2022年哮喘豚鼠氣道重構(gòu)中基質(zhì)金屬蛋白酶(精)

1、哮喘豚鼠氣道重構(gòu)中基質(zhì)金屬蛋白酶     王光芒，金發(fā)光，楚東嶺，段麗【關(guān)鍵詞】  哮喘；氣道重構(gòu)；明膠酶B；金屬蛋白酶1組織抑制劑    【Abstract】 AIM:  To investigate  the roles  of matrix metalloproteinase9  (MMP9)  and tissue inhibitor of metalloproteinase1 (TIMP1) in airway remodeling of asthmari

2、c guinea  pigs. METHODS:  Guinea pigs  were sensitized with ovalbumin conjuncted with Al(OH)3， and subsequently challenged repeatedly with  ovalbumin  aerosol. The guinea  pigs  were  randomly divided into the control group，asthmatic 4, 6, 8week groups. The ex

3、pressions of MMP9  and  TIMP1  in bronchi and lung tissues were observed by immunohistochemistry  combined with the microimage analysisThe levels of MMP9 mRNA  and TIMP1 mRNA  were determined by  semiquantitative PCR. RESULTS:  After  repeated allergen ch

4、allenge, smooth  muscle  hyperplasia  was obvious  in guinea pig bronchiExpression levels of MMP9  and  TIMP1 in the epithelial cells of bronchi were significantly higher in asthmatic animals  than those of control group The expression of MMP9  in asthmatic gu

5、inea pigs  lung tissues was  0.52±0.05 in 4week  group, 0.74±0.05 in 6week group, 0.48±0.04 in 8week group , 0.21±0.04 in control group  P<0.05. The expression of  TIMP1 in asthmatic guinea  pigs lung tissues was 0.36±0.04  in 4week grou

6、p,0.83±0.05 in  6week  group, 0.97±0.05  in  8week  group , 0.20±0.02  in control group  P<0.05. The results of immunocytochemistry  were consistent with those of RTPCR. The upregulation of MMP9 expression become  slower than TIMP1 since

7、 the 4th week in  asthmatic animals. So ratio of MMP9/ TIMP1  was decreased. CONCLUSION:  The expression levels of MMP9  and  TIMP1 were closely correlated  with asthma airway remodeling, and the ratio of MMP9/ TIMP1  may reflecte the degree of asthma airway remode

8、ling.    【Keywords】 asthma;  airway remodeling; gelatinase B;  tissue inhibitor of  metalloproteinase1    【摘要】 目的： 探討哮喘豚鼠模型中基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs及其組織抑制因子(TIMP)在哮喘氣道重構(gòu)發(fā)病中的作用. 方法： 重復(fù)霧化吸人卵蛋白建立豚鼠哮喘氣道重構(gòu)模型. 實驗分為對照組、哮喘激發(fā)4, 6 和8 wk組. 免疫組化方法結(jié)合顯微圖像分析檢測MMP9, TIMP1的表達(dá). 半定量PCR檢

9、測MMP9及TIMP1mRNA水平. 結(jié)果：  哮喘各組動物均出現(xiàn)管壁增厚、平滑肌增生等氣道重構(gòu)的特征性改變. 哮喘豚鼠MMP9的mRNA表達(dá)：哮喘4 wk組為0.52±0.05，哮喘6 wk組為0.74±0.05；哮喘8 wk組為0.48±0.04；對照組    為0.21±0.04；哮喘各組與對照組組間比擬差異有統(tǒng)計學(xué)意義P<0.05). 哮喘豚鼠TIMP1的mRNA水平： 哮喘4 wk組為0.36±0.04；哮喘6 wk組為0.83±0.05；哮喘8 wk組為0.97

10、77;0.05；對照組為0.20±0.02；哮喘各組與對照組組間比擬差異有統(tǒng)計學(xué)意義P<0.05. 免疫組化的結(jié)果和RTPCR的結(jié)果一致. 在哮喘各時段組中，MMP9的表達(dá)增高自第4 wk時明顯變緩，而TIMP1仍持續(xù)增高，導(dǎo)致MMP9/ TIMP1比例下降. 結(jié)論： 哮喘的氣道重構(gòu)與MMP9 和TIMP1的表達(dá)密切相關(guān)，而二者的比例可能反映氣道重構(gòu)的嚴(yán)重程度.    【關(guān)鍵詞】 哮喘；氣道重構(gòu)；明膠酶B；金屬蛋白酶1組織抑制劑    氣道重構(gòu)是氣道反復(fù)炎癥損傷與修復(fù)的結(jié)果，是造成哮喘患者不可逆氣道阻塞的病理生理根底，

11、主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)extracellular  matrix,  ECM的沉積、基底膜增厚、氣道平滑肌增生和肥厚等改變. 其中ECM在氣道壁沉積過多是引起氣道壁纖維化和氣流阻塞的主要原因之一1. 正常ECM的合成與降解處于一個動態(tài)平衡之中，基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases, MMP9)與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP1平衡是維持ECM內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的決定因素2. 本實驗通過復(fù)制豚鼠哮喘模型,利用免疫組化和RTPCR方法測量不同階段哮喘豚鼠模型肺中MMP9及TIM

12、P1含量變化,并了解MMPs/TIMP在哮喘發(fā)病中的作用.    1材料和方法    1.1材料卵蛋白、結(jié)合生物素的羊抗兔IgG血清、ABC復(fù)合物均購自美國Sigma公司；兔抗TIMP1抗體、兔抗MMP9抗體購自武漢博士德公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；Taq酶購自日本Promega公司；MMP9和TIMP1上下游引物由北京奧科公司合成；402型超聲霧化吸入器購自上海合力醫(yī)療器械廠；PTC100型PCR儀為美國BioRab公司產(chǎn)品；雄性豚鼠32只，體質(zhì)量200250 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)試驗動物中心提供.

13、0;   1.2方法     1.2.1動物分組及模型制備實驗動物隨機(jī)分為對照組和哮喘4， 6和8 wk組，每組8只. 各哮喘組于第1日腹腔注射卵蛋白(含等量氫氧化鋁凝膠)0.1 mg，1 wk后霧化吸人10 g/L濃度的卵蛋白溶液激發(fā)哮喘，隔日1次，每次20 min，根據(jù)分組分別激發(fā)4，6和8 wk. 第1次激發(fā)后豚鼠即開場喘息，表現(xiàn)為呼吸加深加快，肋間隙凹陷，哮喘發(fā)作嚴(yán)重者可出現(xiàn)窒息；喘息后即將動物移出瓶外，喘息可持續(xù)30 min，甚至更長；對照組同樣于第1日腹腔注射生理鹽水0.9 mg，1 wk后將動物置于半封閉玻璃罩內(nèi)霧化吸人生理鹽水約

14、20 min，隔日1次，霧化吸入生理鹽水8 wk.    122動物模型肺組織取材、固定、切片各組模型于末次激發(fā)48 h后以戊巴比妥鈉腹腔注射40 mg/kg麻醉豚鼠，開胸留取豚鼠左肺置于液氮中速凍，-70保存?zhèn)溆?，?jīng)肺動脈灌注100 mL生理鹽水,繼以新配制的40 g/L多聚甲醛PBs0.1 mol/L，pH 7.4600 mL持續(xù)灌注90 min,并將右肺取下后固定24 h,入200 g/L蔗糖+含氟PB溶液中，4過夜至標(biāo)本下沉，OCT包埋，恒冷箱切片機(jī)連續(xù)切片厚15 m，-20保存?zhèn)溆?    123免疫組化染色肺組織切片貼于載

15、玻片上,室溫枯燥30 min后,以0.01 mol/L  KPBS(pH 7.4)浸洗,經(jīng)800 mL/L甲醇+30 mL/L H2O2封閉15 min，KPBS浸洗3次×10 min,切片入兔抗MMP9血清(1100)室溫孵育24 h. KPBS浸洗3次×10 min，入結(jié)合生物素的羊抗兔IgG血清(1500),室溫孵育2 h，KPBS浸洗3次×10 min,入ABC復(fù)合物(1500)室溫孵育2 h，葡萄糖氧化酶DAB硫酸鎳胺法顯色. 顯色反響終止后，常規(guī)脫水,中性樹膠封片. 同樣方法利用兔抗TIMP1染色切片. 每張切片在顯微鏡下隨機(jī)選取5個支氣管，

16、以棕黃色顆粒在胞質(zhì)的沉積為陽性. 圖像分析各支氣管細(xì)胞染色的平均密度以代表MMP9, TIMP1的表達(dá)強(qiáng)度.124MP9及TIMP1半定量PCR用Trizol試劑提取備用肺組織總RNA；合成cDNA；半定量PCR反響體系：Taq酶33.34 nkat， Buffer 2 L，dNTP (10 mol/L)1 L，MMP9上游引物(5AAGGATGGTCTACTGGCACA3)10 mol/L， 05 L，MMP9下游引物(5GAAGATGAATGGAAATACGC3, 10 mol/L，0.5 L，模板1 L，總反響體積20 L. 反響條件：94 1 min；56 45 s；72 1 min，

17、35個循環(huán). TIMP1引物：上游5ACAGCTTTCTGCAACTCG3，下游5CTATAGGTCTTTACGAAGGCC3，PCR產(chǎn)物長度為364 bp；條件：98，變性10 min，然后再94變性1 min，61 退火50 s，72 延伸1 min，共35個循環(huán)，最后，72延伸10 min. PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后采用凝膠成像分析系統(tǒng)讀取其灰度值.         統(tǒng)計學(xué)處理：  各組間數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)展統(tǒng)計分析，采用ONEWAY ANOVA分析，組間兩兩比擬采

18、用SNKq檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.     2結(jié)果    2.1哮喘動物模型的制作本實驗中對照組豚鼠每次霧化吸人生理鹽水均未見動物發(fā)生哮喘；各哮喘組第1次霧化吸人卵蛋白溶液可見哮喘發(fā)作，約激發(fā)3次可見明顯哮喘發(fā)作，哮喘發(fā)作重者甚至可窒息致死.    2.2組織病理學(xué)改變各組豚鼠肺組織冰凍切片光鏡下見：哮喘各組細(xì)支氣管上皮變性，細(xì)胞脫落，支氣管黏膜皺襞增多，肺泡隔增厚明顯，并隨著激發(fā)時間的增長逐漸增厚，在哮喘8 wk組表現(xiàn)最為明顯. 對照組豚鼠肺組織支氣管及肺泡構(gòu)造正常(圖1).

19、0;   2.3MMP9及TIMP1在豚鼠模型肺組織的表達(dá)結(jié)果顯示，哮喘各組與對照組比擬差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中MMP9的表達(dá)6 wk組高于4 wk組和8 wk組(P<0.05)，4 wk組和8 wk組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05). 在TIMP1的表達(dá)中，8 wk組均高于6 wk組和4 wk組(P<0.01)，6 wk組那么高于4 wk組(P<0.01)，而MMP9/TIMP1那么隨著哮喘激發(fā)時間的加長也明顯下降表1.     2.4豚鼠模型肺組織中MMP9和TIMP1 mRNA的表達(dá)水平由

20、表2可見，MMP9的表達(dá)哮喘各組均高于正常對照組(P<0.01)，6 wk組高于4 wk組和8 wk組(P<0.01)，4 wk組和8 wk組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05). 在TIMP1的表達(dá)中，哮喘各組高于對照組(P<0.01)，8 wk組高于6 wk 組和 4 wk組(P<0.05)，6 wk組那么高于4 wk組(P<0.01).    A：對照組；B：激發(fā)4 wk組；C：激發(fā)6 wk組； D：激發(fā)8 wk組. 圖1各組豚鼠氣道的HE染色結(jié)果×200表1各組豚鼠支氣管MMP9, TIMP1免疫組化結(jié)果及M

21、MP9/TIMP1比值變化(n=8, x±s)表2各組豚鼠支氣管MMP9, TIMP1 mRNA表達(dá)及MMP9/TIMP1比值變化(n=8,  x±s)    3討論    長期以來，人們認(rèn)為氣道重建的發(fā)生是在慢性炎癥根底上逐漸進(jìn)展的3. MMPs是調(diào)節(jié)ECM 代謝的主要限速酶,并在組織細(xì)胞的分化、維持正常組織構(gòu)造、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管形成、創(chuàng)傷的愈合、炎癥反響等多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用. 所有的MMPs中，MMP9和哮喘關(guān)系最密切4. MMP9能降解多種ECM成分，TIMP1是 MMP9的特異性抑制

22、劑. 在安康個體，MMP9和TIMP1以11的比例共同釋放. 而在哮喘發(fā)作時痰液中測得MMP9/ TIMP1比值增高5，說明在哮喘氣道重構(gòu)過程中，MMPs/TIMP表達(dá)失衡可能起到更為重要作用. 本實驗觀察發(fā)現(xiàn)，各哮喘組均存在氣道重建，并且隨著激發(fā)時間加長，豚鼠支氣管平滑肌厚度增厚，氣道重建的表現(xiàn)更加明顯. 哮喘發(fā)作時，MMP9升高，降解ECM，有利于炎癥細(xì)胞遷移至炎癥局部，同時MMP9降解的基質(zhì)片斷具有對炎癥細(xì)胞的趨化作用，促進(jìn)炎癥的進(jìn)一步開展；當(dāng)MMP9過度表達(dá)的同時，TIMP1也隨之升高以具有抑制MMP9的作用，并抑制ECM 的降解，而TIMP1的相對于MMP9的過度升高，最終導(dǎo)致MMPs/ TIMPs 比例平衡失調(diào),細(xì)胞外基質(zhì)代謝紊亂,促進(jìn)氣道重建的發(fā)生和開展. 而在這個過程中，MMP9和TIMP1之間變化決定氣道重建的具體過程. MMP9/TIMP1比例可以作為一種顯示哮喘氣道組織破壞和修復(fù)之間平衡的標(biāo)志6. 目前的研究結(jié)合本試驗的結(jié)果，都證實該聯(lián)系的存在. 由此可見，MMP9及TIMP1在不同時期的過度表達(dá)以及二者表達(dá)的比例失衡，是支氣管哮喘氣道炎癥與重構(gòu)的重要