免疫組化SP法與SABC

1、免疫組化SP法與SABCABC&:ABC弋表的是親和素一生物素一過氧化物酶復合物。利用抗生物素分別連接生物素標記的第二抗和生物素標記的酶。但是此法注意內(nèi)源性生物素活性的消除，以減少非特異性的染色。SP法：是采用生物素標記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的堿性磷酸酶及底物色素混合液來測定細胞或組織中的抗原。PA是一種金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質(zhì)，它能與各種動物的IGG的FC段結(jié)合，在免疫組化中可作為橋抗體或標記抗體。最大的優(yōu)點是不受種屆的特異性限制。此法還具有染色時間短、靈敏度高、背景染色淡等優(yōu)點，分子量小，易丁穿透組織。兩者本質(zhì)的區(qū)別是：SABC&的“三抗”是SABC復合

2、物即鏈酶親和素一生物素-過氧化物酶復合物；而SP法的“三抗”是過氧化物酶直接與鏈酶親和素相連的，沒有通過生物素的中介連接。SABCC驟：切片常規(guī)脫蠟、脫水；30%H2O3蒸僻水10份混合，室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶，蒸僻水洗；將切片浸入0.01M枸椽酸鹽(PH6.0),微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔10分鐘，反復兩次進行熱修復抗原；滴加5%BSAM閉液，室溫20分鐘；滴加一抗，37C1小時30分鐘孵育；滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,室溫下20分鐘，PBS(PH7.2-7.6)洗；滴加試劑SABC室溫下20分鐘，PBS洗5分鐘X4次；DAE®色：取1ml蒸僻水，加試劑盒中A,B,C試

3、劑各1滴，混勻后加至切片，室溫顯色18分鐘；蘇木素輕度復染；脫水，透明封片。顯微鏡下觀察。免疫組織化學乂稱免疫細胞化學,是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術。免疫組織化學的方法有多種，其實都大同小異，不同點只是在丁顯色基團！SP法脫蠟、水化；PBS洗23次各5分鐘；3%HO(80列醇)滴加在TMM，室溫靜置10分鐘；PBS洗23次各5分鐘；抗原修復；PBS洗23次各5分鐘；7）滴加正常山羊血活封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。8）滴加I抗50卜l,室溫靜置1小時或者4C過夜或者37C1小時。9）4C過夜

4、后需在37C復溫45分鐘。10）PBSa3次各5分鐘；11）滴加II抗4050l,室溫靜置，或37C1小時；12）II抗中可加入0.05%的tween-20。13）PBSa3次各5分鐘；14）DAB顯色510分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；15）PBS或自來水沖洗10分鐘；16）蘇木精復染2分鐘，鹽酸灑精分化；17）自來水沖洗1015分鐘;18）脫水、透明、封片、鏡檢。SABCt1）脫蠟、水化。2）PBSa兩次各5分鐘。3）用蒸僻水或PBS8己置新鮮的3%HO2，室溫封閉510分鐘，蒸僻水洗3次。4）抗原修復。5）PBS洗5分鐘。6）滴加正常山羊血活封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。7）滴加I

5、抗，室溫1小時或者4C過夜或者37C1小時（4C過夜后在37C復溫45分鐘）。8）PBS三次每次2分鐘。9）滴加生物素化二抗，20C37C20分鐘。10）PB砒3次每次2分鐘。11）滴加試劑SABC20C37C20分鐘。12）PBS4次每次5分鐘。13）DAB顯色：DABS色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。14）蒸僻水洗。蘇木素復染2分鐘、鹽酸灑精分化。15）脫水、透明、封片、鏡檢。二者區(qū)別：sp法是：一抗+生物素化二抗+HRPfe記的鏈霉卵白素（HRFW記的親和素）酶標親和素-生物素技術（labelledavidin-biotintechnique，簡稱LAB法）。即用辣根過氧

6、化物酶直接標記avidin，用biotin標記2抗。關鍵步驟為3步：Ag+Ab1+（Ab2-B）+A*（A為HRPW記的卵白素）A與2抗的生物素結(jié)合,avidin起橋聯(lián)作用。如將該法中的卵白素（avidin）變換成鏈霉卵白素（streptavidin）,LAB法即成LsAB法，或稱SP法。據(jù)認為LAB法比ABC&敏感24倍，而LsAB法因streptavidin不與組織細胞中內(nèi)源性生物素結(jié)合而特異性更高?，F(xiàn)在SP法已趨丁取代ABC法而廣為應用。sabc法是：一抗+生物素化二抗+abc復合物（是使用前親和素與酶聯(lián)生物素現(xiàn)配使用）親和素-生物素-過氧化物酶復合物技術（avidin-biot

7、in-peroxidasecomplextechnique，簡稱ABC&）。關鍵的程序步驟為3步：Ag+Ab1+（Ab2-B）+A改C復合物（Ab2-B為生物素標記的第二抗體）（B為生物素標記的過氧化物酶）AEC復合物是avidin與酶聯(lián)biotin1比1在使用前30min配置，混勻。1個avidin分子結(jié)合了3個biotin分子，剩下1個結(jié)合點與2抗的生物素結(jié)合，avidin起橋聯(lián)作用。ABC法敏感性更高，比PA以敏感2040倍，背景也更活晰。個人理解：SP法和SABCM相差不大，一般都可以用.SP法：一抗+生物素標記二抗+辣根酶標記鏈霉卵白素+辣根酶底物顯色SABOt:一抗+生物素

8、標記二抗+滴加試劑SABO鏈霉卵白素+辣根酶標記生物素）+辣根酶底物顯色比較可知，SAB以SP法在原理上基本是一樣的。但由丁SABCM第3步有放大作用，所以更靈敏一些.可能會出現(xiàn)用SAB以可以做出結(jié)果的，用SP法做不出來.總的來說，個人認為SABC&可能好一些！我自己以及周圍的同學以前一般都是選用SABC&!SP法1脫蠟水化2蒸t留水中5分鐘3用蒸偕水或PBS配置新鮮的3%H2O2室溫封閉10分鐘蒸偕水洗1次4抗原修復5PBS洗5分鐘6滴加正常山羊血清封閉液，室溫10分鐘7甩去多余液體滴加1抗37度1小時或者4過夜4過夜后37復溫45分鐘8PBS洗2次各5分鐘9滴加生物素化抗孵

9、育條件參見所用試劑盒10PBS11滴加酶標抗體孵育條件參見所用試劑盒12PBS洗2次各5分鐘13DAB顯色510分鐘在顯微鏡下掌握染色程度14蒸偕水洗終止染色蘇木素復染鹽酸酒精分化15脫水透明封片鏡檢洗2次各5分鐘SABC法1脫蠟水化2蒸儲水中5分鐘3用蒸偕水或PBS配置新鮮的3%H2O2室溫封閉5-10分鐘蒸t留水洗1次4抗原修復5PBS洗5分鐘6滴加正常山羊血清封閉液室溫10-20分鐘甩去多余液體7滴加1抗,37度1小時或者4過夜4過夜后在37復溫30分鐘8PBS洗2次每次5分鐘9滴加生物素化二抗孵育條件參見所用試劑盒10PBC洗2次每次5分鐘11滴加試劑SABC孵育條件參見所用試劑盒12PBS洗2次每次5分鐘