)限制雙鏈的解聚與結(jié)合.由于PCR過(guò)程的溫度高,導(dǎo)致DNA聚合酶失活,后來(lái)的DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用,大大增加了PCR的效率.PCR反響需要在一定的緩沖溶液中提,同時(shí)通過(guò)限制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行.2 .PCR的反響過(guò)程PCR一般要經(jīng)歷循環(huán),每次循環(huán)可以分為、和三步.從第二輪循環(huán)開(kāi)始,上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反響,并且由延伸而成的DNA單鏈會(huì)與結(jié)合,進(jìn)行DNA的延伸,這樣,DNA聚合酶只能,使這段固定長(zhǎng)度的序列成指數(shù)擴(kuò)增.3 .實(shí)驗(yàn)操作在實(shí)驗(yàn)室中,做PCR通常使用,它是一種薄壁塑

3、料管.具體操作時(shí),用微量移液器,按PCR反響體系的配方在中依次參加各組分,再參照下表的設(shè)置設(shè)計(jì)好PCR儀的循環(huán)程序即可.4 .操作提示為預(yù)防外源DNA等因素的污染,PCR實(shí)驗(yàn)中使用的、以及蒸儲(chǔ)水等在使用前必須進(jìn)行oPCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份,并在儲(chǔ)存.使用前,將所需試劑從冰箱拿出,放在冰塊上緩慢融化.在微量離心管中添加反響成分時(shí),移液管上的槍頭要.疑難點(diǎn)撥1. PCR技術(shù)簡(jiǎn)介PCR是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù),它能以極少量的DNA為模板,在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝.這項(xiàng)技術(shù)有效地解決了由于樣品中DNA含量太低而難以對(duì)樣品進(jìn)行分析研究的問(wèn)題,被廣泛的應(yīng)用于遺傳疾病的診斷、

4、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測(cè)定等各方面.2. 細(xì)胞內(nèi)參與DNA復(fù)制的各種組成成分及其作用解旋酶：翻開(kāi)DNA雙鏈DNA母鏈：提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核甘酸：合成子鏈的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子鏈引物：使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開(kāi)始連接脫氧核甘酸引物是一小段DNA或RNA,它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì).用于PCR的引物長(zhǎng)度通常為2030個(gè)核甘酸3. DNA的合成方向DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?通常將DNA的羥基末端稱(chēng)為3端,而磷酸基團(tuán)的末端稱(chēng)為5,端.DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA,而只能從3,端延伸DNA鏈,因此,DNA復(fù)制需要引物.當(dāng)引物與

5、DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后,DNA聚合酶就能從引物的3'端開(kāi)始延伸DNA鏈,DNA的合成方向總是從子鏈的5,端向3端延伸.4. PCR的反響過(guò)程PCR一般要經(jīng)歷三十屢次循環(huán),每次循環(huán)可以分為變性當(dāng)溫度上升到90oC以上時(shí),雙鏈DNA解聚為單鏈、復(fù)性溫度下降到50oC左右,兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合和延伸溫度上升到72oC左右,溶液中的四種脫氧核甘酸在DNA聚合酶的作用下,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原那么合成新的DNA鏈三步.從第二輪循環(huán)開(kāi)始,上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反響,并且由引物I延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物II結(jié)合,進(jìn)行DNA的延伸,這樣,DNA聚合酶只能特異的

6、復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列,使這段固定長(zhǎng)度的序列成指數(shù)擴(kuò)增.5. PCR技術(shù)與DNA的復(fù)制PCR反響是通過(guò)限制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行.PCR反響的實(shí)質(zhì)就是DNA復(fù)制,所以有關(guān)PCR反響的題目與DNA復(fù)制的原理相同,計(jì)算方法也大體相同.例如：PCR反響中的目的片段一般以2n的方式積累,其中n為反應(yīng)循環(huán)次數(shù).一個(gè)DNA片段在30次循環(huán)后反響物中大約有10億個(gè)這樣的片段.230典例解析一個(gè)由15N標(biāo)記的DNA分子,放在沒(méi)有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng),利用PCR循環(huán)5次后標(biāo)記的DNA分子總數(shù)的A1/10B1/5C1/16D1/25答案：C解析：一個(gè)DNA分子利用PCR技術(shù)循環(huán)5次后產(chǎn)生的DNA分子

7、數(shù)目為2n.而DNA的復(fù)制是半保存復(fù)制,其特點(diǎn)是：新形成的DNA雙鏈,一條是來(lái)自親代DNA分子的母鏈,另一條是新形成的子鏈.這樣最初由15N標(biāo)記的DNA分子復(fù)制后,其標(biāo)記的兩條鏈就分別進(jìn)入兩個(gè)子代DNA分子中,這樣兩個(gè)子代DNA分子被標(biāo)記了.以后均是在沒(méi)有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng),不管經(jīng)過(guò)多少次復(fù)制,最初標(biāo)記的兩條鏈?zhǔn)冀K存在于兩個(gè)DNA分子中,這樣經(jīng)過(guò)n次循環(huán)后,標(biāo)記的DNA分子中2/2n,即1/2n-1.【課本問(wèn)題答案和提示】練習(xí)1 .提示：繪圖可參考教科書(shū)中圖5-9.PCR反響中的目的片段一般以2n的方式積累,其中n為反響循環(huán)次數(shù).一個(gè)DNA片段在30次循環(huán)后反響物中大約有10億個(gè)這樣的片段2n=

8、230=1073741824.2 .提示：PCR引物是根據(jù)需要擴(kuò)增的目標(biāo)DNA的堿基序列來(lái)設(shè)計(jì)的.引物的設(shè)計(jì)需要豐富的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn),感興趣的學(xué)生可以參考?分子克隆實(shí)驗(yàn)指南?見(jiàn)本專(zhuān)題參考書(shū)目,書(shū)中有詳盡的論述.【參考資料】1.瓊脂糖凝膠濃度與DNA別離范圍的關(guān)系凝膠濃度要依據(jù)DNA分子的大小來(lái)確定.編碼雙歧桿菌16srRNA的DNA片段大小約為1500個(gè)核甘酸的長(zhǎng)度,因此根據(jù)表4-1選用1%1g/100mL,下同的凝膠濃度.表4-1瓊脂糖凝膠濃度與DNA別離范圍的關(guān)系瓊脂糖凝膠濃度線型DNA分子的別離范圍千堿基對(duì),kb0.35600.61200.70.810網(wǎng)0.90.571.20.961

9、.50.2312.00.122.核酸電泳緩沖液核酸電泳緩沖液有三種,分別是Tris一硼酸(TBE)、Tris一乙酸(TAE)和Tris一磷酸(TPE).在上述三種緩沖液中：TBE與TPE緩沖液容量高,對(duì)DNA的別離效果好,但TPE液中含磷酸鹽的濃度偏高,容易使DNA沉淀.TAE液的緩沖容量低,價(jià)格較廉價(jià).本實(shí)驗(yàn)選用的是TBE緩沖液.緩沖液中的EDTA可螯合正價(jià)陽(yáng)離子,從而抑制DNA酶的活性,預(yù)防PCR產(chǎn)物被降解.10倍濃縮的TBE緩沖液配方如下.Tris108gEDTA9.3g硼酸55g將上述物質(zhì)溶解后,用蒸儲(chǔ)水定容至1000mL,調(diào)節(jié)pH為8.08.2備用,使用時(shí)需稀釋10倍.3 .核酸電泳

10、的指示劑與染色劑核酸電泳常用的指示劑是澳酚藍(lán),澳酚藍(lán)在堿性條件下呈藍(lán)紫色.指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液.載樣緩沖液的作用是：能夠增加樣品密度,保證DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)；能夠在電泳中形成肉眼可見(jiàn)的藍(lán)紫色指示帶,從而幫助預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置；能夠使樣品呈現(xiàn)藍(lán)紫色,使加樣操作更方便.核酸電泳后,需要染色才能在紫外線下觀察到帶型.最常用的染色方法是澳化乙錠染色法.澳化乙錠(EB)是一種熒光染料,有劇毒,因此操作時(shí)要非常小心.EB可嵌入DNA雙鏈的堿基對(duì)之間,在紫外線激發(fā)下,能發(fā)出紅色熒光.染色的方法有兩種.一種是在凝膠電泳液中參加EB,使其終濃度為0.5gmL;種是在電泳后

11、,將凝膠浸入0.5pg/mL的EB溶液中,染色1015min.當(dāng)凝膠染色過(guò)深時(shí),可以將凝膠放入蒸儲(chǔ)水中浸泡30min后再觀察.4 .PCR的常見(jiàn)問(wèn)題PCR實(shí)驗(yàn)很容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果.出現(xiàn)假陰性結(jié)果的常見(jiàn)原因有：TaqDNA聚合酶活力不夠或其活性受到抑制；引物設(shè)計(jì)不合理；提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過(guò)關(guān)以及PCR系統(tǒng)的建立欠妥當(dāng)；循環(huán)次數(shù).不夠；等等.當(dāng)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性的情況時(shí),應(yīng)首先在原來(lái)擴(kuò)增的產(chǎn)物中再參加TaqDNA聚合酶,并增加510次循環(huán).為了預(yù)防假陰性結(jié)果的出現(xiàn),在選用TaqDNA.聚合酶時(shí),要注意用活力高、質(zhì)量好的酶.同時(shí),在提取DNA模板時(shí),應(yīng)特別注意預(yù)防提取物中含有抑制酶活性的污染物,如酚、氯仿等的存在.盡管TaqDNA聚合酶對(duì)模板純度的要求不高,但也不允許有機(jī)試劑的污染.PCR擴(kuò)增的先決條件以及特異性的上下,很大程度上取決于引物與靶DNA的互補(bǔ)情況,尤其需要保證引物的3'端與靶基因互補(bǔ).PCR技術(shù)高度靈敏,極其微量的靶基因污染都會(huì)造成非目標(biāo)DNA片段的大量擴(kuò)增,因此模板DNA的污染是PCR假陽(yáng)性結(jié)果的主要原因.止匕外,樣品中存在靶基因的同源序列也可能造成假陽(yáng)性結(jié)果.為了預(yù)防因污染而造成的假陽(yáng)性結(jié)果,PCR操作時(shí)要注意做到：隔離操作區(qū),分裝試劑,簡(jiǎn)化操作程序,使用一次性吸頭等【教學(xué)反思