離體毛囊切片兩種制作方法的比較及凋亡檢測

1、離體毛囊切片兩種制作方法的比較及凋亡檢測 【關(guān)鍵詞】 體外培養(yǎng) 摘要：目的 對人頭皮游離毛囊(HF)切片制作及凋亡檢測方法進(jìn)行比較。方法 分別將石蠟切片法和冰凍切片法應(yīng)用于游離毛囊；利用原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)進(jìn)行熒光染色與3，3二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色, 檢測未經(jīng)培養(yǎng)的游離毛囊及培養(yǎng)5d的游離毛囊的不同部位凋亡細(xì)胞情況。結(jié)果 在對游離毛囊形態(tài)檢測中，各組毛囊在外根鞘(ORS)，毛球(HB)下部，真皮鞘(DS)及毛乳頭(DP)中的凋亡細(xì)胞數(shù)并無顯著性差異(P0.05)。結(jié)論 冰凍切片法應(yīng)用于游離毛囊簡單有效， TUNEL原位熒光結(jié)合DAB染色適合于檢測毛囊細(xì)胞凋亡情況。關(guān)鍵詞：毛囊；

2、體外培養(yǎng)；凋亡Comparison of two methods of section making and detection of apoptosis method on human scalp hair follicle in vitroABSTRACT: Objective To compare two methods of section making and to detect the apoptosis on human hair follicle(HF) in vitro. Methods The paraffin section and frozen section meth

3、ods were used. The TUNELfluorescence staining and 3, 3Diaminobenzidine(DAB) staining was used to investigate the apoptotic cells of different parts when the hair follicles were uncultured and cultured on 5th day. Results The process of making frozen section was more simple and feasible on single hai

4、r follicle. The apoptotic index of outer root sheath(ORS), lower part of hair bulb(HB), the dermal sheath(DS) and dermal papilla(DP) of every groups had no difference(P0.05). Conclusion The method of frozen section was more feasible on the section making of single hair follicle. The TUNEL with fluor

5、escence staining and DAB staining was suitable for the detection of apoptotic status of hair follicle.KEY WORDS: hair follicle; culture in vitro; apoptosis毛囊的凋亡現(xiàn)象與毛囊的周期性生長關(guān)系密切。雖然與毛囊相關(guān)的生物學(xué)研究廣泛開展,但對毛囊凋亡的系統(tǒng)研究仍不多。以往對生長期與休止期毛囊凋亡現(xiàn)象的探討主要以定性討論為主。在本實(shí)驗(yàn)中,我們試圖采用原位末端標(biāo)記技術(shù)對不同部位毛囊細(xì)胞的凋亡情況做一描述。以前的研究中我們曾采用冰凍切片機(jī)進(jìn)行了游離毛囊

6、切片的制作，顯現(xiàn)出有別于石蠟切片的優(yōu)越性1。在本實(shí)驗(yàn)中，我們還試圖比較石蠟切片法與冰凍切片法在毛囊細(xì)胞凋亡檢測中的優(yōu)缺點(diǎn)。 1 材料與方法1.1 人頭皮游離毛囊培養(yǎng)模型 標(biāo)本來源于整形外科除皺頭皮切口周邊頭皮(年齡18-45歲)。培養(yǎng)基成分和模型構(gòu)建參見文獻(xiàn)。 1.2 游離毛囊冰凍切片的制作 游離毛囊分為未經(jīng)培養(yǎng)的游離毛囊和培養(yǎng)5d的游離毛囊兩組，每組12個(gè)毛囊。在倒置顯微鏡下選取無損傷的游離毛囊，固定后，200g/L蔗糖溶液浸泡24h，在-29下，先將樣品盤上的冰凍包埋劑 (optimal cutting temperature, OCT)修出一平臺(tái)，再用無損傷鑷將毛囊以垂直刀口方向(毛球部

7、朝向刀口)放在已修出的平臺(tái)上，然后以O(shè)CT覆蓋，冷凍10min后作4m厚的冰凍切片，邊切邊在顯微鏡下觀察，以便獲得游離毛囊完整的中心縱剖面。1.3 人頭皮游離毛囊石蠟切片的制作 選取形態(tài)好的游離毛囊，用Bouin固定液固定30min，乙醇脫色，15g/L瓊脂加熱溶化并冷卻到50時(shí)將組織放入浸泡, 待瓊脂完全凝固后，將內(nèi)有毛囊的瓊脂用刀片修成5mm3左右的長方形小塊，再固定30min后，按梯度進(jìn)行脫水，二甲苯透明，常規(guī)包埋，再以石蠟切片機(jī)修整后，調(diào)整角度，切成7m左右的切片，HE染色。1.4 原位細(xì)胞凋亡檢測 采用原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，DAB顯色試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)，用原位熒光染

8、色結(jié)合DAB染色進(jìn)行分析，對毛囊Auber限界線下的毛球部、毛囊外根鞘細(xì)胞、毛囊真皮鞘及毛乳頭細(xì)胞進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)各毛囊切片的不同部位的凋亡指數(shù)(陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)100%)。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)輸入SPSS11.0進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)經(jīng)KolmogorovSmirnov檢驗(yàn)P0.05，尚不能認(rèn)為各組樣本來自的總體不服從正態(tài)分布，且各組數(shù)據(jù)經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)P0.05。故運(yùn)用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。2 結(jié)果2.1 游離毛囊的基本結(jié)構(gòu)特征 冰凍切片形態(tài)：HE染色后在光學(xué)顯微鏡下可見毛皮質(zhì)、內(nèi)皮根鞘、外皮根鞘（ORS）及真皮鞘(DS)等清晰結(jié)構(gòu)；各層間連續(xù)性較好，分離較少。整個(gè)毛球（HB）部邊緣

9、平整，結(jié)構(gòu)清楚，核漿比例大，細(xì)胞形態(tài)清晰。毛乳頭（DP）邊界清楚圓滑，呈梭形。內(nèi)根鞘呈粉紅色連續(xù)帶狀，緊貼于毛小皮。外根鞘細(xì)胞較多，核深染。真皮鞘中可見少量的成纖維細(xì)胞，與外根鞘分離較少。石蠟切片形態(tài)：可分辯出各層的大體結(jié)構(gòu)，但各層之間有明顯的分離，靠近毛干側(cè)分離嚴(yán)重。整個(gè)毛球部邊緣不規(guī)整，結(jié)構(gòu)混亂，細(xì)胞形態(tài)不清晰。毛乳頭邊界不清。內(nèi)皮根鞘不完整，中間有較多中斷，且與毛小皮有明顯的分離（圖1）。外根鞘細(xì)胞層次少，與真皮鞘有非常明顯的分離。真皮鞘呈條帶狀與其他結(jié)構(gòu)完全分開。 圖1 正常人頭皮游離毛囊的形態(tài)（略）Fig.1 The status of normal human scalp hair

10、 folliclea: frozen section method; b: paraffin section HE 10102.2 凋亡狀況的光鏡觀察結(jié)果 在加入熒光素dUTP后，加入轉(zhuǎn)化劑POD之前，在500-550nm波長熒光顯微鏡下可見到以藍(lán)色熒光激發(fā)出的綠色熒光的陽性結(jié)果(圖2a)；加入轉(zhuǎn)化劑POD后DAB顯色，蘇木素復(fù)染后可見棕色的陽性細(xì)胞和藍(lán)色的陰性細(xì)胞(圖2b)。未經(jīng)培養(yǎng)的生長期游離毛囊的凋亡情況：生長期毛囊的TUNEL陽性結(jié)果主要圍繞角化的毛皮質(zhì)成“袋狀”結(jié)構(gòu)分布，可見于內(nèi)根鞘Henle層、Huxley層、外皮根鞘內(nèi)側(cè)；而真皮組織鞘及毛乳頭中，均少見陽性染色。而頭皮切片中的毛囊

11、細(xì)胞凋亡情況與未經(jīng)培養(yǎng)的游離毛囊細(xì)胞凋亡情況相似。培養(yǎng)5d的游離毛囊TUNEL陽性細(xì)胞分布部位及數(shù)量與未經(jīng)培養(yǎng)的游離毛囊相似。未經(jīng)培養(yǎng)的退行早期游離毛囊鏡下可見：在外皮根鞘的廣泛區(qū)域內(nèi)均有一定數(shù)量的陽性細(xì)胞。母質(zhì)區(qū)、母質(zhì)上區(qū)、上皮索、毛乳頭周圍的上皮性細(xì)胞陽性較多。毛乳頭及真皮鞘中陽性結(jié)果少見。圖2 未經(jīng)培養(yǎng)的生長期游離毛囊的凋亡情況（略）Fig.2 The apoptotic status of uncultured hair follicle on anagen a: fluorescence (1010); b: DAB (1010)2.3 各部位凋亡細(xì)胞統(tǒng)計(jì)結(jié)果 見表1。表1 各組生長

12、期游離毛囊的凋亡指數(shù)（略）Table 1 The apoptotic index of hair follicle of anagen 3 討論3.1 瓊脂預(yù)包埋石蠟切片的優(yōu)缺點(diǎn) 石蠟切片的制作步驟本身就繁多，又由于游離毛囊體積較小，容易丟失，而且定位困難，操作時(shí)容易被夾碎，這些缺陷給毛囊的形態(tài)學(xué)觀察帶來了一定的困難。因此，有學(xué)者采用瓊脂預(yù)包埋法對毛囊進(jìn)行處理。采用瓊脂預(yù)包埋實(shí)際上相當(dāng)于擴(kuò)大了組織的體積，并使組織定位成為可能，使操作更為方便。瓊脂浸泡過的材料，凝膠呈薄層狀均勻地包在組織塊外周，并滲入到大的組織間隙中，對組織各部分之間起了一定的粘著作用；在脫水，透明過程中降低了乙醇和二甲苯對組織

13、的收縮和硬化作用。因此，降低了易脆或易變碎材料的脆性。在實(shí)際操作過程中，通過我們多次摸索，推測15g/L的瓊脂濃度較目前較多采用的20g/L的濃度效果更佳。瓊脂預(yù)包埋法還有一些缺陷尚待克服，如形成組織周圍的輕度背景著色，包埋塊不宜過小，溫度不易控制等等，但對游離毛囊來講無疑克服了操作過程中的很多不利因素，是石蠟包埋前可行的預(yù)包埋方法。3.2 冰凍切片的優(yōu)缺點(diǎn) 整個(gè)毛囊由20余種細(xì)胞所組成, 最中間為硬度較大的毛干，脆性較大，周圍為軟組織，在用石蠟切片法制作切片時(shí)，容易造成軟硬組織之間的分離，如何獲得完整的毛囊中心縱剖面一直是一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)。經(jīng)過多次操作實(shí)踐，我們認(rèn)為冰凍切片法的過程相對較為簡單，

14、制作步驟少，制作周期較石蠟切片短，不需要進(jìn)行預(yù)包埋，能夠克服石蠟切片制作過程中較多難點(diǎn)，但應(yīng)注意在切片前最好先用蔗糖溶液浸泡，以防止冰晶的產(chǎn)生，而且降溫的速度宜快，使標(biāo)本的溫度與低溫箱的溫度相同(標(biāo)本溫度過熱切片組織易被擠壓，組織結(jié)構(gòu)重疊；溫度太低時(shí)，切片組織易脆裂)。本次實(shí)驗(yàn)我們采用了-29的低溫，可以獲得4m左右的切片，切片刀片要求鋒利，太鈍容易造成毛干與組織鞘分離；高速切削可能會(huì)取得良好結(jié)果，但對毛囊，仍需要低速，速度太快，切片厚度不均勻，還會(huì)造成真、表皮分離或毛干與組織鞘分離。操作中發(fā)現(xiàn)橫切易使毛干與組織鞘分離；故應(yīng)先將樣品臺(tái)上的OCT修出平臺(tái)，放置毛囊時(shí)應(yīng)注意使毛囊球部朝向刀口，這樣

15、才有利于獲得縱剖面。這一方法簡單易行，但對冰凍切片機(jī)要求較高。石蠟切片是較為傳統(tǒng)的組織切片制作方法，由于需要進(jìn)行梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、切塊等許多環(huán)節(jié)的操作，所以標(biāo)本在制作過程中的流失較為嚴(yán)重；在切片過程中，不能確定客觀的平面, 主要憑借操作者的主觀判斷進(jìn)行調(diào)整，獲得完整的毛囊縱剖面相對較為困難，所以獲得切片的總體效果不如冰凍切片。3.3 凋亡檢測方法的探討 本次實(shí)驗(yàn)，我們主要采用原位熒光染色與DAB染色相結(jié)合的方法在原位探討了毛囊的凋亡現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)了即使在生長期的毛囊中也存在著凋亡現(xiàn)象，由于毛囊中含有黑色素顆粒，DAB染色時(shí)陽性細(xì)胞顯示棕色,故單純用DAB結(jié)合復(fù)染觀察時(shí)黑色素會(huì)對陽性細(xì)胞有

16、一定的干擾，但結(jié)合熒光染色進(jìn)行觀察則可以最直觀地對凋亡結(jié)果進(jìn)行顯示。通過反復(fù)實(shí)踐我們還發(fā)現(xiàn)，瓊脂預(yù)包埋法應(yīng)用于游離毛囊的石蠟切片，可擴(kuò)大組織體積，使定位更為方便。石蠟切片法和冰凍切片法都可用于毛囊的組織觀察，冰凍切片法由于步驟簡單，對毛囊的形態(tài)影響較小，因此我們推測更適合凋亡的檢測。3.4 毛囊各部位細(xì)胞的凋亡 在實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到外根鞘由于存在圍繞毛干的角化所發(fā)生的凋亡現(xiàn)象，所以即使在正常的游離毛囊中也存在一定的凋亡水平，而且是以毛干為中心向真皮鞘方向逐漸發(fā)生。Narisawa等通過對人頭皮毛囊的觀察，發(fā)現(xiàn)在生長期毛囊外根鞘可呈現(xiàn)“口袋狀結(jié)構(gòu)”的凋亡現(xiàn)象。Soma等通過對生長期游離毛囊的原位

17、凋亡染色發(fā)現(xiàn)，內(nèi)根鞘中存在大量的凋亡細(xì)胞，相鄰的角化區(qū)域也呈陽性染色，毛乳頭和真皮鞘則很少出現(xiàn)陽性細(xì)胞。在退行期毛囊、外皮根鞘的外層、上皮條索、毛乳頭周圍的上皮源性細(xì)胞都可見陽性細(xì)胞, 而且發(fā)現(xiàn)TUNEL陽性細(xì)胞的增長是在從不發(fā)生終末改變的地方發(fā)生的。與我們的研究結(jié)果基本一致。所以我們初步推測正常毛囊的凋亡現(xiàn)象可分為兩類，一類是圍繞著角化這一現(xiàn)象發(fā)生的，毛囊中存在的較多的凋亡現(xiàn)象，即內(nèi)根鞘、外根鞘內(nèi)側(cè)的類似于“袋狀”結(jié)構(gòu)的凋亡。另一種凋亡是與毛囊細(xì)胞的這種終末轉(zhuǎn)變無關(guān)的個(gè)別細(xì)胞的凋亡。我們的研究結(jié)果提示冰凍切片應(yīng)用于游離毛囊簡單有效，TUNEL原位熒光結(jié)合DAB染色適合于檢測毛囊細(xì)胞的凋亡情況。參考文獻(xiàn)：1楊壯群, 屠軍波, 姚天華, 等. NGF與雌激素對離體培養(yǎng)的人頭皮毛囊影響的實(shí)驗(yàn)研究 J. 中華整形外科雜志, 2004, 20(1): 4850.屠軍波, 楊壯群, 姚天華, 等. 游離毛囊體外培養(yǎng)模型構(gòu)建及形態(tài)學(xué)檢查 J. 中國美容醫(yī)學(xué)雜志, 2003,12(6): 565568.鐘白玉, 伍津津, 劉榮卿, 等. 游離毛囊的常規(guī)病理制片技術(shù) J. 中華皮膚科雜志, 1995, 28(4):250.Narisawa Y, Nashimoto K, Konda H. Ap