堿性磷酸酶Km值的測定

1、堿性磷酸酶Km值的測定 1.了解酶的了解酶的Km值測定原理和方值測定原理和方法法2掌握堿性磷酸酶（掌握堿性磷酸酶（AKP）活）活性測定的原理和方法性測定的原理和方法 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹吭跍囟?，在溫度，PH及酶濃度恒定的條件下，酶促及酶濃度恒定的條件下，酶促反應(yīng)的初速度隨底物濃度（反應(yīng)的初速度隨底物濃度（S）增大而增加，）增大而增加，但當(dāng)?shù)孜餄舛仍龃蟮揭欢O限時，則反應(yīng)但當(dāng)?shù)孜餄舛仍龃蟮揭欢O限時，則反應(yīng)速度趨于恒定，此最大反應(yīng)速度速度趨于恒定，此最大反應(yīng)速度Vmax，反，反應(yīng)速度與底物濃度之間的關(guān)系可用米氏方應(yīng)速度與底物濃度之間的關(guān)系可用米氏方程來表示，即：程來表示，即：【實(shí)驗(yàn)原理】 VmaxS V

2、= Km + S 其中其中Km為米氏常數(shù)，為米氏常數(shù)， Vmax為最大反應(yīng)速度，為最大反應(yīng)速度， 當(dāng)當(dāng)V=Vmax/2時，則時，則Km=s。 Km是酶的特征常數(shù)，測定是酶的特征常數(shù)，測定Km是研究酶是研究酶的一種方法的一種方法 將米氏方程變形為雙倒數(shù)方程，以將米氏方程變形為雙倒數(shù)方程，以l/ v1s作圖，將各點(diǎn)連線，在橫軸截作圖，將各點(diǎn)連線，在橫軸截距為距為-km，據(jù)此可算出，據(jù)此可算出Km值。值。1/V=Km/ VmaxS + 1/ Vmax S1/2VMAXOD510VMAXKm底物濃度與反應(yīng)速度關(guān)系曲線底物濃度與反應(yīng)速度關(guān)系曲線雙倒數(shù)曲線雙倒數(shù)曲線 1/s1/OD510-1/Km1/Vm

3、ax 本實(shí)驗(yàn)以堿性磷酸酶為例，用本實(shí)驗(yàn)以堿性磷酸酶為例，用磷酸苯二鈉磷酸苯二鈉為其底物，生成酚和磷為其底物，生成酚和磷酸，酚在堿性溶液中與酸，酚在堿性溶液中與4一氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化一氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成生成紅色醌紅色醌的衍生物，根據(jù)紅色的深淺可測出酶活力高低。其反的衍生物，根據(jù)紅色的深淺可測出酶活力高低。其反應(yīng)式如下：應(yīng)式如下： 磷酸苯二鈉磷酸苯二鈉+H2O AKP OH- 苯酚苯酚 苯酚苯酚+4-氨基安替比林氨基安替比林K3Fe(CN)6 醌衍生物醌衍生物 （紅色（紅色） 光密度與顏色，顏色與酚，酚與酶活性成正比，故以光密度與顏色，顏色與酚，酚與酶活性成正比，故

4、以1/A 取代取代1/v 作為縱坐標(biāo)作圖作為縱坐標(biāo)作圖1. 0.04 M(40mM) 磷酸苯二鈉溶液（底物液）磷酸苯二鈉溶液（底物液）2. 0.1 M 碳酸鹽緩沖液（碳酸鹽緩沖液（pH 10.0）3. 0.05 mg/ml 堿性磷酸酶溶液（堿性磷酸酶溶液（Ap）4. 0.5 M NaOH5. 0.3 % 4-氨基安替比林氨基安替比林6. 0.5% 鐵氰化鉀鐵氰化鉀【實(shí)驗(yàn)試劑】【實(shí)驗(yàn)操作】管 號1 2 3 4 5 6 7 8底物液底物液(40mM)碳酸緩碳酸緩液液(pH=10)蒸餾水蒸餾水0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0.00 0.90 0.90 0.90

5、 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.95 0.85 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1.00混勻后混勻后37水浴，預(yù)溫水浴，預(yù)溫5分鐘左右分鐘左右 加入酶液后立即混勻（保持加入酶液后立即混勻（保持37水?。。?，反應(yīng)開始。反應(yīng)開始。從加入酶液起計時至下一步從加入酶液起計時至下一步 加入堿性加入堿性溶液停止反應(yīng)，溶液停止反應(yīng)，各管反應(yīng)時間應(yīng)準(zhǔn)確一各管反應(yīng)時間應(yīng)準(zhǔn)確一致，為致，為15分鐘。分鐘。堿性溶液堿性溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.04-氨基安氨基安 替比林替比林鐵氰化鉀鐵氰化鉀 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混勻，室溫放置混勻，室溫放置10分鐘左右分鐘左右, 以以8號管為號管為空白，于空白，于5l0nm比色，記錄各管的光密度比色，記錄各管的光密度【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】底物濃度底物濃度 mmol/L 1 3 5 6 8 12 16 0 1/S 1/OD1 0.333 0.200 0.16