堿性磷酸酶Km值的測定

1、堿性磷酸酶Km值的測定 1.了解酶的了解酶的Km值測定原理和方值測定原理和方法法2掌握堿性磷酸酶（掌握堿性磷酸酶（AKP）活）活性測定的原理和方法性測定的原理和方法 【實驗目的】在溫度，在溫度，PH及酶濃度恒定的條件下，酶促及酶濃度恒定的條件下，酶促反應的初速度隨底物濃度（反應的初速度隨底物濃度（S）增大而增加，）增大而增加，但當底物濃度增大到一定極限時，則反應但當底物濃度增大到一定極限時，則反應速度趨于恒定，此最大反應速度速度趨于恒定，此最大反應速度Vmax，反，反應速度與底物濃度之間的關系可用米氏方應速度與底物濃度之間的關系可用米氏方程來表示，即：程來表示，即：【實驗原理】 VmaxS V

2、= Km + S 其中其中Km為米氏常數，為米氏常數， Vmax為最大反應速度，為最大反應速度， 當當V=Vmax/2時，則時，則Km=s。 Km是酶的特征常數，測定是酶的特征常數，測定Km是研究酶是研究酶的一種方法的一種方法 將米氏方程變形為雙倒數方程，以將米氏方程變形為雙倒數方程，以l/ v1s作圖，將各點連線，在橫軸截作圖，將各點連線，在橫軸截距為距為-km，據此可算出，據此可算出Km值。值。1/V=Km/ VmaxS + 1/ Vmax S1/2VMAXOD510VMAXKm底物濃度與反應速度關系曲線底物濃度與反應速度關系曲線雙倒數曲線雙倒數曲線 1/s1/OD510-1/Km1/Vm

3、ax 本實驗以堿性磷酸酶為例，用本實驗以堿性磷酸酶為例，用磷酸苯二鈉磷酸苯二鈉為其底物，生成酚和磷為其底物，生成酚和磷酸，酚在堿性溶液中與酸，酚在堿性溶液中與4一氨基安替比林作用，經鐵氰化鉀氧化一氨基安替比林作用，經鐵氰化鉀氧化生成生成紅色醌紅色醌的衍生物，根據紅色的深淺可測出酶活力高低。其反的衍生物，根據紅色的深淺可測出酶活力高低。其反應式如下：應式如下： 磷酸苯二鈉磷酸苯二鈉+H2O AKP OH- 苯酚苯酚 苯酚苯酚+4-氨基安替比林氨基安替比林K3Fe(CN)6 醌衍生物醌衍生物 （紅色（紅色） 光密度與顏色，顏色與酚，酚與酶活性成正比，故以光密度與顏色，顏色與酚，酚與酶活性成正比，故

4、以1/A 取代取代1/v 作為縱坐標作圖作為縱坐標作圖1. 0.04 M(40mM) 磷酸苯二鈉溶液（底物液）磷酸苯二鈉溶液（底物液）2. 0.1 M 碳酸鹽緩沖液（碳酸鹽緩沖液（pH 10.0）3. 0.05 mg/ml 堿性磷酸酶溶液（堿性磷酸酶溶液（Ap）4. 0.5 M NaOH5. 0.3 % 4-氨基安替比林氨基安替比林6. 0.5% 鐵氰化鉀鐵氰化鉀【實驗試劑】【實驗操作】管 號1 2 3 4 5 6 7 8底物液底物液(40mM)碳酸緩碳酸緩液液(pH=10)蒸餾水蒸餾水0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0.00 0.90 0.90 0.90

5、 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.95 0.85 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1.00混勻后混勻后37水浴，預溫水浴，預溫5分鐘左右分鐘左右 加入酶液后立即混勻（保持加入酶液后立即混勻（保持37水?。?，水?。磻_始。反應開始。從加入酶液起計時至下一步從加入酶液起計時至下一步 加入堿性加入堿性溶液停止反應，溶液停止反應，各管反應時間應準確一各管反應時間應準確一致，為致，為15分鐘。分鐘。堿性溶液堿性溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.04-氨基安氨基安 替比林替比林鐵氰化鉀鐵氰化鉀 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混勻，室溫放置混勻，室溫放置10分鐘左右分鐘左右, 以以8號管為號管為空白，于空白，于5l0nm比色，記錄各管的光密度比色，記錄各管的光密度【實驗結果】底物濃度底物濃度 mmol/L 1 3 5 6 8 12 16 0 1/S 1/OD1 0.333 0.200 0.16