側(cè)腦室注射Aβ25-35對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響

1、福建醫(yī)科大學(xué)本科畢業(yè)論文三、前言阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease, AD），又稱為老年性癡呆，是一種進(jìn)行性發(fā)展的致死性神經(jīng)退行性疾病。AD起病緩慢，癥狀復(fù)雜，早期以視空間技能受損和近事記憶力障礙為主，隨著病情的進(jìn)一步發(fā)展，病人出現(xiàn)計(jì)算能力減退、認(rèn)識(shí)障礙及語言障礙等。據(jù)國(guó)際阿爾茨海默病協(xié)會(huì)（Alzheimers Disease International，ADI）的“世界阿爾茨海默病2015年報(bào)告”，目前全球范圍內(nèi)一共約有4600萬癡呆患者，這一數(shù)量將以每20年增加1倍的速度逐漸遞增，平均每年新增癡呆病例可達(dá)990萬1。AD的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，其病因可能為家族遺傳、環(huán)

2、境因素影響、老齡化、頭部外傷史等。AD患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在多種神經(jīng)遞質(zhì)的異常，如乙酰膽堿、5-羥色胺、興奮性氨基酸等，其中乙酰膽堿減少導(dǎo)致的膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能缺陷在AD疾病研究中尤為突出2，目前的治療藥物中應(yīng)用得最多的也是膽堿能藥物。目前被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為治療AD的藥物只有5種：他克林（tacrine）、多奈哌齊（donepezil）、利斯的明（rivastigmine）、加蘭他敏（galantamine）和美金剛（memantine）。這些藥物只能改善AD的早、中期癥狀，對(duì)AD晚期療效較差，也不能阻斷AD發(fā)病的病程。因此，研發(fā)具有新治療靶點(diǎn)與新作用途徑的AD防治藥物是目前研究的熱點(diǎn)之一。動(dòng)

3、物模型是研究AD的重要手段，AD動(dòng)物模型可在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物身上模擬AD患者的行為異常如學(xué)習(xí)記憶能力損害等，為研究AD發(fā)病機(jī)制及試驗(yàn)和判斷抗AD新藥療效提供試驗(yàn)對(duì)象。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已在現(xiàn)有的AD發(fā)病學(xué)基礎(chǔ)上建立了多種不同的AD樣動(dòng)物模型, 盡管這些動(dòng)物模型存在一定的局限性, 不能全面模擬出AD的特征3，但都出現(xiàn)了動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力不同程度下降這一共同特點(diǎn)。學(xué)習(xí)記憶功能障礙是AD患者最典型的特點(diǎn)。學(xué)習(xí)與記憶是指獲取新信息和新知識(shí)并對(duì)這些信息和知識(shí)進(jìn)行保存和讀出的神經(jīng)過程，記憶可分為陳述性記憶和非陳述性記憶，信息經(jīng)過大腦皮層加工處理可在海馬和內(nèi)側(cè)顳葉部位形成陳述性記憶，并最終儲(chǔ)存于大腦皮層區(qū)域4。臨床上健忘和癡

4、呆的病人陳述性記憶首先受損。探究AD發(fā)病原因，發(fā)現(xiàn)患者腦有萎縮，其中顳、頂及海馬部位的萎縮最為明顯；組織病理學(xué)法觀察到患者海馬、額顳葉等結(jié)構(gòu)有大量神經(jīng)元丟失。這些萎縮、神經(jīng)元丟失與學(xué)習(xí)記憶直接相關(guān)，是導(dǎo)致AD患者的記憶缺損的最主要原因。因此學(xué)習(xí)與記憶能力障礙是AD樣動(dòng)物模型建立必不可少的指標(biāo)。在AD的發(fā)病學(xué)說中，淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)學(xué)說受到廣泛關(guān)注。AD患者腦中最有代表性的病理特征為老年斑(senile plaques，SPs)和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)，淀粉樣蛋白（beta amyloid protein，A）是構(gòu)成AD淀粉樣老年斑塊的主要成分

5、5。A級(jí)聯(lián)反應(yīng)學(xué)說認(rèn)為，過量表達(dá)的A在大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元外沉積并緩慢形成老年斑，導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)、突觸功能異常和大量神經(jīng)細(xì)胞消失，引起腦萎縮、神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能嚴(yán)重破壞6。腦內(nèi)注射A擬AD樣動(dòng)物模型也正是基于這一學(xué)說：將具有神經(jīng)毒性作用的A片段注射到動(dòng)物腦組織，誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生AD樣學(xué)習(xí)記憶障礙模擬AD的發(fā)病。A源自淀粉樣前體蛋白(amyloid precursorprotein，APP），APP可以被，3種蛋白酶分解：經(jīng)-分泌酶途徑剪切途徑生成大量可溶性的sAPP，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育，改善學(xué)習(xí)和記憶功能；經(jīng)-分泌酶、-分泌酶途徑生成sAPP、AICD和A片段6。內(nèi)源性

6、A片段是具有3943個(gè)氨基酸的分子，最常見的片段為A1-40和A1-42，多以可溶性單體存在，是體內(nèi)正常新陳代謝產(chǎn)生的物質(zhì)。以單體形式存在的A片段不具有神經(jīng)毒性，當(dāng)平衡被打破、A單體逐步形成寡聚體或凝聚態(tài)結(jié)構(gòu)時(shí)，具有神經(jīng)毒性。A25-35為A蛋白體外水解得到的片段，體內(nèi)并不存在，但其神經(jīng)毒性與與內(nèi)源性A的全長(zhǎng)片段幾乎相等，且有研究證實(shí)A聚合的關(guān)鍵位點(diǎn)與其毒性片段均位于A中段，因此許多AD樣模型選用A25-35建立7。實(shí)驗(yàn)時(shí)A25-35單體需經(jīng)老化聚集為不可溶狀態(tài)使其增加毒性。A的注射部位可以是：第四腦室、基底核、海馬、側(cè)腦室、杏仁核、紋狀體，注射方式多樣，如一次性注射、微滲泵連續(xù)灌注、單側(cè)注射

7、、雙側(cè)注射等，均可誘導(dǎo)出AD樣模型。而對(duì)于AD樣動(dòng)物模型學(xué)習(xí)記憶評(píng)價(jià)的方法眾多，其中較為常用的方法是Morris水迷宮（Morris Water Maze，MWM）。經(jīng)典Morris水迷宮測(cè)試程序主要包括定向航行（place navigation test）和空間探索（spatial probe test）兩個(gè)部分。其中定向航行試驗(yàn)是將小鼠從不同入水點(diǎn)放入水中，評(píng)價(jià)其游至固定隱藏平臺(tái)位置的逃避潛伏期（escape latency），考察對(duì)平臺(tái)空間位置的記憶；空間探索試驗(yàn)是指在經(jīng)過多次定向航行訓(xùn)練后，撤去隱藏平臺(tái)，根據(jù)小鼠的游泳路徑探究其對(duì)原平臺(tái)的記憶。在訓(xùn)練過程中，小鼠可通過加工空間信息產(chǎn)生空

8、間位置認(rèn)知，從而形成一種空間參考記憶。這種記憶主要依賴邊緣系統(tǒng)及大腦皮層有關(guān)腦區(qū)儲(chǔ)存，伴有Hebb突觸修飾，屬陳述性記憶，與篩選研究AD防治藥物的要求相符，具有優(yōu)勢(shì)9。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Morris水迷宮法來檢測(cè)AD樣動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)記憶能力。基于上述情況，本論文擬以側(cè)腦室一次性注射法及Morris水迷宮觀察A25-35對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，為進(jìn)一步研究藥物對(duì)AD樣動(dòng)物模型的作用提供模型基礎(chǔ)，為抗AD新藥療效的觀察提供途徑。五、結(jié)果1. 側(cè)腦室注射給藥部位的驗(yàn)證以小鼠側(cè)腦室一次性注射給藥方法注射墨水，20min后處死小鼠，取出腦組織進(jìn)行冠狀切片，驗(yàn)證注射部位（如圖3）。驗(yàn)證結(jié)果提示給藥部位準(zhǔn)確。 圖3

9、側(cè)腦室注射給藥部位驗(yàn)證2. 側(cè)腦室注射A25-35對(duì)小鼠Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶的影響2.1 A25-35對(duì)小鼠上臺(tái)潛伏期的影響在側(cè)腦室注射A25-35后的1、2、3、4、5周，采用Morris水迷宮定向航行試驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，每周連續(xù)3天，每天4次，分析各組小鼠每周第一天的潛伏期變化。定向航行試驗(yàn)結(jié)果參見圖3。每組內(nèi)單因素方差分析顯示，模型組小鼠潛伏期隨時(shí)間進(jìn)行顯著下降（F=4.295，P<0.05），對(duì)照組的潛伏期隨時(shí)間進(jìn)行亦顯著下降（F=5.004，P<0.01）；組間兩因素析因分析顯示，模型組小鼠平均潛伏期較對(duì)照組顯著延長(zhǎng)（F=0.951，P<0.05）。

10、即隨著定向航行訓(xùn)練次數(shù)的增加，兩組小鼠的逃避潛伏期均逐漸縮短，但兩組之間差異顯著，兩組小鼠在第2、3、4、5周的潛伏期差異也具有顯著意義(* P<0.05，* P<0.01)。上述結(jié)果顯示模型組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力較對(duì)照組小鼠差。*圖4 側(cè)腦室注射A25-35對(duì)小鼠水迷宮逃避潛伏期的影響2.2 A25-35對(duì)小鼠搜索平臺(tái)策略及路線的影響模型組和對(duì)照組的搜索目標(biāo)策略和游泳路線也有差異。在訓(xùn)練初期，兩組小鼠搜索平臺(tái)的策略均以隨機(jī)式、邊緣式為主，游泳路程長(zhǎng)且軌跡多分布于水池壁（如圖5）。而隨著訓(xùn)練次數(shù)增加，對(duì)照組多以趨向式搜索，偶有直線式，游泳路程較短，在短暫適應(yīng)水中環(huán)境后很快找到隱藏的平臺(tái)

11、（圖6 A）；模型組則仍以隨機(jī)式、邊緣式為主，游泳路線長(zhǎng)而復(fù)雜（圖6 B）。圖5 訓(xùn)練初期各組小鼠游泳軌跡示意圖圖6 訓(xùn)練后期各組小鼠游泳軌跡示意圖六、討論動(dòng)物模型是研究AD的重要手段，目前 AD的病因和發(fā)病機(jī)制尚未清楚，除了A級(jí)聯(lián)反應(yīng)學(xué)說外，還有tau蛋白磷酸化異常學(xué)說、膽堿能學(xué)說、自由基損傷學(xué)說、炎癥學(xué)說、基因異常調(diào)控學(xué)說等10-13。側(cè)腦室注射A是常見的建立AD樣動(dòng)物模型的方法，研究表明，動(dòng)物腦內(nèi)注射A可通過多渠道參與引起AD。A可破壞促進(jìn)細(xì)胞凋亡因子Bax與抑制抗凋亡因子Bcl-2之間的動(dòng)態(tài)平衡，直接誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡14；可激活膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥物質(zhì)，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而損傷神經(jīng)元

12、15；還可抑制乙酰膽堿的合成，造成膽堿能神經(jīng)傳遞障礙而影響認(rèn)知功能16。A能夠升高細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，降低突觸的可塑性，從而使細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激和興奮性毒性的易感性增加；同時(shí)降低膜的流動(dòng)性、影響神經(jīng)傳遞過程17。還有研究發(fā)現(xiàn)，A可加速tau蛋白磷酸化，對(duì)神經(jīng)元纖維纏結(jié)的產(chǎn)生有促進(jìn)作用等18。不同的A片段(A1-40、A1-42、A25-35)均具有神經(jīng)毒性。本實(shí)驗(yàn)采用側(cè)腦室一次性注射A25-35片段的方法模擬小鼠AD樣學(xué)習(xí)記憶障礙。在眾多A25-35擬AD樣動(dòng)物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠及小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力在側(cè)腦室一次性注射A25-35后發(fā)生了明顯缺損，結(jié)果可在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、Y

13、迷宮實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)檢測(cè)中明顯體現(xiàn)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室一次性注射A25-35還可以引起動(dòng)物神經(jīng)元退化、膠質(zhì)細(xì)胞活化、乙酰膽堿酯酶活性下降等反應(yīng)19,20。因此，側(cè)腦室一次性注射A25-35可以產(chǎn)生與AD癥狀平行的學(xué)習(xí)記憶障礙、神經(jīng)元損傷，方法較為成熟有效。本實(shí)驗(yàn)主要是對(duì)A25-35擬AD樣動(dòng)物模型學(xué)習(xí)記憶能力障礙的初步探索，為建立可靠、重現(xiàn)性好的AD樣動(dòng)物模型及進(jìn)一步探究藥物對(duì)AD的作用奠定基礎(chǔ)。通過結(jié)果（圖4）可發(fā)現(xiàn)，在手術(shù)后2周，模型組與對(duì)照組的學(xué)習(xí)記憶出現(xiàn)了顯著差異，4周之后顯著性更高，即模型組小鼠可能在2周時(shí)病癥明顯，4周后加劇。據(jù)此可以推斷，側(cè)腦室一次性注射A25-35對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)與記

14、憶能力有抑制作用。上述結(jié)果也提示我們，在今后A25-35擬AD樣動(dòng)物模型的建立中，將針對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在手術(shù)2周后會(huì)使結(jié)果更具有代表性；同時(shí)可以預(yù)測(cè)，在2周時(shí)取材，腦部組織應(yīng)出現(xiàn)相應(yīng)的病理特征，4周后特征更為顯著；并且，在研究藥物對(duì)此動(dòng)物模型的影響時(shí)，手術(shù)前或手術(shù)后2周內(nèi)給予預(yù)防手段應(yīng)有效，而治療藥應(yīng)盡量在4周前給予，以防止動(dòng)物出現(xiàn)不可逆性的病變。本實(shí)驗(yàn)只對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測(cè)，還不足以確定A25-35擬AD樣動(dòng)物模型的成功。要建立成熟、穩(wěn)定的AD樣動(dòng)物模型還需其他不同的指標(biāo)：運(yùn)用其他行為學(xué)方法檢測(cè)AD樣動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力水平，如避暗實(shí)驗(yàn)、Y迷宮實(shí)驗(yàn)等；運(yùn)用組織學(xué)方法鑒定模型動(dòng)物病理特征，如采用染色技術(shù)觀察小鼠海馬等腦組織中是否出現(xiàn)老年斑