細胞因子檢測方法的現(xiàn)狀

1、細胞因子檢測方法的現(xiàn)狀            【關(guān)鍵詞】  細胞因子      目前，細胞因子已廣泛應(yīng)用于臨床的已有EPO、IFN-、G-CSF、GM-CSF以及試用于臨床的白細胞介素等。為了研究細胞因子在生理系統(tǒng)的作用以及了解細胞因子產(chǎn)品用于臨床治療的效果，進行細胞因子的檢測就必不可少，而且用于臨床診斷的細胞因子分析方法必須適用于常規(guī)操作。細胞因子的檢測尚未在臨床診斷上廣泛開展，已知目前采用的細胞因子檢測方法均不完

2、善，且不同的檢測方法所得的結(jié)果差異較大，給臨床治療帶來一定的困難。因此，有必要了解各種檢測方法的特性及影響細胞因子濃度的因素。1 原理和方法細胞因子的發(fā)現(xiàn)依賴于其生物學(xué)活性，因此，建立了生物分析法用于細胞因子的檢測。隨后，用于檢測實驗溶液（如組織培養(yǎng)上清液）中細胞因子的免疫分析法被建立，并不斷用于實驗室研究。但準確地、可重復(fù)地測定細胞因子具有一定困難，主要原因是眾所周知的細胞因子的含量極低（大部分都是以pmol/L計），同時存在著源于異嗜性抗體，類風(fēng)濕因子以及特異的和非特異的細胞因子結(jié)合蛋白等 1，2 的顯著干擾。細胞因子生物學(xué)活性檢測和濃度測定的分析方法主要有以下幾類 3 。1.1 生物分析

3、法 生物分析法方便，敏感性高，但所有細胞系有可能受幾種細胞因子的影響，特異性則較差。又由于可溶性細胞因子受體等抑制劑的存在，使生物分析法可能低估細胞因子的活性。常用的方法有2種:（1）依賴性細胞株增敏實驗。一些腫瘤細胞株依賴于細胞因子方能在體外增殖，如TF-1細胞株依賴于GM-CSF和IL-3 4，5 ，CTLL細胞株依賴于IL-2，TTD-1細胞株依賴于IL-6等 4 ?？衫眠@些依賴株檢測相應(yīng)的細胞因子。但是，并非所有細胞因子均有相應(yīng)的依賴株，因此限制了此法的應(yīng)用。（2）功能檢測實驗。利用一些細胞因子的功能特性而建立相應(yīng)的活性測定方法。如IFN抗病毒實驗和TNF對L 929 細胞的殺傷作用

4、等 4 。此外，生物分析法還有骨髓集落形成實驗，細胞毒或細胞抑制實驗，次級分子分泌的誘導(dǎo)，化學(xué)趨化和細胞因子分泌性的抑制實驗等。1.2 免疫分析法 利用抗原機體反應(yīng)的原理，制備出抗細胞因子的單抗或多抗，可進行細胞因子的免疫檢測，它包括放免實驗（RIA）和酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）等。其優(yōu)點是高特異性、高靈敏度、操作簡便。缺點是不能證明被測細胞因子是否為具有完整生物活性結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)而非變性蛋白質(zhì)。1.3 CKmRNA的測定 （1）分子雜交實驗:首先制備出細胞因子的基因探針，通過分子雜交檢測細胞內(nèi)CKmRNA的表達。（2）逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）法技術(shù):可快速、靈敏地檢測表達很低的CKmR

5、NA，并可同時測定同一樣本中多種CKmRNA，操作過程包括細胞因子產(chǎn)生細胞的RNA提取，mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，在細胞因子引物的引導(dǎo)下，即可進行PCR擴增。根據(jù)定量CKmRNA方法和原理的不同，可分為半定量PCR法，競爭性定量PCR法，內(nèi)參標定量PCR法，HPLC-PCR法和酶聯(lián)免疫定量PCR法 6 。目前市售的商品試劑盒已能用于大多數(shù)細胞因子的檢測，但因其價格昂貴而阻礙了其廣泛使用。同時，人細胞因子的測定仍存在許多問題，檢測方法選擇不當可能得到不一致的結(jié)果，有時有必要選擇一個以上的檢測方法測定細胞因子。2 靈敏度細胞因子具有很強的生物學(xué)活性，其生物分析法的靈敏度極高。

6、然而，在測定血漿中細胞因子正常濃度時，難以確定免疫分析法令人滿意的靈敏度。不同細胞因子的參考值變化很大，難以定義其參考值范圍。如Damas等 7 在研 究細胞因子與敗血癥時，使用兩步免疫放射測定實驗（IRMA）測定IL-6（靈敏度:5ng/ml）一步IRMA法測定TNF-（靈敏度:5ng/L）和IL-1（靈敏度:4ng/L），在正常血清中未測得上述細胞因子。而Riikonen等使用具有相似檢測限的RIA法，在20例健康兒童中，IL-1的平均濃度為12.1ng/L，IL-6的平均濃度為83ng/L;在71例健康兒童中，TNF-的平均濃度為40±2ng/L。由此可見，不同的免疫分析方法之

7、間存在極大的差異，其靈敏度變化可能是由于其準確度和特異性的不同而引起。3 準確度和特異性影響細胞因子檢測準確度和特異性的因素有:（1）抗體:單抗的表位識別;（2）細胞因子:多種分子形式，結(jié)合蛋白復(fù)合物、抑制劑和可溶性受體復(fù)合物;（3）血漿基質(zhì):干擾抗體，異嗜性抗體和類風(fēng)濕因子;（4）標準:重組參考物質(zhì)可能不顯示與樣品平行的劑量反應(yīng)曲線。3.1 細胞因子結(jié)合蛋白 已知IL-1、TNF-和IL-6能結(jié)合從細胞進入血漿的可溶性受體或特異的拮抗劑。免疫分析法是否能識別這樣的結(jié)合形式幾乎是未知的，但是對TNF的研究得出了一些重要結(jié)論。20世紀80年代后期，Lancet上發(fā)表了大量關(guān)于癌癥病人TNF-測定

8、缺乏可靠性和生物分析法與免疫分析法關(guān)系的文章。但使用競爭性免疫分析法時，癌癥病人與敗血癥病人的TNF-是可被檢測的。而ELISA法由于不能測定TNF-與P 55 TNF受體的結(jié)合物而無法測定癌癥病人血漿中的TNF-。3.2 血漿中包含幾種形式的IL-6分子，它們與一些抗血清的作用較弱，缺乏生物學(xué)活性并與其它血漿蛋白質(zhì)以及IL-6的可溶性受體組成復(fù)合物。已知IL-6免疫分析法和生物分析測定其在正常血清中的濃度為0或在1075ng/L范圍，敗血癥病人的IL-6濃度升高到12g/L，腦膜炎病人的IL-6濃度升到200g/L。然而，May等說明大多數(shù)的檢測方法僅僅測定了低分子量的IL-6，他們采用能識

9、別IL-6高分子量的單抗，測得在正常血清中IL-6的濃度為110g/L，并且在1例骨髓移植后病人的血清樣品中，測得IL-6的濃度為510mg/L。3.3 多種分子的形式 一些細胞因子的多種分子形式已被充分認識，但是其對細胞因子測定影響的重要性并未得到徹底的研究。IL-6是一個最好的例子，它由一個位于第7染色體上，包含5個外顯子的單一多杰基因編碼。其氨基酸序列包括幾個潛在的O-糖基位點，2個N-糖基位點和幾個絲氨酸磷酸化位點。由細菌產(chǎn)生的重組IL-6的相對分子量為21Kd。人成纖維細胞至少分泌6種形式，相對分子量為2330Kd的IL-6，它們均是糖蛋白，能在敗血癥病人的血漿中被檢測。人內(nèi)皮細胞分

10、泌一種分子量為45Kd的IL-6，它似乎是血漿中的IL-6的主要存在形式。3.4 人血漿中的干擾物質(zhì) 血漿中通常包含有與IgG反應(yīng)的抗體。這些異嗜性的抗體可影響夾心免疫分析法，它們在俘獲抗體和被標記的抗體間形成橋梁，而錯誤地導(dǎo)致高分析值。研究表明，15%40%的病人樣本中含有能夠干擾檢測的抗體。異嗜性抗體能與鼠、兔和牛血清免疫球蛋白發(fā)生反應(yīng)，在大多數(shù)情況下，它們與牛IgG的結(jié)合最強。在檢測中，加入正常的非免疫動物血清吸附異嗜性抗體，常能夠消除這種形式的干擾。3.5 類風(fēng)濕因子是IgM的自身抗體 Hamilton等的研究說明，IgM類風(fēng)濕因子與鼠IgG的結(jié)合發(fā)生于1%的健康獻血者和31%的類風(fēng)濕

11、關(guān)節(jié)炎病人。然而，也有研究表明，在9.1%的正常獻血者中發(fā)生了這類結(jié)合。這些抗體可造成與異嗜性抗體完全相同的影響，并且他們在對細胞因子檢測具有特別意義的類風(fēng)濕病患者中的濃度極高。4 精密度細胞因子免疫分析法的精密度較其生物分析法有較大提高。在要求的濃度范圍，免疫分析法的批內(nèi)變異通常為20%25%，因此有必要進行2次或3次檢測。批間變異甚至可能高于批內(nèi)變異。許多商品試劑盒適用于測定在相對高范圍的細胞因子濃度，但是一些文獻報道了很低的、位于標準曲線上精密度極差處的濃度。5 標準化目前，重組細胞因子是僅有的標準。這些由細菌產(chǎn)生的細胞因子是非糖基化的，并不包括細胞因子可能存在于血漿中的多種形式。由于樣

12、品本身的問題，在檢測中，標準與樣品可能得不到一致的結(jié)果。美國國家生物標準及控制局（NIBSC）提供的一系列標準在一定程度上有助于解決細胞因子檢測結(jié)果不一致的問題。然而，由于前面所述的原 因，甚至在使用相同的標準時，不同的測定方法測定相同的樣品，仍可能得出極其不同的結(jié)果。綜上所述，應(yīng)認識到在檢測細胞因子時，必須考慮到細胞因子的作用具有網(wǎng)絡(luò)性的特點和上述問題。人們需明確檢測方法所測定的細胞因子成分，并考慮其抑制劑和可溶性受體的水平，將生物分析法和免疫分析法結(jié)合使用，有可能得到較為可靠的結(jié)果。當然，準確，靈敏的檢測方法是進行細胞因子研究的首要條件，臨床診斷需要相對容易的操作。隨著細胞因子在治療中應(yīng)用的逐步增加，其檢測必將被廣泛的使用。 參考文獻1 Debets R，et al.Immunol Today，1994，15:455.2 Klein B，et