PCR技術(shù)的過程和意義

1、PC限術(shù)的過程和意義一、PCRfc術(shù)的基本原理類似于DNA勺天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核昔酸引物。PCR1一種體外DNA擴增技術(shù)，是在模板DNA引物和4種脫氧核甘酸存在的條件下，依賴于DNAK合酶的酶促合反應，將待擴增的DNAt段與其兩側(cè)互補的寡核甘酸鏈引物經(jīng)高溫變性一一低溫退火一一引物延伸”三步反應的多次循環(huán)，使DN*段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。在環(huán)境檢測中，靶核酸序列往往存在于一個復雜的混合物如細胞提取液中，且含量很低，對于探測這種復雜群體中的特異微生物或某個基因，雜交就顯得不敏感。使用PC曲術(shù)可將靶序列放大幾個數(shù)量級，再用探

2、針雜交探測對被擴增序列作定性或定量研究分析微生物群體結(jié)構(gòu)。二、PC淑術(shù)的步驟PCRtt變性-退火-延伸三個基本反應步驟構(gòu)成：1、模板DNAB變性模板DNAS加熱至93c左右一定時間后，使模板DNAK鏈或經(jīng)PCFT增形成的雙鏈DNA單離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應作準備；2、模板DNAtf引物的退火（復性）模板DNAS加熱變性成單鏈后，溫度降至55c左右，引物與模板DNAI鏈的互補序列配對結(jié)合；3、引物的延伸DNA真板引物結(jié)合物在TaqDNAK合酶的作用下，以dNTF%反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性-

3、退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期（Plateau）所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。三、PCRfc術(shù)的意義1、特異性強PCRE應的特異性決定因素為：引物與模板DNA（$異正確的結(jié)合；堿基配對原則；TaqDNA聚合酶合成反應的忠實性；靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及TaqDN臊合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結(jié)合（復性）可以在較高的溫度下進行，結(jié)合的特異性大大增

4、加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。2、靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克（pg=10-12）量級的起始待測模板擴增到微克（小g=6）水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR勺靈敏度可達3個RFU空斑形成單位）；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。3、簡便、快速PCRK應用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在24小時完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。4、對標本的純度要求低

5、不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA粗制品及RNA勻可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNAT增檢測。四、PCRK術(shù)主要應用的領(lǐng)域1、核酸的基礎(chǔ)研究：基因組克隆2、不對稱PCR®J備單鏈DNAffl于DNAW序3、反向PCRM定未知DNAg域4、反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR用于檢測細胞中基因表達水平、RNAW毒量以及直接克隆特定基因的cDNA5、熒光定量PCRffl于對PCR物實時監(jiān)控6、cDNAHC端快速擴增技術(shù)7、檢測基因的表達8、醫(yī)學應用：檢測細菌、病毒類疾??；診斷遺傳疾??；診斷月中瘤；應用于法醫(yī)物證學。五、關(guān)于RT-PCR4月17日，

6、在北京檢驗檢疫局承擔的國家質(zhì)檢總局科技計劃項目“禽流感病毒H7N9亞型雙重熒光RT-PCRS型技術(shù)研究”鑒定會上，專家組一致認為：該項目創(chuàng)新性地實現(xiàn)了對禽流感病毒H7N9亞型的一步快速定型，可在一次檢測中確認樣品中是否存在H7N9亞型禽流感病毒或其他H7亞型和N9亞型的禽流感病毒;在通用性、特異性、靈敏性上，技術(shù)優(yōu)勢突出。專家組同意項目成果通過鑒定，并建議在進一步擴大和完善動物臨床驗證實驗基礎(chǔ)上，盡快推廣應用。RT-PCR為反轉(zhuǎn)錄RCRreversetranscriptionPCR和實時PCRrealtimePCR共同的縮寫。逆轉(zhuǎn)錄PCR或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR,一條RNAg被逆轉(zhuǎn)錄成為互補DNA再以此為模板通過PCR®TDNAT增。RT-PCRg術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNAW毒的含量和直接克隆特定基因的cDNAff列。作