熒光光譜技術(shù)在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用

1、熒光光譜技術(shù)在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用The application of studying fluorescence spectroscopy on protein學(xué)生姓名：林亞南院 系：理學(xué)院專 業(yè)：應(yīng)用物理學(xué) 號：1035006E-mail : rabbitnone摘要熒光光譜法對研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其構(gòu)象變化是很重要的。描述了熒光光譜的概念、 發(fā)光機(jī)理及特點(diǎn)，介紹了熒光光譜儀的儀器原理和結(jié)構(gòu)，記述了熒光光譜技術(shù)在檢測蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化、蛋白質(zhì)的含量和酶活性方面的具有應(yīng)用。關(guān)鍵詞： 熒光光譜法; 蛋白質(zhì) ; 構(gòu)象AbstractFluorescence spectroscopy is very im

2、portant for studying protein structure and conformation changes. The concept and principle of fluorescence spectroscopy are introduced at first then the application of studying fluorescence spectroscopy on protein is explained.Key words: fluorescence spectroscopy; protein; conformation目錄引言 4主要內(nèi)容 51、

3、 熒光光譜技術(shù) 51. 熒光發(fā)光機(jī)制 52. 常用熒光參數(shù) 52、 熒光光譜儀的原理及結(jié)構(gòu) 63、 蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光與熒光探針 71. 蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光 82. 蛋白質(zhì)的外源熒光 84、 熒光光譜法在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用 81. 利用蛋白質(zhì)的天然熒光檢測蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化 82. 利用熒光探針檢測蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化 93. 測定蛋白質(zhì)的含量 94. 測定酶的活性 95. 研究小分子與蛋白質(zhì)間的相互作用 105、 蛋白質(zhì)熒光光譜研究的一些新方法 101. 同步熒光光譜 102. 三維熒光光譜法 113. 熒光共振能量傳遞分析 12結(jié)論 13參考文獻(xiàn)(References) : 14引言16世紀(jì)，西班牙

4、科學(xué)家 Nicholas Monardes觀察至L貯放在由菲律賓紫檀木制成的杯中的水會發(fā)出一種神奇而迷人的藍(lán)光。到17 世紀(jì)， Boyle 等其他科學(xué)家也觀察并記載了類似的發(fā)光現(xiàn)象。1864年，英國物理學(xué)家George Stokes首先提出發(fā)光現(xiàn)象作為一種分析方法，他在1852 年發(fā)表的關(guān)于發(fā)光現(xiàn)象的基礎(chǔ)性論文以及隨后的一系列研究工作，奠定了至今還在使用的許多發(fā)光概念的基礎(chǔ)。1978年，T.C. O ' Haver其論文里對發(fā)光現(xiàn)象及研究做了歷史考證和評述（王鎮(zhèn)浦等 , 1989） 。 發(fā)光光譜法作為最古老的分析方法之一，目前仍然得到極為廣泛的應(yīng)用。 熒光光譜法是研究蛋白質(zhì)的一種有效方

5、法。它能夠提供激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、發(fā)光強(qiáng)度、發(fā)光壽命、量子產(chǎn)率、偏振和各向異性諸多信息等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為一種重要的痕量分析技術(shù)，通過對這些參數(shù)的測定, 不但可以做一般的定量分析 , 而且還可以推斷蛋白質(zhì)分子在各種環(huán)境下的構(gòu)象變化, 從而闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。同時， 熒光光譜分析技術(shù)具有靈敏度高（比紫外可見分光光度法高23個數(shù)量級），選擇性好，工作曲線線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。所以，該方 法在蛋白質(zhì)研究中得到越來越廣泛的應(yīng)用。主要內(nèi)容一、熒光光譜技術(shù)某些物質(zhì)被一定波長的光照射時， 會在較短時間內(nèi)發(fā)射出波長比入射光長的 光，這種光稱為熒光。熒光光譜在各方面的應(yīng)用及有關(guān)的方法稱為熒光光譜技術(shù)。1 .

6、熒光發(fā)光機(jī)制每一個分子具有一系列分離的電子能級，每一電子能級中又有一系列的振動 能級和轉(zhuǎn)動能級。當(dāng)物質(zhì)被光照射后，大約在 10-15s內(nèi)光被物質(zhì)吸收，物質(zhì)分 子獲得能量，分子內(nèi)的電子躍遷到較高能級而變成激發(fā)態(tài)。 處于激發(fā)態(tài)的分子很 不穩(wěn)定，它首先通過內(nèi)轉(zhuǎn)換將部分能量轉(zhuǎn)移給周圍分子，回到最低電子激發(fā)態(tài)振動能級（稱為第一級電子激發(fā)態(tài)振動能級），處于這一能級的分子平均壽命大約是 10-8s,如果這時分子通過發(fā)射相應(yīng)的光量子來釋放剩余能量而回到基態(tài)的各個 不同的振動能級，就產(chǎn)生了熒光。因此，最低第一級電子激發(fā)態(tài)振動能級是產(chǎn)生 熒光的基礎(chǔ)。由于分子發(fā)射熒光前已有一部分能量被消耗， 所以熒光能量要比物 質(zhì)

7、吸收的光能量小，因而熒光的發(fā)射波長總比激發(fā)波長長。i能昌吸收過耳較而出激發(fā)態(tài) 振動能級最低第一級電子 激發(fā)態(tài)振動修級圖1熒光產(chǎn)生機(jī)理2 .常用熒光參數(shù)熒光光譜法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、用樣量少、方法簡便以及能提供較多 的物理參數(shù)等優(yōu)點(diǎn)。因而被廣泛地應(yīng)用于各個研究領(lǐng)域。它能提供包括激發(fā)譜、發(fā)射譜以及熒光強(qiáng)度、量子產(chǎn)率、熒光壽命等許多物理參數(shù),這些參數(shù)從各個角度反映分子的構(gòu)象情況,通過對這些參數(shù)的測定,不但可以做一般的定量分析,而且可以推斷生物大分子在各種環(huán)境下的構(gòu)象變化,從而闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。1) 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光光譜包括激發(fā)光譜和發(fā)射光譜兩種。激發(fā)光譜是熒光物質(zhì)在不同波長的激發(fā)

8、光作用下測得的某一波長處的熒光強(qiáng)度的變化情況;發(fā)射譜則是在某一固定波長的激發(fā)光作用下熒光強(qiáng)度在不同波長處的分布情況。在發(fā)射譜中最大熒光強(qiáng)度對應(yīng)的熒光波長稱為最大熒光波長，記為而ax，它是熒光光譜的一個重要參數(shù),對環(huán)境的極性和熒光團(tuán)的運(yùn)動很敏感。為了有利于測定,一般都選擇激發(fā)光譜的峰位測定發(fā)射光譜,選擇發(fā)射光譜的峰位測定激發(fā)光譜1。激發(fā)光譜與發(fā)射光譜呈鏡象對稱關(guān)系。2) 熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度是最常用的參數(shù),與很多因素有關(guān),可用下列公式表示:F = K(|)0I(1 - c-e b c )式中：F是熒光強(qiáng)度；K是儀器常數(shù)；小是量子產(chǎn)率；0是激發(fā)強(qiáng)度；是摩爾吸收系數(shù) ; b 是熒光池的光徑; c 是熒光

9、物質(zhì)溶液的濃度。當(dāng)溶液很稀時,上式可簡化為F = K 0 小 £ bc = 0C(|)I式中A為光吸收值,A = c bc可知,在低濃度下,樣品濃度和熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系。利用此公式,可用熒光光譜法測定熒光物質(zhì),如氨基酸、蛋白質(zhì)含量。3) 量子產(chǎn)率量子產(chǎn)率表示熒光物質(zhì)發(fā)射熒光的本領(lǐng)，用小表示。其定義為發(fā)射的光量子數(shù)與吸收的光量子數(shù)之比,又稱熒光效率或量子效率。若兩種溶液測量條件完全相同，則可用相對法測定 ?。褐? 2 = F1 A2 / F2 A1 , F是熒光強(qiáng)度,A為光吸收值。量子產(chǎn)率的改變必然會引起熒光強(qiáng)度的改變。因此,如果要研究量子產(chǎn)率的相對值 ,只要測量熒光強(qiáng)度也就足夠。二、

10、 熒光光譜儀的原理及結(jié)構(gòu)能發(fā)射熒光的物質(zhì)稱為熒光物質(zhì)。測定熒光光譜的儀器稱熒光光譜儀，其結(jié)構(gòu)上的最主要特點(diǎn)是入射的激發(fā)光與熒光探測方向垂直。其工作原理是由高壓汞燈或氤燈發(fā)出的紫外光和藍(lán)紫光經(jīng)濾光片照射到樣品池中，激發(fā)樣品中的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，熒光經(jīng)過濾和反射后，被光電倍增管接受，然后以圖或數(shù)字的形式 顯示出來。圖2是FluoroMax22熒光光譜儀示意圖。儀器主要由光源、激發(fā)單色 器、發(fā)射單色器、樣品池、檢測器以及顯示系統(tǒng)組成。熒光光譜儀常用光源有鴇 燈、氫燈、笊燈、汞燈、激光燈等，紫外光源用得最多。氤燈在 200800nm范 圍內(nèi)具較好的發(fā)射光譜。汞燈是校準(zhǔn)用光源。單色器用來選擇特定波長的單

11、色光 入射到樣品上。檢測器一般用光電管或光電倍增管，將光信號放大并轉(zhuǎn)為電信號。 熒光光譜儀的樣品池是四面透光的石英杯， 且用去熒光石英材料制成，它可以作 為紫外分光光度計的樣品池。測量液體時，光源與檢測器成直角安排。紫外分光 光度計的樣品池是兩面透光的樣池， 它不能作為熒光光譜儀的樣品池。發(fā)射光單 色器或稱第二單色器放在樣品池和檢測器之間， 其作用是讓被測樣品所發(fā)生的熒 光透過，而濾去由激發(fā)光所發(fā)生的反射光、 閃射光，也就是用來選擇一定波長的 光進(jìn)入檢測器測量。計算機(jī)輔助記錄系統(tǒng)用以完成繪圖及熒光強(qiáng)度的測量。三、蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光與熒光探針利用熒光光譜法研究蛋白質(zhì)一般有兩種方法。是測定蛋白質(zhì)分子

12、的自身熒光（內(nèi)源熒光），另一種是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)本身不能發(fā)射熒光時，通過非共價吸附或共價作用向蛋白質(zhì)分子的特殊部位引入外源熒光（也稱熒光探針），然后測定外源熒光物質(zhì)的熒光。1. 蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光含有芳香族氨基酸(色氨酸(tryptophan ,Trp)、酪氨酸(tyrosine ,Tyr)和苯丙氨酸 (phenylalanine ,Phe)頻基的蛋白質(zhì)在280nm或295nm的激發(fā)光的激發(fā)下會產(chǎn)生 熒光，這種熒光稱為內(nèi)源性熒光(天然熒光)。Trp、Tyr和Phe由于其側(cè)鏈生色基 團(tuán)的不同而有不同的熒光光譜。其熒光峰位波長分別是348、303、282nm,其中Trp的熒光強(qiáng)度最大，而Phe的熒光強(qiáng)度則很

13、低，因此蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要是 由 Trp 和 Tyr 殘基形成的。同時在含有Trp 和 Tyr 的蛋白質(zhì)中，由于其分子發(fā)生了從 Tyr 殘基到 Trp 殘基的能量轉(zhuǎn)移, 從而導(dǎo)致Tyr 殘基的熒光猝滅和Trp 殘基的熒光增加，因而Trp 最常被用作內(nèi)源探針來研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。2. 蛋白質(zhì)的外源熒光所謂外源熒光光譜法就是利用小分子熒光化合物與其熒光較弱或不發(fā)熒光的物質(zhì)共價或非共價結(jié)合，形成發(fā)強(qiáng)熒光的絡(luò)合物，然后測定絡(luò)合物的熒光。常用測定蛋白質(zhì)的熒光探針主要有丹磺酰氯、熒光胺、12 苯胺基萘282 磺酸(12anilinonaphthalene282sulfonate ,ANS) 、 22 對

14、甲 苯 胺 基 萘 262 磺 酸 (22p2toluidinonathalene262sulfonate ,TNS)、 12(N2 二 甲 基 胺 )2 萘 252 磺 酸(12(N2dimethylamino)2naphthalene252sulfonate ,DNS殍。4、 熒光光譜法在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用1. 利用蛋白質(zhì)的天然熒光檢測蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化利用蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)具有吸收紫外區(qū)域的入射光從而發(fā)射熒光的特性，來研究蛋白質(zhì)在變性或復(fù)性過程中整體空間構(gòu)象的變化。其基本機(jī)理是: 熒光來源于生色團(tuán)基團(tuán)在不同電子能級之間的躍遷，熒光頻率取決于能級之間的能量差，生色團(tuán)基團(tuán)與周

15、圍基團(tuán)的相互作用可能會改變其處于激發(fā)態(tài)時所具有的能量，從而改變其發(fā)射熒光的頻率與強(qiáng)度。同一種熒光分子在不同極性的環(huán)境中，其最大吸收波長可能會有所差別。一般來說，極性環(huán)境會影響生色團(tuán)基團(tuán)的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能級，減少激發(fā)態(tài)的能量，從而引起發(fā)射譜的紅移(使max增大)。在天然的蛋白質(zhì)中，可產(chǎn)生熒光的芳香族氨基酸分子多處于蛋白質(zhì)的內(nèi)部， 被多種非極性氨基酸殘基包圍，因此其所處的局部小環(huán)境的極性弱于蛋白質(zhì)分子外部水溶液的極性。蛋白質(zhì)變性過程中，芳香族氨基酸分子的側(cè)鏈基團(tuán)逐漸暴露于水溶液中，其所處的環(huán)境極性逐漸增加，因此蛋白質(zhì)熒光發(fā)射峰的max逐漸增大。max紅移的程度可以反映蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的程度，紅移程度越

16、大則表明蛋白質(zhì)在變性過程中構(gòu)象變化的程度越大。反過來， 蛋白質(zhì)復(fù)性過程中，芳香族氨基酸分子的側(cè)鏈逐漸內(nèi)埋于蛋白質(zhì)內(nèi)部，其所處的環(huán)境極性逐漸降低，因此蛋白質(zhì)熒光發(fā)射峰的而ax逐漸減小，稱為 而ax的藍(lán)移。通過測定蛋白質(zhì)max藍(lán)移的程度，可以推算其整體構(gòu)象變化的程度。2. 利用熒光探針檢測蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化由于熒光探針的熒光光譜對環(huán)境變化十分敏感，使得它對蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化也就十分敏感。例如用ANS 做熒光探針的時，它通過非共價結(jié)合到蛋白質(zhì)分子的非極性區(qū)域中時，其熒光光譜會隨著所處環(huán)境非極性的增加而發(fā)生藍(lán)移，且熒光強(qiáng)度也隨之提高，最大吸收/發(fā)射在375/500nm， 在一定范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)

17、的濃度呈線性關(guān)系。利用 ANS 的這個性質(zhì)，可以衡量ANS 結(jié)合的蛋白質(zhì)部位的極性的變化，根據(jù)極性的變化又可以進(jìn)一步推測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。3. 測定蛋白質(zhì)的含量利用蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光可以檢測蛋白質(zhì)的含量，主要有標(biāo)準(zhǔn)曲線和內(nèi)標(biāo)法兩種。 標(biāo)準(zhǔn)曲線法是在同樣條件下，以已知量的標(biāo)準(zhǔn)熒光蛋白質(zhì)配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液， 將在熒光光譜儀上測得的值繪成標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后再測未知樣品值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求出熒光物質(zhì)的含量。內(nèi)標(biāo)法通常是在一定的濃度范圍內(nèi)，選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液濃度，將其在熒光光譜儀上測得的值與在同樣條件下測得的未知樣品的值比較，計算求出未知樣品的濃度。蛋白質(zhì)中伯胺還可以與熒光胺反應(yīng)生成發(fā)熒光的化合物，其熒

18、光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的含量成正比，因此可利用熒光胺測定蛋白質(zhì)的含量，但必須預(yù)先測定已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的熒光強(qiáng)度3。4. 測定酶的活性熒光光譜法是測定酶活性的一種方法，主要是根據(jù)底物或產(chǎn)物的熒光性質(zhì)的差別來進(jìn)行測定，其靈敏度要比紫外及可見分光光度法高若干個數(shù)量級，而且熒光強(qiáng)度與激發(fā)光的光源有關(guān)，因此在酶活性的測定中越來越多地被采用，特別是用于一些快速反應(yīng)的測活性場合。熒光光譜法的一個缺點(diǎn)是易受其他物質(zhì)干擾，例如酶本身的內(nèi)源熒光的干擾。故用熒光法測定酶活力時，盡可能選擇酶的內(nèi)源熒光較弱的可見光范圍進(jìn)行測定。如乳酸脫氫酶(lac2tate dehydrogenase ,LDH的活性測定，乳酸脫氫酶可催

19、化乳酸與氧化態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nico2tinamideadenine dinucleotide ,NAD+)的反應(yīng)，NAD+被還原為原態(tài)煙酰胺腺喋吟二核甘酸 (nicotinamideadinine dinucleotide ,NADH) ,NADH 能被強(qiáng)堿轉(zhuǎn)換成熒光化合物，則可以測定其熒光強(qiáng)度，用于度量乳酸脫氫酶的活性。5. 研究小分子與蛋白質(zhì)間的相互作用熒光光譜法是研究生物大分子與小分子、離子相互作用的重要手段。在相互作用研究中常采用熒光猝滅法，熒光猝滅是指由于熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。熒光猝滅法分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種方式4。熒光猝

20、滅法多用于研究生物大分子，如蛋白質(zhì)與小分子藥物或金屬離子的相互作用，可引入外源性熒光作為探針，也可利用蛋白質(zhì)自身的內(nèi)源性熒光。借助熒光猝滅法可測得藥物分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合點(diǎn)數(shù)，再依據(jù)Forster能量轉(zhuǎn)移機(jī)制可求出供體與受體間的結(jié)合距離及能量轉(zhuǎn)移效率5該法應(yīng)用十分廣泛6-7， 且常與紫外可見吸收光譜法及圓二色譜法一起使用，相互驗證。5、 蛋白質(zhì)熒光光譜研究的一些新方法1. 同步熒光光譜同步熒光技術(shù)是在同時掃描激發(fā)和發(fā)射波長的情況下來測繪熒光光譜圖。由測得的熒光強(qiáng)度信號對發(fā)射或激發(fā)波長作圖，即為同步熒光光譜。它包括固定波長的同步熒光和固定能量的同步熒光兩種光譜。固定波長的同步熒光光譜首先

21、由L loyd8提出，固定能量的同步熒光光譜則隨后由Imman9等人提出。1) 固定波長的同步熒光光譜在同步掃描中，使激發(fā)波長和發(fā)射波長保持固定的波長間距，即在$K= Kem- Kex= 常數(shù)的情況下進(jìn)行掃描，以同步熒光信號(相對強(qiáng)度) 對發(fā)射或激發(fā)波長測繪熒光光譜圖，則為固定波長的同步熒光光譜。在同步掃描的熒光測定中，同步熒光信號強(qiáng)度I s是激發(fā)波長的函數(shù)，其基本公式為10:I s (Kex , Kem ) = K cbE x (Kex ) EM (Kem ) (1)式中， c 為待測物質(zhì)的質(zhì)量濃度，b 為試樣溶液的厚度，K 為實驗條件下某常數(shù)，E x 為激發(fā)光譜的強(qiáng)度分布，EM 為發(fā)射光譜

22、的強(qiáng)度分布。由 (1) 式可知， 在實驗條件保持固定的情況下，測試物質(zhì)的同步熒光信號強(qiáng)度與待測物質(zhì)的質(zhì)量濃度成正比。 這是定量分析的依據(jù)。在利用同步熒光測試樣品前，$K 值必須慎重選擇，只有當(dāng) $K 恰好為某吸收帶和其發(fā)射帶之間的波長間距時，才能觀察到同步信號。2) 固定能量的同步熒光光譜固定能量的同步熒光光譜是指在同步掃描過程中，使激發(fā)波長與發(fā)射波長之間保持著固定的能量差，即使得$M= (1? Kex - 1? Kem ) 107為常數(shù)，$M表示波數(shù)差 (cm - 1)。固定能量的同步熒光法與固定波長的同步熒光法相比較，后者能消除瑞利散射，但是不能消除拉曼散射，反而使拉曼散射加寬。固定能量的

23、同步熒光法既能消除瑞利散射，又可消除拉曼散射，這有利于分析方法靈敏度和精密度的提高，故一般選用前一種方法。如前所述，在構(gòu)成蛋白質(zhì)的20 種氨基酸中，僅有芳香族氨基酸Trp、Tyr、Phe是發(fā)熒光的基團(tuán)，但由于三者在普通熒光光譜中的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜相互重疊，不能同時測定，給研究蛋白質(zhì)的工作帶來了困難，1979年Miller11用同步熒光光譜法分別獲得了 Trp和Tyr的特征光 譜。到目前為止，應(yīng)用同步熒光光譜技術(shù)研究蛋白質(zhì)的報道還比較有限。Rao率先研究了眼晶體蛋白(crystallin)的熒光光譜，在$K= 30nm條件下A、B、C2眼晶 體蛋白的同步熒光光譜可以清楚地分開，可以提供特定的信

24、號信息12 。 Chou等研究了細(xì)胞色素C 溶液的同步熒光光譜，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色C 分子中的Trp 和 Tyr殘基的同步熒光光譜可采用不同的波長差來分開，細(xì)胞色素C 溶液的同步熒光光譜隨溶液pH 不同而變化反映了pH 誘導(dǎo)的細(xì)胞色素C 構(gòu)象變化13。2. 三維熒光光譜法三維熒光光譜法是20 年前提出的一種熒光分析新方法。特別是最近提出的三維熒光偏振光譜在研究溶液中熒光物質(zhì)分子的行為特征方面具有較大的優(yōu)越性。三維熒光光譜是由激發(fā)波長(Y 軸 ) 2 發(fā)射波長(X 軸 ) 2 熒光強(qiáng)度 (Z 軸 ) 三維坐標(biāo)所表征的矩陣光譜(excitation2em ission2matrix spectra),也叫

25、總發(fā)光光譜(total luminescence spectra),顯然該技術(shù)可獲得激發(fā)波長 (Kex)與發(fā)射波長(Ke) 同時變化時的熒光強(qiáng)度信息。三維熒光光譜圖的表示方式有三種，即三維投影圖(isometric projection) 激發(fā)發(fā)射矩陣(EEM )以及等高線(contour plot)熒光光譜圖 14。用三維投影方式表示的熒光光譜，比較直觀，較容易從圖上觀察到熒光峰的位置和高度以及光譜的某些特性。三維熒光光譜圖，由于比二維的平面圖多了一個坐標(biāo)，所得的總熒光數(shù)據(jù)又比普通熒光光譜多得多，故其具有高選擇性。10 余年前，三維熒光光譜法開始應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域14。最近，鄢遠(yuǎn)等人首次將三

26、維熒光光譜法用于測定溶液狀態(tài)下蛋白質(zhì)的構(gòu)象15 。 結(jié)果表明 :三維熒光光譜法是一種研究蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象的很有效的分析方法。該方法能夠較直觀地表明Trp 殘基在蛋白質(zhì)分子中的微環(huán)境及其在不同條件下的構(gòu)象變化，因而可望得到廣泛的應(yīng)用。Chen等利用三維熒光光譜法研究了 A aH?在不同介質(zhì)中的構(gòu)象變 化16。用EDTA脫去A aH M的金屬離子后，盡管Stoke位移保持不變，用等高線表示的apo2A aH, 的三維熒光光譜發(fā)生了顯著的變化，同時apo2A aH? 的熒光強(qiáng)度降至只有天然 A aH?的26%,結(jié)合其它實驗結(jié)果證明了 A aH?中的金屬離子對于保持活性和維持其構(gòu)象穩(wěn)定都具有重要作用?？?/p>

27、之， 熒光光譜法是研究溶液中蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的一種有效的方法，其測定條件更接近生命體的生理環(huán)境因而在蛋白質(zhì)乃及生命科學(xué)研究中具有重要意義。3. 熒光共振能量傳遞分析熒光共振能量轉(zhuǎn)換 (fluorescence resonance energy transfer, FRET)!指兩個熒光受色基團(tuán)足夠近時，供體分子吸收一定頻率的光子后，被激發(fā)到更高的電子態(tài)，在回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用實現(xiàn)能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移。FRET由兩部分組成:鑭系元素螯和物為能量供體，有機(jī)探針為受體。FRET 是進(jìn)行結(jié)合分析 (抗體2 抗原;受體2配體 ,肽 2蛋白或蛋白2 蛋白激酶分析)的理想工具。此中分析基于兩種標(biāo)

28、記：能量供給長時間衰減螯和物標(biāo)記；短時間衰減有機(jī)接受體。當(dāng)標(biāo)記物被帶到非常接近結(jié)合反應(yīng)時能量轉(zhuǎn)移發(fā)生。根據(jù)記錄接收體的時間分辨熒光量來檢測轉(zhuǎn)移的能量。結(jié)論熒光光譜法是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的一種有效方法，常與圓二色光譜、吸 收光譜、核磁共振、電子自旋共振波譜等技術(shù)互相補(bǔ)充， 給出更全面的數(shù)據(jù)和結(jié) 果，成為蛋白質(zhì)及生命科學(xué)研究中的有利工具。參考文獻(xiàn)(References) :1 陶慰孫，姜涌明.蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)M. 北京:高等教育出版社,1995.2 Jiang Guohua ,Wei Qun ,Function and structure of N2termianl and C2termiandl domains of calcineurin B subunit J.Biol Chem ,2003,384(9): 12992303.3 王煒，廖國寧，季金林，等.熒光微量檢測細(xì)胞內(nèi)DNA 與蛋白質(zhì)含量J.1999 ,28 (3) :2672272.4 陳國珍.熒光分析法M.