真菌的實驗診斷2008.08.26——胡主任

1、1真菌感染的實驗診斷真菌感染的實驗診斷天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院胡志東胡志東E-mail 2真菌感染的危險因素真菌感染的危險因素：n中心靜脈插管中心靜脈插管n尿道插管尿道插管n廣譜抗生素廣譜抗生素n氣管插管氣管插管n腹部外科腹部外科n腸胃外營養(yǎng)腸胃外營養(yǎng)n營養(yǎng)不良營養(yǎng)不良n住院時間住院時間感染之前定殖感染之前定殖3醫(yī)學(xué)重要的酵母菌分類醫(yī)學(xué)重要的酵母菌分類Segal B, Bow EJ, Menichetti F: Infect Dis Clin N Am 2002;16:935-64 條件致病的酵母菌條件致病的酵母菌 念珠菌屬念珠菌屬 非念珠菌屬非念珠菌屬白念珠菌 非白念珠菌熱帶念珠

2、菌近平滑念珠菌光滑念珠菌克柔念珠菌季也蒙念珠菌葡萄牙念珠菌 隱球菌屬隱球菌屬新型隱球菌新型隱球菌毛孢子菌屬 白吉利毛孢子菌頭狀毛孢子菌 酵母屬 釀酒酵母 紅酵母屬4 霉菌 曲霉菌屬 非曲霉菌屬 煙曲霉煙曲霉非煙曲霉非煙曲霉 黃曲霉黑曲霉土曲霉 鐮刀霉茄病鐮刀霉尖孢鐮刀霉 賽多孢屬尖端賽多孢多育賽多孢 接合菌根霉屬毛霉屬根毛霉屬梨頭霉屬小克銀漢霉屬 暗色孢霉鏈格孢霉屬萬氏霉屬雙極菌屬彎孢屬醫(yī)學(xué)重要的霉菌分類醫(yī)學(xué)重要的霉菌分類Segal B, Bow EJ, Menichetti F: Infect Dis Clin N Am 2002;16:935-645診斷方法n影像學(xué)影像學(xué)n組織病理學(xué)組織病

3、理學(xué)/細(xì)胞學(xué)細(xì)胞學(xué)n培養(yǎng)培養(yǎng)n血清學(xué)血清學(xué)n分子生物學(xué)方法：分子生物學(xué)方法： Platelia Aspergillus ELISA Fungitell assay PCR（unavailable）傳統(tǒng)的方法傳統(tǒng)的方法6Time Axis of Methods for Detection of Pulmonary Aspergillosis 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 chestX-rayantigenPCRKami M et al, Clin Infect Dis 2001;33:1504-127真菌病實驗室診斷主要內(nèi)容準(zhǔn)確、快速檢出真菌病原體n真菌

4、鏡檢n真菌培養(yǎng)n組織病理n生理生化n血清學(xué)方法n分子生物學(xué)8真菌感染的診斷n直接涂片直接涂片n真菌培養(yǎng)真菌培養(yǎng)n組織病理真菌培養(yǎng)是組織病理真菌培養(yǎng)是“金標(biāo)準(zhǔn)金標(biāo)準(zhǔn)”9n非經(jīng)口痰標(biāo)本非經(jīng)口痰標(biāo)本n非插管尿標(biāo)本非插管尿標(biāo)本血液或其他無菌體液血液或其他無菌體液(膽汁、膽汁、胸腹水、腦脊液）胸腹水、腦脊液）10直接鏡檢的浮載液和染色劑nKOH-1020%-皮膚標(biāo)本nGram stain-真菌均為陽性nCalcofluor white-熒光染色nIndia-ink-墨汁染色nLPCB-乳酸酚棉藍nImmunofluorescence-免疫熒光11直接鏡檢直接鏡檢n對痰、竇道排泄物及氣管沖洗液等對痰、竇道

5、排泄物及氣管沖洗液等標(biāo)本直接鏡檢可以看到透明分支的標(biāo)本直接鏡檢可以看到透明分支的菌絲、膿血或痰太粘稠用菌絲、膿血或痰太粘稠用10KOH處理后再進行鏡檢處理后再進行鏡檢n如果曲霉菌寄生與空氣相通的器官如果曲霉菌寄生與空氣相通的器官中，鏡檢甚至可以看到曲霉頭菌絲中，鏡檢甚至可以看到曲霉頭菌絲有隔，呈二叉型，有隔，呈二叉型，45 分枝。分枝。1213直接鏡檢直接鏡檢酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞14隱球菌病隱球菌病直接鏡檢（墨汁染色）直接鏡檢（墨汁染色）15有意義的涂片結(jié)果有意義的涂片結(jié)果n機體內(nèi)部標(biāo)本如血液、腹水、機體內(nèi)部標(biāo)本如血液、腹水、CSF、膿腫穿刺液等、膿腫穿刺液等n新鮮尿液見到大量菌絲及孢子新鮮尿液見

6、到大量菌絲及孢子n口腔、陰道、支氣管灌洗液見到口腔、陰道、支氣管灌洗液見到酵母樣菌應(yīng)作培養(yǎng)確定酵母樣菌應(yīng)作培養(yǎng)確定16多細(xì)胞真菌多細(xì)胞真菌形 態(tài)sporehypha17真菌培養(yǎng)真菌培養(yǎng)18真菌培養(yǎng)檢查n目的提高病原體檢出的陽性率，確定致病菌的種類。n意義 發(fā)現(xiàn)肯定的致病原如新生隱球菌時，診斷即可確立。 分離出條件致病菌如白念珠菌或煙曲霉，應(yīng)結(jié)合臨床情況進行判斷。 無菌部位如血液或腦脊液中分離出條件致病菌常提示肯定的感染，但對來自于膿、痰或尿的標(biāo)本則應(yīng)謹(jǐn)慎解釋結(jié)果。但任何一株培養(yǎng)物都不應(yīng)輕易視為污染菌。 n需結(jié)合直接鏡檢的結(jié)果，強調(diào)直接鏡檢與培養(yǎng)檢查相結(jié)合的重要性。n強調(diào)臨床醫(yī)師與實驗室檢驗人員

7、之間的相互聯(lián)系。1909220區(qū)分酵母樣或霉樣菌落區(qū)分酵母樣或霉樣菌落21Aspergillus fumigatus - Colonial Morphology, Sabouraud葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基煙曲霉菌葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基煙曲霉菌22Aspergillus fumigatus - Microscopic Morphology, 100 x Lactophenol cotton blue (單列單列) 分生孢子頭、分生孢分生孢子頭、分生孢子梗、頂囊、瓶梗、分生孢子子梗、頂囊、瓶梗、分生孢子23Aspergillus flavus - 在Sabouraud葡萄糖瓊脂黃曲霉菌葡萄糖瓊脂黃曲霉菌生長快

8、黃色表面粉末狀生長快黃色表面粉末狀24Aspergillus flavus - Microscopic Morphology, 100 x Lactophenol cotton blue 黃曲霉菌黃曲霉菌( 二列為主)分生孢子頭、分生孢子梗、頂囊、瓶梗、?；?、分生孢子25Penicillium species - Colonial Morphology, Sabouraud agar 青霉屬青霉屬 氣生菌絲密毯狀氣生菌絲密毯狀26Penicillium species - Microscopic Morphology, 400 x Lactophenol cotton blue青霉屬青霉屬(帚

9、狀枝帚狀枝,分生分生孢子孢子)27Aspergillus niger - Colonial Morphology, Sabouraud agar黑黑曲霉菌曲霉菌(背面)28Aspergillus niger - Microscopic Morphology, 100 x Lactophenol cotton blue( 二列為主二列為主)分生孢分生孢子頭、分生孢子梗、頂囊、瓶梗、?；?、分生孢子子頭、分生孢子梗、頂囊、瓶梗、?；⒎稚咦?9真菌體外藥敏試驗真菌體外藥敏試驗30真菌體外藥敏試驗真菌體外藥敏試驗n1 K-B 法法n2 MIC 法法n3 E-test 法法31n液基稀釋法液基稀釋法C

10、LSI M27A2：致病性酵母菌：致病性酵母菌 CLSI M38A：產(chǎn)孢絲狀真菌：產(chǎn)孢絲狀真菌n瓊脂稀釋法瓊脂稀釋法n紙片擴散法紙片擴散法CLSI M44-AnEtest法法抗真菌藥物體外敏感試驗抗真菌藥物體外敏感試驗32333409635白色念珠菌近平滑念珠菌熱帶念珠菌光滑念珠菌36白色念珠菌近平滑念珠菌熱帶念珠菌光滑念珠菌37白色念珠菌近平滑念珠菌熱帶念珠菌光滑念珠菌38白色念珠菌近平滑念珠菌熱帶念珠菌光滑念珠菌39白色念珠菌近平滑念珠菌熱帶念珠菌光滑念珠菌40白色念珠菌近平滑念珠菌熱帶念珠菌光滑念珠菌4142真菌特異性抗原的免疫學(xué)檢測真菌特異性抗原的免疫學(xué)檢測 1 (1-3)-D-(1-

11、3)-D-葡聚糖葡聚糖 2 2 半乳甘露聚糖半乳甘露聚糖 3 3 甘露聚糖甘露聚糖 4 D- 4 D- 阿拉伯糖醇阿拉伯糖醇 5 5 烯醇化酶烯醇化酶 6 6 新生隱球菌莢膜抗原新生隱球菌莢膜抗原43n(1-3)-D-Glucan(1-3)-D-Glucan(葡聚糖葡聚糖) ) “G” “G”試驗試驗44(1-3)-(1-3)- -D-Glucan-D-Glucan生物活性生物活性n(1-3)-(1-3)- -D-Glucan-D-Glucan作作為真菌細(xì)胞壁成分之為真菌細(xì)胞壁成分之一，一旦進入機體后，一，一旦進入機體后，將引起真菌病，嚴(yán)重將引起真菌病，嚴(yán)重時將會引起嚴(yán)重的深時將會引起嚴(yán)重的深

12、部真菌感染疾病，部真菌感染疾病，因因此此, ,深部真菌感染對深部真菌感染對患者的健康與生命構(gòu)患者的健康與生命構(gòu)成嚴(yán)重威脅成嚴(yán)重威脅. . n傳統(tǒng)檢測方法為真菌傳統(tǒng)檢測方法為真菌培養(yǎng)，一是周期長，培養(yǎng)，一是周期長，二是陽性率特別低二是陽性率特別低n主要是抗生素類藥物主要是抗生素類藥物的濫用所引起的濫用所引起n真菌感染出現(xiàn)逐漸上真菌感染出現(xiàn)逐漸上升趨勢升趨勢45n“G”試驗緣何而來？試驗緣何而來？46比濁法反應(yīng)機理比濁法反應(yīng)機理細(xì)菌內(nèi)毒素細(xì)菌內(nèi)毒素 （1-3） -D-GlucanLAL-RM(反應(yīng)物反應(yīng)物)因子因子C活化因子活化因子C 因子因子B活化因子活化因子B 活化因子活化因子G 因子因子G

13、凝固酶原凝固酶原 凝固酶凝固酶 凝固蛋白原凝固蛋白原凝固蛋白（凝膠）凝固蛋白（凝膠）定量濁度儀定量濁度儀Turbidimetric technique GEL47G 試驗n1-3-D-Glucan 葡聚糖存在于念珠菌、葡聚糖存在于念珠菌、曲霉等的細(xì)胞壁中，能特異性激活曲霉等的細(xì)胞壁中，能特異性激活G因子，因子，從而激活鱟試驗，此過程稱為從而激活鱟試驗，此過程稱為G試驗。試驗。n口咽部念珠菌病口咽部念珠菌病G試驗結(jié)果陰性試驗結(jié)果陰性n隱球菌隱球菌,毛霉菌感染毛霉菌感染G試驗假陰性試驗假陰性48(13)-D-葡聚糖檢測n是酵母菌及絲狀真菌細(xì)胞壁上的一種成分是酵母菌及絲狀真菌細(xì)胞壁上的一種成分n內(nèi)毒

14、素檢測方法內(nèi)毒素檢測方法n應(yīng)用范圍：曲霉菌、念珠菌、鐮刀霉、毛孢子應(yīng)用范圍：曲霉菌、念珠菌、鐮刀霉、毛孢子菌、酵母菌、足分支菌菌、酵母菌、足分支菌n隱球菌、毛霉菌除外隱球菌、毛霉菌除外n已在美國已在美國FDA以及一些歐洲國家得到批準(zhǔn)以及一些歐洲國家得到批準(zhǔn) 49(13)-D-葡聚糖檢測n美國主要針對念珠菌血癥進行了研究美國主要針對念珠菌血癥進行了研究n需要更多有關(guān)其它感染的研究信息（侵襲性曲霉菌需要更多有關(guān)其它感染的研究信息（侵襲性曲霉菌?。┎。﹏沒有真菌感染的患者血液中也會出現(xiàn)沒有真菌感染的患者血液中也會出現(xiàn)-D-葡聚糖：葡聚糖： - 血液透析血液透析 - 使用血制品（白蛋白、丙球）使用血制

15、品（白蛋白、丙球） - 使用含有葡聚糖的紗布使用含有葡聚糖的紗布n臨床上陽性結(jié)果出現(xiàn)較晚臨床上陽性結(jié)果出現(xiàn)較晚n使用某種抗生素是否會導(dǎo)致假陽性？使用某種抗生素是否會導(dǎo)致假陽性？ 50G試驗商品化試劑盒試驗商品化試劑盒detects in one hour 1 天津濱海新區(qū)金山川公司生產(chǎn)產(chǎn)品天津濱海新區(qū)金山川公司生產(chǎn)產(chǎn)品 2 Fungitec-G glucan (Seikagaku) Obayashi 1992 cutoff ： 20pg/ml 3 FungitellTM Assay (Associates of CAPE COD) cutoff ：80 pg/ml511 1 輸注白蛋白或球蛋白

16、輸注白蛋白或球蛋白2 2 血液透析血液透析( (纖維素濾膜）纖維素濾膜）3 3 輸注抗腫瘤多糖類藥物輸注抗腫瘤多糖類藥物4 4 使用磺胺類藥物使用磺胺類藥物5 5 外科手術(shù)后早期外科手術(shù)后早期6 6 標(biāo)本接觸紗布標(biāo)本接觸紗布G G試驗假陽性問題試驗假陽性問題52n酵母菌、絲狀真菌細(xì)胞壁成分酵母菌、絲狀真菌細(xì)胞壁成分n不僅檢測曲霉菌，還可以檢測念珠菌、不僅檢測曲霉菌，還可以檢測念珠菌、鐮刀菌、毛孢子菌、支頂孢屬鐮刀菌、毛孢子菌、支頂孢屬n不能檢測：隱球菌和接合菌不能檢測：隱球菌和接合菌n美國美國FDA已批準(zhǔn)，歐洲部分國家已注冊已批準(zhǔn)，歐洲部分國家已注冊n敏感性、特異性：敏感性、特異性：90左右左

17、右 D葡聚糖的價值葡聚糖的價值53n D葡聚糖（葡聚糖（G試驗）的缺陷試驗）的缺陷標(biāo)本采集標(biāo)本采集不能鑒定何種真菌感染不能鑒定何種真菌感染54 D葡聚糖參考值葡聚糖參考值n健康人：健康人： 20 pg/ml55The cutoff of G test Cutoff(pg/ml)Sensitivity(%)Specificity(%)6069.987.18064.492.4Clinical Infectious Diseases 2005;41: 654-9The cutoff of G test56曲霉菌半乳甘露聚糖（曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）57曲霉菌半乳甘露聚糖（曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）

18、Figure 1-10 Noncompetitive sandwich method of immunoassay58曲霉菌半乳甘露聚糖曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）n曲霉菌細(xì)胞壁上一種多聚糖抗原曲霉菌細(xì)胞壁上一種多聚糖抗原n可以從血清、腦脊、胸水、可以從血清、腦脊、胸水、BALFBALF檢測到檢測到n方法：方法：nELISAELISA（BioRadBioRad）：敏感性高）：敏感性高 1ng/ml1ng/mlnLatex agglutinationLatex agglutination： 15ng/ml15ng/ml59影響GM檢測的因素n宿主宿主曲霉菌疾病譜曲霉菌疾病譜高?；颊叩闹委煾呶；颊叩?/p>

19、治療GMGM的其它來源的其它來源GMGM的循環(huán)動力學(xué)的循環(huán)動力學(xué)抗抗GMGM抗體抗體n真菌真菌曲霉菌種類？曲霉菌種類？營養(yǎng)情況營養(yǎng)情況GMGM釋放的動力學(xué)？釋放的動力學(xué)？n策略策略采樣頻率采樣頻率標(biāo)本種類標(biāo)本種類陽性定義陽性定義試驗設(shè)計試驗設(shè)計n方法方法Cut-off方法方法/實驗室內(nèi)差異實驗室內(nèi)差異手工手工 vs 自動化自動化60GM試驗假陽性問題n以乳或乳制品為主食的嬰幼兒n異體骨髓移植患者n菌血癥患者n自身抗體陽性患者n使用半合成青霉素61GM與內(nèi)酰胺類抗生素nGMGM與哌拉西林與哌拉西林/ /他唑巴坦、阿莫西林他唑巴坦、阿莫西林/ /克克拉維酸、氨芐西林、青霉素拉維酸、氨芐西林、青霉素

20、V V有交叉反應(yīng)有交叉反應(yīng)n錯誤地提高了診斷的確定性錯誤地提高了診斷的確定性 62n合適的判定折點：合適的判定折點：1.0, 0.7,0.5?1.0, 0.7,0.5?n在兒童的應(yīng)用價值？在兒童的應(yīng)用價值？n食物中的食物中的GMGM可以被吸收，假陽性？可以被吸收，假陽性？n哌拉西林哌拉西林/ /他唑巴坦治療，假陽性？他唑巴坦治療，假陽性？n非血液病患者應(yīng)用不多非血液病患者應(yīng)用不多n抗真菌治療對結(jié)果的影響？抗真菌治療對結(jié)果的影響？半乳甘露聚糖半乳甘露聚糖(GM)檢測存在的問檢測存在的問題題63n兩種試驗敏感性、特異性相當(dāng)兩種試驗敏感性、特異性相當(dāng)n都可以在早期診斷侵襲性曲霉病，但是都可以在早期診

21、斷侵襲性曲霉病，但是 D葡聚糖可能出現(xiàn)更早葡聚糖可能出現(xiàn)更早n兩者結(jié)合，可以互補兩者結(jié)合，可以互補n彌補彌補GM假陰性可能假陰性可能n同樣在粒細(xì)胞缺乏患者用的多，其他患者有待同樣在粒細(xì)胞缺乏患者用的多，其他患者有待研究研究半乳甘露聚糖半乳甘露聚糖(GM)與與 D葡聚糖的葡聚糖的比較比較64n血清抗體檢測血清抗體檢測 由于患者存在免疫受損，抗原遞呈功能和由于患者存在免疫受損，抗原遞呈功能和及淋巴細(xì)胞功能受損，不能產(chǎn)生足夠的抗及淋巴細(xì)胞功能受損，不能產(chǎn)生足夠的抗體。體。 診斷價值較低。診斷價值較低。65系統(tǒng)性真菌感染診斷的進展系統(tǒng)性真菌感染診斷的進展66檢測真菌的特異性酶檢測真菌的特異性酶n白念白

22、念N-乙酰乙酰 -D半乳糖苷酶半乳糖苷酶n白念白念脯氨酸按肽酶脯氨酸按肽酶n都柏林念珠菌都柏林念珠菌 N-乙酰乙酰 -D半乳糖苷酶半乳糖苷酶n克柔克柔 酸性磷酸酶酸性磷酸酶n熱帶熱帶 吡烙磷酸酶吡烙磷酸酶n平滑平滑 -D半乳糖苷酶半乳糖苷酶n新生隱球菌新生隱球菌 酚氧酶酚氧酶67P C R 通過擴增曲霉菌特異基因片斷，達到快通過擴增曲霉菌特異基因片斷，達到快速診斷的目的，但容易污染。速診斷的目的，但容易污染。68PCR診斷侵襲性真菌病n一種可能的全真菌檢測方法一種可能的全真菌檢測方法n可能用來進行血清學(xué)篩查（早期診斷）可能用來進行血清學(xué)篩查（早期診斷）n方法和標(biāo)本不同，敏感性及特異性不同方法和標(biāo)本不同，敏感性及特異性不同底線：底線：有診斷潛能，但還不是最佳的方法有診斷潛能，但還不是最佳的方法 Alexander B, Transpl Infect Dis, 2002,(supply 3):3269 n發(fā)熱期間至少有一瓶血培養(yǎng)真菌陽性發(fā)熱期間至少有一瓶血培養(yǎng)真菌陽性n持續(xù)穩(wěn)定的血念珠菌抗原陽性持續(xù)穩(wěn)定的血念珠菌抗原陽性 或高的抗念珠菌抗體滴度或高的抗念珠菌抗體滴度(ELISA)(ELISA)真菌菌血癥實驗室診斷指標(biāo)：真菌菌