用考馬斯亮藍G250法測定蛋白質(zhì)含量

1、用考馬斯亮藍 G250 法測定蛋白質(zhì)含雖呵呵你的自己檢查一下你的儀器蛋白質(zhì)濃度的測定(四)?考馬斯亮藍染色法目的要求學習考馬斯亮藍(CoomassieBrilliantBlue)法測定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法。實驗原理考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)一染料結(jié)合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法?？捡R斯亮藍3250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍色。它和蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律(Beerslaw)。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色有紅色形式和藍色形式，最大光吸收由465nm變成595nm通過測定595nmM光吸收的增加量可知與其結(jié)

2、合蛋白質(zhì)的量。蛋白質(zhì)和染料結(jié)合是一個很快的過程，約2min即可反應(yīng)完全，呈現(xiàn)最大光吸收，并可穩(wěn)定1h,之后， 蛋白質(zhì)一染料復合物發(fā)生聚合并沉淀出來。蛋白質(zhì)一染料復合物具有很高的消光系數(shù)，使得在測定蛋白質(zhì)濃度時靈敏度很高，在測定溶液中含蛋白質(zhì)5L/ml時就有0.275光吸收值的變化，比Lowry法靈敏4倍，測定范圍為10,100蛋白質(zhì)，微量測定法測定范圍是1,10蛋白質(zhì)。此反應(yīng)重復性好，精確度高，線性關(guān)系好。標準曲線在蛋白質(zhì)濃度較大時稍有彎曲，這是由于染料本身的兩種顏色形式光譜有重疊，試劑背景值隨更多染料與蛋白質(zhì)結(jié)合而不斷降低，但直線彎曲程度很輕，不影響測定。此方法十擾物少，研究表明：NaCl,

3、KCl,MgCl2,乙醇,(NH4)2SO4無十擾。強堿緩沖液在測定中有一些顏色十擾，這可以用適當?shù)木彌_液對照扣除其影響。Tris，乙酸，2一筑基乙陽蔗糖，甘油，EDT版微量的去污劑如Triton6X100,SDS玻璃去污劑有少量顏色十擾，用適當?shù)木彌_液對照很容易除掉。但是，大量去污劑的存在對顏色影響太大而不易消除。試劑與器材一、試劑考馬斯亮藍試劑：考馬斯亮藍3250100mg溶于50ml95忍醇中，加入100ml85%|酸，用蒸僻水稀釋至1000ml，濾紙過濾。最終試劑中含0.01%(W/V)考馬斯亮藍3250,4.7%(W/V)乙醇。二、標準和待測蛋白質(zhì)溶液1(標準蛋白質(zhì)溶液結(jié)晶牛血活蛋白

4、，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據(jù)其純度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml,0.1mg/ml蛋白溶液。2(未知蛋白質(zhì)溶液。三、器材試管及試管架，移液管(0.1ml及5ml),UV,2000型分光光度計。操作方法一、標準法制定標準曲線取14支試管，分兩組按下表a平行操作。繪制標準曲線：以A595nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。表a試管編號01234571mg/ml標準蛋白溶液/ml00.01810.020.030.040.050.060.15mol/LNaCl/ml0.10.090.080.070.060.050.04考馬斯亮藍試劑/ml5ml搖勻

5、，1h內(nèi)以0號管為空白對照，在595nm處比色A595nm二、微量法制定標準曲線取12支試管，分兩組按下表b平行操作。繪制標準曲線：以A595nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。表b試管編號23451mg/ml標準蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.15mol/LNaCl/ml0.10.090.080.070.060.05考馬斯亮藍試劑/ml5ml搖勻，1h內(nèi)以0號管為空白對照，在595nm處比色A595nm2三、未知樣品蛋白質(zhì)濃度測定測定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測定值在標準曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測定的A595nm值，在標準曲線上查

6、出其相當于標準蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）。注意事項（1）如果測定要求很嚴格，可以在試劑加入后的5,20min內(nèi)測定光吸收，因為在這段時間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。（2）測定中，蛋白，染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上，實驗證明此復合物的吸附量是可以忽略的。測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗十凈。思考題：根據(jù)下列所給的條件和要求，選擇一種或幾種常用蛋白質(zhì)定量方法測定蛋白質(zhì)的濃度：（1）樣品不易溶解，但要求結(jié)果較準確。（2）要求在半天內(nèi)測定60個樣品。（3）要求很迅速地測定一系列試管（30支）中溶液的蛋白質(zhì)濃度。不要用比色杯，用量大，重復性差?？梢赃@樣在96孔板里面做（可以做復

7、孔）:每孔200微升Bradford試劑，加5微升蛋白溶液，用槍混勻或著在微量振蕩器上面振勻。5分鐘后在酶標儀上測定OD495然后在Excel里面直接做均值，畫標準曲線，。已參考:Pierce公司的相關(guān)試劑盒。考馬斯亮蘭法（Bradford法）（一）實驗原理1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的。 這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點， 因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法?？捡R斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax）,由465nm變?yōu)?95nm溶

8、液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測定的吸光度值A(chǔ)595,與蛋白質(zhì)濃度成正比。Bradford法的突出優(yōu)點是：(1)靈敏度高，據(jù)估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達1mg這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)，染料復合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。(2)測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏

9、色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。(3)十擾物質(zhì)少。如十擾Lowry法的K+、Na*Mg2-W子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、筑基乙醇、EDT酣均不十擾此測定法。此法的缺點是：(1)由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差， 在制作標準曲線時通常選用g一球蛋白為標準蛋白質(zhì)， 以減少這方面的偏差。(2)仍有一些物質(zhì)十擾此法的測定，主要的十擾物質(zhì)有：去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.1N的NaOH(如同0.1N的酸十擾Lowary法一樣)。(3)標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。這是操作流程1.完全溶解蛋白標準品，取10ml稀釋至100ml，使終濃度為0.5mg/ml。蛋白樣品在什么溶液中，標準品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡便起見，也可以用0.9%NaCl或PBSffi釋標準品2.將標準品按0,1,2,4,8,12,16,20微升分別加