大腦中動脈缺血再灌注大鼠腦組織PAR1表達(dá)與炎癥反應(yīng)的關(guān)系

1、.DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減大腦中動脈缺血再灌注大鼠腦組織PAR1表達(dá)與炎癥反應(yīng)的關(guān)系（作者:_單位: _郵編: _）作者：周青珍， 王華梅， 吳家冪【摘要】 目的:研究腦缺血再灌注（CIR）后腦組織中蛋白酶激活受體1(PAR1）的表達(dá)及其與炎癥反應(yīng)的關(guān)系。 方法:40只雄性SD大鼠線栓法建立大腦中動脈栓塞（MCAO）模型，再灌注后于3 、6 、12 h及1 、2 、3 、7 d取腦，免疫組化法和腦組織勻漿法檢測PAR1、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的含量。 結(jié)果:缺血再灌注后腦組織PAR1表達(dá)增加（P0.01），MDA含量增多（P0.01），SOD活性降低（P0.01

2、）；PAR1表達(dá)與MDA含量正相關(guān)（r1=0.844,P0.05），與SOD含量負(fù)相關(guān)（r2=-0.901,P0.01）。 結(jié)論:CIR后PAR1表達(dá)增多可加重腦組織炎性反應(yīng)。 【關(guān)鍵詞】 大腦中動脈;栓塞；蛋白酶激活受體1Abstract: Objective To investigate the correlation between proteaseactivated receptor1(PAR1) expression and inflammatory reaction of brain tissue after cerebral ischemia reperfusion(CIR).M

3、ethods Fourty SD rats were randomly divided into eight groups:sham group,CIR3 h,CIR6 h,CIR12 h,CIR1 d,CIR2 d, CIR3 d,and CIR7 d group(n=5).To establish middle cerebral artery occlusion(MCAO) model with Longa methods.At the indicated timepoint,the rat was sacrificed and its brain was removed.PAR1 was

4、 detected with immunohistochemistry,SOD and MDA contents in brain homogenate were measured.Results Compared with sham group,PAR1 expression was increased obviously（P0.01）.Contents of MDA were increased with the time of CIR prolonged（P0.01）,and there was positive correlation between PAR1 expression a

5、nd MDA content（r1=0.844,P0.05）,but SOD activity was decreased（P0.01）,and negatively correlated with PAR1 expression（r2=-0.901,P0.01）. Conclusion Increased PAR1 expression may aggravate inflammatory reaction of brain tissue in rats after CIR with MCAO.Key words: Middle cerebral artery;Occlusion;Prote

6、aseactivated receptor1近年來研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞的聚集、黏附和浸潤，以及炎性因子的大量產(chǎn)生是缺血再灌注損傷的重要因素2。腦缺血再灌注（cerebral ischemia reperfusion,CIR）后中性粒細(xì)胞在凝血酶作用下趨化于缺血組織周圍，通過激活蛋白酶激活受體-1（proteaseactivated receptor1,PAR1）導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，刺激小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和增生3，促進(jìn)炎癥因子表達(dá)，活化的白細(xì)胞釋放自由基，引起腦缺血后腦組織損害。本實(shí)驗(yàn)通過建立大腦中動脈栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型,了解C

7、IR后腦組織中PAR1表達(dá)與代表自由基水平的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）之間的相關(guān)性， 以探討PAR1在CIR后腦組織炎癥反應(yīng)中的作用。1 材料和方法1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組健康雄性SD大鼠40只，體重270320 g(南京青龍山實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖中心提供），隨機(jī)分為8組：假手術(shù)組，缺血再灌注3 、6 、12 h及1 、2 、3 、7 d組（n=5）。1.2 腦缺血再灌注模型的制備選用日本產(chǎn)釣魚尼龍線，直徑0.2 mm，每段長4 cm，頭端燒成杵狀備用。參照Zea Longa報道的線栓法1建立大鼠大腦中動脈栓塞MC

8、AO模型。術(shù)后2 h，外拉尼龍線，使其球端回至頸外動脈殘端，恢復(fù)大腦中動脈供血，實(shí)現(xiàn)再灌注，于上述不同時間點(diǎn)斷頭取腦；假手術(shù)組除插入尼龍線15 mm外，余步驟同手術(shù)組，術(shù)后24 h斷頭取腦。1.3 免疫組化染色在相應(yīng)時間點(diǎn)，大鼠深度麻醉后，打開腹腔，由左心耳灌注生理鹽水100 mL,再用4%甲醛內(nèi)固定后斷頭取腦。標(biāo)本置中性福爾馬林中固定、包埋。按下述步驟行PAR1免疫組化染色：切片、微波修復(fù)抗原、3%過氧化氫抑制、兔血清封閉、加一抗（山羊抗小鼠多克隆抗體，美國Santa Cruz公司）、4 過夜、加生物素二抗（兔抗山羊IgG）、加SABC、DAB顯色，蘇木素復(fù)染。1.4 腦組織勻漿制備及SOD

9、、MDA含量測定將左側(cè)腦組織稱重后置于玻璃勻漿管內(nèi),0.9%的生理鹽水作為勻漿介質(zhì)（是腦組織的9倍）,充分磨碎使腦組織勻漿化,離心15 min,取上清液,即為10%腦組織勻漿。SOD、MDA含量測定嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。1.5 結(jié)果分析高倍鏡下隨機(jī)選取左側(cè)海馬皮質(zhì)相鄰而不重疊的4個視野區(qū)，用圖像分析軟件計(jì)算PAR1陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)。用SPSS 11.0軟件進(jìn)行方差分析，所得PAR1、SOD、MDA值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s) 表示，P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 PAR1表達(dá)和SOD、MDA含量與假手術(shù)組相比，CIR 3 h后 PAR1表達(dá)明顯增多，3 d時達(dá)高峰（P

10、0.01）；SOD活性顯著降低（P0.01），且隨時間變化延長而逐步降低，3 d時最為明顯；MDA含量開始升高（P0.01），3 d達(dá)高峰(見表1)。2.2 相關(guān)性分析PAR1陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)與腦組織勻漿SOD含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r2=-0.901,P0.01），但與MDA含量呈正相關(guān)關(guān)系（r1=0.844,P0.05）（見表1）。表1 PAR1表達(dá)與SOD、MDA含量變化注：*P0.01；3 討論腦缺血再灌注后，缺血以及缺血激活的內(nèi)皮細(xì)胞可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞聚集、黏附和浸潤， 黏附的白細(xì)胞可釋放大量氧自由基和蛋白水解酶4。自由基對腦組織的損害集中表現(xiàn)為OH-對細(xì)胞器生物膜中不飽和脂肪酸的丙烯雙鍵進(jìn)行

11、攻擊，使之結(jié)構(gòu)破壞，流動性降低，通透性增加，甚至完全裂解，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化,引起細(xì)胞凋亡。膜脂質(zhì)降解產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物MDA常用來反應(yīng)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度，通過測量MDA的量可間接反映氧自由基水平；SOD活性代表內(nèi)源性氧自由基清除活力，腦缺血繼發(fā)損傷后，一系列自由基反應(yīng)可直接損傷DNA、酶蛋白，從而使SOD的活性減弱或消失，SOD合成和再生減少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CIR后MDA含量隨再灌注時間的延長進(jìn)行性升高，而SOD活性隨再灌注時間的延長逐漸降低，提示腦組織中有大量自由基產(chǎn)生，內(nèi)源性氧自由基清除活力下降。研究表明，凝血酶的細(xì)胞外效應(yīng)在腦組織缺血損傷中起重要作用，其細(xì)胞外效應(yīng)由凝血酶受體(t

12、hrombin recptor,TR)介導(dǎo)5。PAR1是TR之一，在腦組織中分布廣泛，對凝血酶的介導(dǎo)作用最強(qiáng)6。腦缺血再灌注后，腦組織產(chǎn)生大量凝血酶，通過栓系配體模式6激活PAR1,引起PAR1表達(dá)增多，對腦細(xì)胞產(chǎn)生直接的毒性效應(yīng)，并通過受體途徑激活神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，使之產(chǎn)生并釋放大量的細(xì)胞因子及毒性物質(zhì)而損傷血腦屏障7。有報道8 認(rèn)為：凝血酶是重要的前炎癥因子，可上調(diào)腫瘤壞死因子（TNF）、細(xì)胞間粘附分子（ICAM1）、白介素1（IL1）等炎性因子表達(dá)，促進(jìn)白細(xì)胞浸潤及活化。CIR后，中性粒細(xì)胞在凝血酶作用下趨化于缺血組織周圍，凝血酶通過激活PAR1導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，刺激小膠質(zhì)細(xì)胞

13、的活化和增生3，促進(jìn)炎癥因子表達(dá)，活化的白細(xì)胞釋放自由基，導(dǎo)致SOD活力降低、MDA水平升高。本研究發(fā)現(xiàn)，CIR后PAR1表達(dá)隨再灌注時間延長也逐漸增多，3 d時達(dá)高峰；對PAR1陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)和MDA含量進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)二者呈正相關(guān)關(guān)系；而SOD含量與PAR1陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，且三者達(dá)高峰時間均在CIR后3d，這與臨床上腦梗死后病情危重時間點(diǎn)一致,說明PAR1表達(dá)增高可加重CIR后腦組織炎癥反應(yīng)。Rhauhman9等研究表明，凝血酶通過激活核轉(zhuǎn)錄因子NFB促進(jìn)許多細(xì)胞因子的表達(dá)。NFB是一種共用的核轉(zhuǎn)錄因子，在IL1、TNF、ICAM1等的啟動子上都存在它的結(jié)合位點(diǎn)。CIR后P

14、AR1表達(dá)增加，凝血酶通過PAR1激活NFB后進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合于TNF、ICAM1、IL1等炎癥因子的靶基因位點(diǎn)，誘導(dǎo)其表達(dá)，介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)的發(fā)生。提示腦梗死后及時進(jìn)行抗凝血酶治療，有可能抑制PAR1的高表達(dá)，減少氧自由基的生成，從而減輕腦組織炎性反應(yīng)和腦組織損傷?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in ratsJ.Stroke,1989,20(1):84-91.2Stoll G,Jander S,Schroete

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