植物病毒檢測技術(shù)研究進展

1、 植物病毒檢測技術(shù)研究進展 劉茂炎 摘要：隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展特別是分子技術(shù)的發(fā)展，鑒定和檢測病毒的方法越來越多，也越來越精確快速。以PCR為基礎(chǔ)的基因工程技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒核酸分子的鑒定，其高靈敏度和高特異性是與PCR擴增反應(yīng)的特異性引物相關(guān)聯(lián)的；于此同時傳統(tǒng)的鑒定檢測技術(shù)依然有其發(fā)展優(yōu)勢。不論怎樣的方法技術(shù)，都是以病毒的理化性質(zhì)以及侵染性為基礎(chǔ)的。在此基礎(chǔ)上，甚至出現(xiàn)了某些邊緣技術(shù)在病毒鑒定檢測方面的應(yīng)用。本文主要綜述的是對植物病毒鑒定檢測技術(shù)的研究進展。 關(guān)鍵詞：植物病毒； 檢測技術(shù)； PCR 病毒在生物學上特征（如病毒的理化性質(zhì)，包括病毒粒子的形態(tài)、大小、對理化因子的耐受性等）以及在

2、寄主上的反應(yīng)（如寄主范圍、癥狀表現(xiàn)、傳播方式等）是對病毒最直觀的認識。常規(guī)的對植物病毒的鑒定檢測方法有：生物學測定方法、血清學技術(shù)、電子顯微鏡技術(shù)、分子生物學技術(shù)等。生物學測定依據(jù)病毒的侵染性，觀察寄主植株或其它生物的癥狀表現(xiàn)；血清學技術(shù)以病毒外殼蛋白(CP)為基礎(chǔ)；電子顯微鏡技術(shù)依據(jù)病毒的形狀大小的不同；分子生物學鑒定則以病毒核酸為基礎(chǔ)。1. 生物學鑒定最直接的方法是目測法，直接觀察病毒對植物的病害癥狀。如煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV），病害癥狀為葉上出現(xiàn)花葉癥狀，生長陷于不良狀態(tài)，葉常呈畸形；玉米鼠耳病的診斷主要依據(jù)田間癥狀表現(xiàn)1。目測法因觀察的主觀性和癥

3、狀的不確定性的影響而不精準。1929年美國病毒學家霍姆斯（Holmes） 用感病的植物葉片粗提液接種指示植物，23天后接種葉片出現(xiàn)圓形枯斑，枯斑數(shù)與侵染性病毒的濃度成正比，能測出病毒的相對侵染力，對病毒的定性有著重要的意義，這種人工接種鑒定的方法就是枯斑和指示植物檢測法。國內(nèi)報道的水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus，RBSDV)可侵染28屬57種禾本科植物，該病毒的主要傳毒介體是灰飛虱(Laodelphax striatella)，玉米是灰飛虱的橋梁寄主而非最適寄主2，以玉米作為指示植物可以良好地鑒定RBSDV。目前接種鑒定的方法主要有四種

4、：粉風接種鑒定、嫁接接種鑒定、農(nóng)桿菌接種鑒定、基因槍轟擊法接種鑒定(葉青靜等,2009)。后兩種鑒定方法涉及到了分子克隆技術(shù)，是傳統(tǒng)方法與基因工程技術(shù)的結(jié)合。用農(nóng)桿菌接種法將番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus disease, TYLCD )導(dǎo)入葉盤和整個植株,TYLCV在植株中進行系統(tǒng)侵染，誘導(dǎo)致病癥狀，同時此法還可以用來篩選抗TYLCV的植株3。2. 免疫-血清檢測方法 2.1.血清學檢測法 目前血清學技術(shù)依然是植物病毒病原檢測中最常用的方法之一，它是上世紀世紀六七十年代誕生的病毒檢測技術(shù)，此類技術(shù)的原理主要根據(jù)病毒的侵染性以及其作為核蛋白的特性而

5、設(shè)計的，利用血清中可以和具有某種特定結(jié)構(gòu)特征的病毒結(jié)合的抗體，從而進行病毒的定性定量分析。其中重要的一些方法有：補體結(jié)合測定法（補體能在抗體存在的情況下通過補體的酶作用溶解紅細胞和革蘭氏陰性菌）、沉淀法（不同病毒類型在電解質(zhì)存在時抗體與同源抗原相互結(jié)合形成的沉淀也不同）等。利用基因工程的方法從大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)中高效表達病毒的外殼蛋白， 純化表達產(chǎn)物制備抗血清具有特異性強的特點，可彌補常規(guī)方法的不足4。 2.2.酶聯(lián)免疫吸附法 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）也是利用特異抗體吸附病毒顆粒的原理，只是在抗體上附帶了酶標記，從而使反應(yīng)可以有顏色強弱的變化，利于

6、定時定量監(jiān)測病毒濃度。此法靈敏度高，且不受濃度范圍或其他抑制劑的干擾。ELISA基本類型主要有間接法(I-ELISA)和直接法(DAS-ELISA也叫雙抗體夾心ELISA)5 、三抗體夾心ELISA(TAS-ELISA)等(Accotto et al., 2000; Accotto&Noris, 2007;孫偉等,2002)。其中TAS-ELISA是檢測TYLCV常用和有效的手段之一。1976 年Voller等首次將 ELISA 方法用于檢測植物病毒，Clark 和 Adams 等6在1977年首次對植物病毒病原利用酶聯(lián)免疫法進行了鑒定。ELISA 方法可以檢測出 0.110 ng/m

7、L 的病毒，特異性很強、操作簡單、簡便有效，國內(nèi)外已研發(fā)出許多商品化的 ELISA 試劑盒7-10。因此，在植物病毒檢測中 ELISA技術(shù)也廣泛地應(yīng)用于病毒病的鑒定和進出口檢疫上。這種酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是結(jié)合了酶的高效催化作用和抗原抗體的免疫反應(yīng)，酶與抗體通過化學方法相結(jié)合而形成酶標抗體，酶標記抗體直接與包被在固體支持物上的待測抗原或抗體特異性結(jié)合或通過免疫橋特異性結(jié)合，再在酶的作用下使底物產(chǎn)生有顏色或高電子密度的可溶性產(chǎn)物，結(jié)果通過肉眼或比色法來進行定性的測定，從而得到抗體的性質(zhì)和數(shù)量。2.3.基于酶聯(lián)免疫吸附法的新技術(shù) 2.3.1組織印跡法此方法包括斑點免疫結(jié)合測定法(DIBA

8、-ELISA 或 dot-ELISA)、直接組織斑點免疫測定(IDDTB-ELISA)等11。這些技術(shù)直接將組織印跡在膜上, 不僅保持了 ELISA 的靈敏性和特異性等特點, 而且簡化了操作程序, 使病毒檢測更加快速、簡單、方便, 且印跡在硝酸纖維膜上的樣品保存時間較長, 檢測結(jié)果能直觀地顯示出病毒感染的部位, 適用于植物病毒的大規(guī)模普查。 2.3.2免疫毛細管區(qū)帶電泳技術(shù) 免疫技術(shù)與電泳技術(shù)結(jié)合發(fā)展出了免疫毛細管區(qū)帶電泳技術(shù)(Immuno Capillary Zone Electrophoresis,I- CZE)。I-CZE 將血清學反應(yīng)的專化性和毛細管區(qū)帶電泳的靈敏、快速、可自動檢測等特

9、點結(jié)合起來, 實時檢測抗原-抗體復(fù)合體，I-CZE 可快速分析多個樣品, 因而在苗木帶毒檢測、植物檢疫等方面可發(fā)揮巨大作用, 有廣闊的應(yīng)用前景。2.3.3免疫 PCR技術(shù) 免疫技術(shù)與 PCR 技術(shù)結(jié)合發(fā)展出了免疫 PCR技術(shù)(I-PCR 或 IC-PCR)。免疫 PCR 是一種將抗原抗體反應(yīng)的高特異性與 PCR 的高靈敏度有機結(jié)合的檢測技術(shù)。該技術(shù)先用抗體來捕獲病毒, 提取核酸后, 再進行 PCR 或 RT-PCR 檢測。 將 PCR 技術(shù)和抗原抗體反應(yīng)相結(jié)合，靈敏性非常高。因其對一個分子的抗原都可以進行檢測而具有十分廣泛的應(yīng)用前景，是一種用于檢測微量抗原的 PCR 技術(shù)。該方法由于能去除抑制

10、物質(zhì)而改善檢測環(huán)境, 比標準 PCR 方法更為靈敏、可靠。G. Harper 應(yīng)用 IC-PCR 檢測到香蕉條紋病毒12。 此外還有快速免疫濾紙法、免疫膠體金技術(shù)、免疫沉淀法、免疫電鏡、熒光免疫、放射免疫和 Ig 指示試紙法等13。3.顯微成像技術(shù) 病毒的很多特征如大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等必須借助電子顯微鏡進行檢查。對于目前尚難培養(yǎng)而形態(tài)又非常典型的病毒，可直接從感染組織或分泌液，或者接種病料的雞胚和細胞培養(yǎng)收獲的材料作電子顯微鏡檢查，直接觀察病毒粒子。目前通常認為運用負染和超薄切片電鏡觀察能夠診斷和鑒別植物病毒, 一般可診斷到屬的水平。在植物病毒的診斷和形態(tài)鑒別中, 最有用的特征是病毒粒子的形態(tài)結(jié)

11、構(gòu)和寄主病變, 有些細胞病變特征還能用于區(qū)分不同的病毒種甚至株系。 3.1超薄切片法和負染法 超薄切片法其優(yōu)點是可觀察病毒形態(tài)和形態(tài)發(fā)生過程，缺點是操作復(fù)雜，費時，但標本可長時間保存；負染法是指通過重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強樣品外周的電子密度，使樣品顯示負的反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小，其優(yōu)點是快速簡易（10-20min）、分辨率高，缺點是敏感性低，要求病毒量在107以上，且所有樣品應(yīng)處于懸浮狀態(tài)；T. Hatta 等用負染和超薄切片電鏡觀察區(qū)分了 CMV 的 6 個不同株系14。 3.2免疫吸附電鏡技術(shù) 1973 年, K.S. Derrick把電鏡與免疫學技術(shù)結(jié)合, 發(fā)明了更為靈敏的免

12、疫吸附電鏡技術(shù), 該技術(shù)現(xiàn)已成為植物病毒研究的一個重要手段15。免疫電鏡技術(shù)是將免疫學原理與電鏡負染技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，在電鏡制樣過程中病毒顆粒不能集中的沉積在有效的電鏡視野內(nèi)，而容易造成電鏡觀察時的疏漏，免疫電鏡法利用了抗體、抗原的親和性與吸附性的這一特點，在電鏡制樣過程中，于銅網(wǎng)上先鋪展一層細胞色素A，稍后再添加一滴抗體，多余液滴用濾紙吸掉，最后點上一滴抗原和染液，由于細胞色素A的作用，減少了樣品即抗體、抗原的表面能力，能形成均勻的涂層，再加抗體、抗原的吸附作用使病毒能較集中地沉集在有效視野內(nèi)，從而便于電鏡下的觀察，大大提高了檢測幾率。D. Louro 等于1984 年在此基礎(chǔ)上建立了懸浮樣

13、品的膠體金標記免疫修飾法16（也就是上述第二點免疫法中的免疫膠體金技術(shù)）。此方法利用一抗對病毒進行免疫修飾, 再用膠體金標記二抗或蛋白 A 處理, 形成病毒" 抗體" 金顆粒免疫復(fù)合物。由于在病毒表面的抗體 “暈圈”上結(jié)合了直徑 510 nm 的金顆粒, 該復(fù)合物的電鏡下的可見性好, 比單純免疫修飾法更易判斷。 3.3低溫電鏡技術(shù)以及一些局限性顯微檢測技術(shù) 低溫電鏡技術(shù)，結(jié)合了電鏡技術(shù)和低溫結(jié)晶觀察病毒的三維結(jié)構(gòu)的技術(shù)，其不但有分辨率高的優(yōu)點，而且對病毒樣品的損傷和失真的概率都大大減小，常用于極微量和高保真要求的病毒觀察檢測17。 X-射線衍射技術(shù)，通過掃射病毒微晶得到的衍

14、射圖像來分析還原原始的病毒結(jié)構(gòu)，但為了保證衍射圖像的準確性，往往對樣品的純度和顆粒完整性要求較高，所以這種技術(shù)的使用范圍相對受限。 核磁共振技術(shù)，對比前面提到的技術(shù)對操作的要求更低，運用范圍也更廣，但是對結(jié)構(gòu)的準確性判斷略低。此技術(shù)主要用于病毒短肽的分析以及蛋白小分子構(gòu)象變化的研究。4. 分子生物學檢測方法 寄生于宿主細胞的病毒有不同于宿主細胞的特異基因組序列，這是病毒的存在的證明。分子生物學檢測法就是通過檢測病毒核酸(DNA、RNA)來鑒定病毒的存在,由于是建立在核酸水平上,所以相對于血清學檢測法有更高的靈敏度(Piccotbetal, 1999),并且有更強的特異性,更廣的檢測范圍,還可以

15、進行大批量的樣本檢測,甚至可以使用粗提液檢測病毒。在植物病毒鑒定檢測方面, 目前應(yīng)用的分子生物學技術(shù)主要有核酸斑點雜交(Nucleic Acid Spot Hy-bridization, NASH)技術(shù)、多聚酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)技術(shù)、dsRNA 電泳技術(shù)等18。 4.1.核酸分子雜交技術(shù)(Nucleic Acid Hybridization) 核酸分子雜交技術(shù)是20 世紀 70 年代發(fā)展起來的，它是以 DNA 分子堿基互補配為理論依據(jù)，與待測樣品的 DNA 或 RNA 用特異性的核酸探針形成雜交分子19-20。采用帶有放射性或非放射性物質(zhì)標

16、記的已知序列核酸單鏈作為探針, 在一定條件下與靶病毒的核酸單鏈退火形成雜交雙鏈。通過檢測雜交信號, 檢測出樣本中病毒的基因組份。其優(yōu)點是可檢測同種病毒的不同株系, 還可檢測類病毒、衛(wèi)星 RNA 以及某些不能形成病毒粒體蛋白的病毒分離物; 缺點是同位素標記有放射性污染。但是非同位素標記不會造成環(huán)境污染，而且在信號放大和模板擴增上有所發(fā)展，并在靈敏性上也有完善和提高。生物素、地高辛和熒光素是常用的非同位素標記物21。對于 DNA 病毒、RNA 病毒及類病毒的檢測采用核酸雜交技術(shù)，不僅敏感性高，而且特異性強22-23。結(jié)合 PCR 和 NASH , 出現(xiàn)了PCR 微量板雜交技術(shù), 其靈敏度是 ELI

17、SA 的 1 萬倍, 特異性比普通 PCR 強。王明霞成功應(yīng)用該技術(shù)檢測了馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)24。以此為基礎(chǔ), 還發(fā)展出了熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescent in situ hybridization, FISH), 它是用特異性的核酸重復(fù)序列作為探針,用一定方法將其進行熒光標記,然后與被測目標進行雜交,通過熒光顯微鏡下可以觀察到特異的熒光信號,從而對其進行分析處理。該技術(shù)能準確檢測和定位一些基因組可以整合到寄主基因組的植物病毒。G. Harper 等應(yīng)用該技術(shù)將香蕉條紋病毒基因整合到香蕉基因組上, 這是植物病毒檢測方面的又一重大突破25。王金平等26

18、對小濱麥易位系小麥山農(nóng)0096進行抗條銹病基因的定位研究,將導(dǎo)入的抗條銹病基因定位在了4A染色體上。 4.2.聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)(Polymerase Chain Reaction，PCR) 聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）其原理即利用 DNA 半保留復(fù)制的特性，以原始 DNA 為模板合成兩條一樣的雙鏈，從而達到指數(shù)量擴增，DNA 總量可檢測的目的。另外，由于病毒的核酸有的是 DNA，有的是RNA，所以常規(guī)的 PCR 以及反轉(zhuǎn)錄 PCR 即可針對不同的病毒基因進行檢測。PCR 技術(shù)在病毒病原檢測中具有強大的靈敏性，最低可檢測的病毒含量為 fg 水平的病毒，比酶聯(lián)免疫法高出 1 000 倍27。在此基礎(chǔ)

19、上衍生了越來越多的PCR方法。 4.2.1.復(fù)合 RT-PCR（多重PCR）此種 PCR 方法是在同一 RT-PCR 反應(yīng)體系中同時使用幾對引物擴增多個目的基因片段同時檢測多個病毒。 4.2.2.實時熒光 RT-PCR將 RT-PCR 和熒光技術(shù)相結(jié)合, 與傳統(tǒng)PCR基本相同，只是在體系中加入熒光基團，反應(yīng)中利用 CCD 實時讀取熒光信號，檢測。不僅減少的污染和浪費，也使定量快速而方便，可以實現(xiàn)多樣品和高通量的反應(yīng)。實時熒光 RT-PCR 還可避免假陽性的出現(xiàn)。國內(nèi)外學者運用該項技術(shù)檢測植物病毒28, 29。 4.2.3.定量PCRPCR 擴增在某一特定擴增時期，擴增產(chǎn)物是呈指數(shù)增長的，最終

20、PCR 產(chǎn)物與模板量是直接相關(guān)的，模板定量 PCR 就是利用這一特點進行。PCR 定量關(guān)鍵是選擇好擴增呈指數(shù)增長的最佳時機和內(nèi)部設(shè)置擴增模板對照。PCR定量技術(shù)的產(chǎn)生使 RNA 定量所需模板量在極少的情況下也能進行。 4.2.4.原位 PCR原位 PCR 結(jié)合了原為雜交技術(shù)和 PCR 技術(shù)，用于檢測低拷貝的 RNA 和 DNA，同時，可以用于確定細胞來源并進行特異性的細胞內(nèi)定位。 4.2.5.巢式 PCR 巢式 PCR也稱套式 PCR (nested PCR)，設(shè)計兩套引物，先用第一套引物擴增 15-30 個循環(huán)，再用設(shè)定好的第二套引物對第一次擴增的 DNA 片段繼續(xù)擴增15-30 個循環(huán)，比

21、普通 PCR 技術(shù)有更好的特異性。它可用于檢測微量的 DNA，尤其適用于單拷貝基因的擴增和微量的生物檢測。 除以上幾種還有免疫PCR（在上述免疫法中已概述）、PCR-ELISA（用 ELISA 代替瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物）、生物素化引物模板捕捉 PCR 技術(shù)、轉(zhuǎn)錄擴增 PCR 技術(shù)(TAS-PCR)、半保留式復(fù)制 PCR 技術(shù)(3SR-PCR)、滾環(huán)擴增技術(shù)(rolling cycle amplification,RCA)(可對未知病毒序列進行擴增，使用該方法可以檢測到含量較低的 DNAB 及 DNA分子，以及復(fù)合侵染中處于劣勢地位的病毒)。 4.2.6.序列非依賴性基因體外擴增技術(shù)

22、上述PCR方法不適用于對于未知序列的病毒的鑒定檢測，序列非依賴性基因體外擴增技術(shù)可以直接偵測未知的病毒，并且不需要預(yù)知病毒的基因序列30。目前主要發(fā)展出來的方法有：Sequence-Independent Single Primer Amplification（SISPA）、Virus Discovery cDNA AFLP（VIDISCA）、Random PCR（rPCR）、Representational Difference Analysis (RDA)、Differential Display、全基因體外擴增（Whole Genome Amplification）、RNA 擴增(RNA

23、 Amplification)。4.3. dsRNA 技術(shù)（雙鏈 RNA 分析技術(shù)） 在植物體內(nèi)存在dsRNA（RNA 病毒、類病毒等在寄主體內(nèi)形成 ssRNA 的特異復(fù)制中間型），能夠證明RNA病毒和類病毒因子的存在，因為植物本身不存在dsRNA。在植物新病毒的鑒定中，某個病毒做為植物上新病原,或者檢測一種植物上存在多種病毒復(fù)合侵染都可以通過dsRNA技術(shù)來鑒定31，32；利用dsRNA技術(shù)還可以鑒別同一病毒內(nèi)的株系或分離物；該技術(shù)還可用于病毒衛(wèi)星 RNA 和亞基因組 RNA 的檢測; 用提取到的 dsRNA 為模板, 還可進行病毒的分子克隆和抗血清制備, 大大減少提取植物總 RNA 或病毒

24、 RNA 的麻煩, 簡化程序；但是此技術(shù)不能用于 DNA 病毒的檢測。萵苣巨脈病毒和萵苣小斑駁病毒就可以用dsRNA技術(shù)來鑒定檢測33，34。4.4. 芯片技術(shù)檢測法 芯片技術(shù)在植物病毒鑒定檢測中主要可用到的是基因芯片技術(shù)和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)。其中基因芯片技術(shù)是 DNA 雜交技術(shù)與熒光標記技術(shù)相結(jié)合的基因水平檢測方法, 具有靈敏度高和可靠性強的特點。其原理是將各種病毒樣品的基因片段或特征基因片段點樣, 制成基因芯片, 并以熒光標記的待檢核酸與芯片進行雜交, 雜交信號借助激光共聚焦顯微掃描技術(shù)進行實時、靈敏、準確的檢測和分析,最后通過計算機分析結(jié)果。 蛋白芯片技術(shù)，可以直接測量生物分子的特異性結(jié)合所

25、形成的生物分子復(fù)合物，并不需要象酶聯(lián)免疫或放射免疫法那樣對生物分子作標記，不會對待測生物分子活性造成任何擾動和損傷；實時檢測生物分子相互作用的動態(tài)過程。在此基礎(chǔ)上, 還發(fā)展出了基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行等質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)。5.電化學阻抗光譜法（Electrochemical Impedance Spectroscopy）35 基于電化學阻抗光譜對病毒特殊“信號”（“共振”頻率）的識別的原理，可使用微流控芯片裝置可對病毒進行鑒定檢測和濃度定量。有兩種方法，第一種方法是基于微型裝置顯化識別所謂“共振”頻率以及監(jiān)控病毒的濃度變化，第二個方法則是依賴于測量在“共振”頻率阻抗親緣關(guān)系的

26、變化。在最高“共振”頻率80赫茲時獲得了病毒的影響象征，這是一個在測定純化病毒稀釋濃度上比傳統(tǒng)的斑塊鑒定濃度的估量方法更簡單，因為它是建立在頻率測量的基礎(chǔ)上，所以在精確度測量上有更高的潛力。 植物病毒檢測在植物病毒研究中有著非常重要的意義。采用什么方法要根據(jù)病毒的種類、實際的設(shè)備條件、現(xiàn)有的技術(shù)掌握程度等。生物學鑒定方法比較直接和直觀，容易獲得相應(yīng)毒源，鑒定成本較低，但人工接種鑒定需要一定的時間，且不同的病毒感染寄主可能產(chǎn)生類似的癥狀， 需要積累一定的癥狀辨別經(jīng)驗和嚴謹認真的觀察態(tài)度。電子顯微鏡技術(shù)可直接觀察到病毒粒子的形態(tài)特征，即使現(xiàn)在鑒定技術(shù)進入了分子水平，電鏡仍有其不可替代的作用。但電鏡

27、操作需要一定的技術(shù)技能，設(shè)備成本昂貴，而且工作比較集中，不易對大量樣本進行處理。血清學技術(shù)簡便、易操作，檢測時間短，可同時檢測多個樣品，適合大部分實驗室操作，是目前病毒鑒定方法中最為常用的方法。血清學方法中常用的ELISA 方法，靈敏度高、特異性強，克服了常規(guī)血清學方法受病毒濃度、粒體形態(tài)和抗血清用量等限制的缺點。但ELISA 檢測的靈敏度和準確性受抗體的效價和特異性影響較大?；蚬こ碳夹g(shù)的興起給病毒的檢測手段帶來了新的飛躍，檢測水平已經(jīng)達到微克水平。其靈敏度和特異性是任何生化方法的檢測所不能比擬的， 同時可以省略大量的病毒提純和血清的制備工作。但分子生物學方法也有其局限性，如PCR 反應(yīng)絕大

28、部分只能利用病原物的核酸或純培養(yǎng)物作為模板， 若以受侵染植物組織的核酸粗提液或材料浸泡液作為模板，PCR 反應(yīng)將會受到嚴重抑制；另外，一些尖端的PCR 技術(shù)方法還需要特配的儀器。隨著現(xiàn)代科學技術(shù)的發(fā)展，植物病毒的鑒定和檢測只會越來越精確簡便。參考文獻：1 李雪燕.玉米鼠耳病病原鑒定及檢測系統(tǒng)建立D.西南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文，2004.2楊本榮，馬巧月.玉米粗縮病的病毒寄主范圍研究J.植物病學報，1983，13(3)：18.3袁偉.番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定、遺傳多樣性分析及其誘導(dǎo)抗性相關(guān)基因的分離D.南京農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文，2012.4張愛紅,陳丹,田蘭芝等.我國玉米病毒病的種類和病毒鑒定技

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