
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
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文檔簡介
1、崇州醫(yī)院細胞治療中心 標準操作程序CIK細胞制備標準操作程序1 目的和范圍:1.1 目的:規(guī)范CIK細胞培養(yǎng)過程,保證操作準確,避免人為操作誤差導致實驗效果不良或失敗。1.2 范圍:該規(guī)程適用于實驗室細胞培養(yǎng)技術(shù)人員CIK細胞培養(yǎng)操作的全過程。2 原理:2.1 外周血單核細胞經(jīng)細胞刺激因子誘導后分分化為CIK細胞。3 相關(guān)文件:3.1 4 物料:4.1 試劑:75%酒精,碘伏,生理鹽水,淋巴細胞分離液(Ficoll),GT-T551培養(yǎng)基,CIK條件培養(yǎng)基1、CIK條件培養(yǎng)基2 。4.2 儀器設(shè)備:生物安全柜,離心機,水浴鍋,二氧化碳細胞培養(yǎng)箱,電動移液槍,10ul移液槍,200ul移液槍,醫(yī)
2、用剪刀,醫(yī)用止血鉗,試管架。4.3 耗材: T175透氣培養(yǎng)瓶(175cm2Flask),T75透氣培養(yǎng)瓶(75cm2Flask),CO2透氣培養(yǎng)袋,15ml離心管,50ml離心管,5ml移液管,10ml移液管,50ml一次性注射器,5ml一次性注射器,200ul槍頭。5 記錄5.1 DC-CIK細胞制備記錄。6 職責:6.1 細胞培養(yǎng)技術(shù)人員應(yīng)嚴格按照本規(guī)程的規(guī)定進行CIK細胞培養(yǎng)操作。6.2 QA負責監(jiān)督細胞培養(yǎng)技術(shù)人員的操作全過程,確保CIK細胞培養(yǎng)操作的規(guī)范性。6.3 審核人負責保證本規(guī)程的審核和全過程準確有效。7 工作程序:7.1 實驗前準備:7.1.1 潔凈區(qū)及工作臺紫外照射30m
3、in,風機開啟30分鐘。7.1.2 物料準備:將已滅菌且在有效期內(nèi)器械放于物料傳遞窗進行紫外照射,30min后,去包布,經(jīng)酒精擦拭后放入生物安全柜中備用。7.1.3 單核細胞分離液(Ficoll)提前30min從4冰箱取出待用。7.1.4 單核細胞分離液(Ficoll),GT-T551培養(yǎng)基,血清,在實驗前需提前準備好放入生物安全柜中,以便其恢復常溫,否則將會影響實驗效果。12345677.17.1.1677.17.1.17.1.27.2 分離7.2.1 制備血漿:7.2.1.1 將樣本從醫(yī)療器械盒中小心地取出,用酒精擦拭消毒后放入生物安全柜。7.2.1.2 打開器械盒(注意手不得從打開的器械
4、盒上方通過),用生物安全柜中的止血鉗從器械盒中取出滅菌指示卡,確認已滅菌。取出器械盒中止血鉗,用其夾緊血袋軟管下方。7.2.1.3 用浸泡過碘伏和酒精的棉簽對軟管中上部交替消毒兩次,(先碘伏,后酒精,如此交替兩次)用生物安全柜中的止血鉗取出器械盒中的醫(yī)用剪刀,用碘伏和酒精對其交替消毒兩次,用醫(yī)用剪刀將軟管剪斷。將全血轉(zhuǎn)移至50ml離心管,每管25ml。7.2.1.4 室溫1800rpm,離心10分鐘(離心機升降速以ST16為例:升9降4)。7.2.1.5 取上層血漿至50ml離心管,滅活(56水浴30min)。7.2.1.6 4放置30分鐘。7.2.1.7 2800rpm離心8min,,上清分
5、于3支15ml離心管中,-20保存。7.2.2 提取PBMC:7.2.2.1 將生理鹽水經(jīng)酒精擦拭消毒后放入生物安全柜中,用碘伏和酒精對生理鹽水瓶瓶口進行2次交替消毒后,用止血鉗將瓶塞扒開并放置于工作臺右上方位置。7.2.2.2 按生理鹽水:血細胞=1.5:1對血細胞進行稀釋,混勻。7.2.2.3 按照1.5:1的比例,加生理鹽水至吸棄血漿后的樣本,混勻,緩慢加在Ficoll 液面上(方法:將離心管傾斜45°,在Ficoll液面上1cm處,緩慢注入稀釋的血細胞,不要打亂液面界面),加入后終體積不超過45ml, 2000 rpm,20min,室溫(注意:調(diào)整離心機加速和減速過程為最低,
6、調(diào)電動移液槍輸出速度至最低)。7.2.2.4 離心后,小心取出離心管,可清晰看到細胞分層。注意輕拿輕放,保持離心管豎直放置,以免破壞細胞分層。7.2.2.5 用巴氏滴管緩慢提取Ficoll層與血漿層交界處的白膜層細胞,按照二個離心管對應(yīng)一個離心管進行漂洗的原則,將提取的白膜層細胞裝入50ml離心管中。補充生理鹽水至45ml,混勻,1600rpm, 5分鐘。7.2.2.6 棄上清,用生理鹽水重懸,收集于一個50ml離心管中,補充生理鹽水至45ml。1200 rpm,10min。7.2.2.7 棄上清,再次添加生理鹽水重懸至45mL,混勻,取0.5ml中層懸液至1.5mlEP管中計數(shù),1000rp
7、m,10min。7.2.2.8 取上清至15ml離心管中,標記,送檢微生物并留樣,上清量應(yīng)滿足檢測及留樣要求,其余上清廢棄。7.2.3 接種:7.2.3.1 用培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為12´106/ml。7.2.3.2 D0天完全培養(yǎng)基配制:每20ml培養(yǎng)基(10%自體血清)添加1支CIK條件培養(yǎng)基(規(guī)格:500ul/支)。7.2.3.3 混勻,根據(jù)培養(yǎng)液體積添加到25cm2Flask或者75cm2Flask中。7.2.3.4 水平放入37,5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7.2.3.5 填寫相關(guān)記錄,清場。7.3 加液7.3.1 時間及方式:當培養(yǎng)基顏色變黃或細胞濃度接近飽和時,以倍增方式
8、補液。7.3.1.1 一般加液時間為:D2,D4,D6,D8,D10,D12(加液時間視細胞具體生長情況可提前或延后)。7.3.1.2 D2-D14天,完全培養(yǎng)基的配制:每瓶培養(yǎng)基(1000ml)添加1支CIK條件培養(yǎng)基2(規(guī)格:1ml/支)7.3.2 添加方法:輕輕搖勻,避免起氣泡;擰好瓶蓋,水平放入37、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。7.4 轉(zhuǎn)瓶:當75cm²Flask細胞懸液總體積達到60ml,且需要繼續(xù)補液時。7.4.1 將75cm²Flask中細胞懸液全部倒入新的1752Flask培養(yǎng)瓶中。7.4.2 向75cm²Flask中添加適量培養(yǎng)基對瓶內(nèi)細胞進行涮洗
9、并倒入1752Flask培養(yǎng)瓶中,再添加適量新鮮培養(yǎng)基(加5%自體血清)。7.4.3 擰緊175cm²Flask瓶蓋,水平放入37,5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7.5 轉(zhuǎn)袋或分瓶:當175cm²Flask中細胞懸液總體積達到250ml,且需要繼續(xù)補液時。轉(zhuǎn)袋:7.5.1 取50ml注射器,棄去針頭及助推器。放入注射器支架的圓孔內(nèi)。7.5.2 用碘伏和酒精對培養(yǎng)袋導管蓋子下1-2處交替消毒兩次。7.5.3 用止血鉗取下前端蓋子,連接管口與注射器。7.5.4 將175 cm²Flask中的細胞懸液緩慢倒入注射器內(nèi)。7.5.5 用適量培養(yǎng)基涮洗175 cm²F
10、lask,按7.3.1.3和7.3.2.2的方法繼續(xù)向細胞培養(yǎng)袋中添加培養(yǎng)基,至加液總體積達到應(yīng)添加量。7.5.6 培養(yǎng)基添加完畢,用止血鉗夾緊導管前端,將細管與注射器分離并將細管抬高,確保培養(yǎng)基全部進入細胞袋中。用止血鉗將細管蓋子蓋上并擰緊,用塑料夾將導管末端夾緊。7.5.7 將培養(yǎng)袋平放,用雙手輕輕按摩袋子十余下,使細胞與培養(yǎng)基混勻。用碘伏和酒精對培養(yǎng)袋取樣口進行交替消毒,用一次性注射器取樣0.5ml,標記,送檢微生物檢測。7.5.8 培養(yǎng)袋標記后雙手托住培養(yǎng)袋下方自生物安全柜中取出,用托盤將其送至培養(yǎng)室,水平放入37,5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7.5.9 分瓶:按培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基體積等分
11、,按倍增的方式分瓶培養(yǎng),加液按步驟7.3.1.3和7.3.2.2要求添加新鮮培養(yǎng)基。分瓶完畢,擰好蓋子,每個培養(yǎng)瓶均做好標記后放入37,5%的二氧化碳培養(yǎng)箱。(此步驟僅適用于分瓶培養(yǎng))7.5.10 填寫相關(guān)記錄。7.5.11 培養(yǎng)袋轉(zhuǎn)移方法:放置在托盤上。7.6 分袋:計劃需求且培養(yǎng)袋中細胞懸液總體積達到1000ml時。7.6.1 混勻后對應(yīng)將樣本掛于生物安全柜中的掛鉤上。7.6.2 取50ml注射器,棄去針頭及助推器。放入注射器支架的圓孔內(nèi)。7.6.3 取新的細胞培養(yǎng)袋,用碘伏和酒精對其蓋子下1-2處交替消毒兩次。用止血鉗取下蓋子,連接管口與注射器。7.6.4 用止血鉗夾緊原培養(yǎng)袋導管,碘伏
12、和酒精對其蓋子以下1-2處交替消毒兩次,取下蓋子。(注意開蓋時,細管的前端應(yīng)高于培養(yǎng)袋中細胞培養(yǎng)液的液面,并且培養(yǎng)袋塑料夾處取夾緊狀態(tài),防止在擰開蓋子時,液體突然涌出)7.6.5 再次混勻后,松開止血鉗,通過注射器將原培養(yǎng)袋中的細胞懸液加入到新的培養(yǎng)袋。加液時(按7.3.1.3和7.3.2.2步驟),當液面增至注射器套筒50ml刻度線后,停止加液并松開新增培養(yǎng)袋導管止血鉗,使液面降至0刻度線,再次用止血鉗夾緊新增培養(yǎng)袋細管并加液,按上述方法每50ml一次,重復數(shù)次進行加液,至原培養(yǎng)袋中一半培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入新增培養(yǎng)袋。用止血鉗夾緊細管前端,將其置于生物安全柜左上角。7.6.6 填寫相關(guān)記錄,清場。7.
13、7 細胞收獲:7.7.1 檢查培養(yǎng)袋標記是否與回輸計劃相符。7.7.2 取出,酒精擦拭消毒后,放入生物安全柜,掛于生物安全柜內(nèi)的掛鉤上。7.7.3 取若干50ml離心管,標記,擰開離心管蓋,整齊的置于工作臺上方,調(diào)整離心管刻度朝向操作者。7.7.4 混勻培養(yǎng)袋中細胞懸液。用止血鉗夾緊培養(yǎng)袋導管,碘伏與酒精對導管蓋子下方1-2cm處進行交替消毒,擰開培養(yǎng)袋的蓋子并放于工作臺左前方。7.7.5 一手握止血鉗,一手拿導管,慢慢松開止血鉗,由慢到快將細胞懸液引入離心管中。7.7.6 操作中導管口應(yīng)處于離心管口正上方,待離心管裝滿細胞懸液后,夾緊導管,轉(zhuǎn)移至另一離心管中繼續(xù)添加細胞懸液,直至達到收集體積
14、。7.7.7 將導管口抬起,使部分培養(yǎng)基回流,若還需添加新鮮培養(yǎng)基,則用止血鉗將導管前端夾緊,放置于工作臺左上方,待離心管移出生物安全柜后,可立即進行加液處理。若不進行加液則擰上導管蓋子,并用塑料夾將導管末端夾緊,移出安全柜,放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。7.7.8 細胞清洗:7.7.8.1 配平,1300rpm,8分鐘。7.7.8.2 用碘伏和酒精對生理鹽水瓶口進行交替消毒2次,用止血鉗拔開橡膠塞,將生理鹽水置于工作臺右上方備用。7.7.8.3 待離心完畢,棄上清,收集細胞于兩個離心管中,1300rpm離心8分鐘。7.7.8.4 廢上清,收集細胞于一個離心管管中,添加生理鹽水至45ml,混勻,取0.5
15、ml中間層懸液計數(shù)及活率檢測。7.7.8.5 1300rpm,8分鐘,取上清至15ml離心管中作革蘭氏、內(nèi)毒素檢測并留樣,多余的廢棄。7.7.8.6 用生理鹽水重懸細胞,如無自體血清用5ml 人血白蛋白和15ml生理鹽水重懸細胞,混勻。7.7.9 裝袋或裝瓶,100ml/瓶或袋:7.7.9.1 取出轉(zhuǎn)移袋,消毒后移入安全柜,用止血鉗夾住轉(zhuǎn)移袋導管,用碘伏和酒精對止血鉗上方導管進行交替消毒兩次。7.7.9.2 用止血鉗將已高壓滅菌的剪刀從器械盒中取出,經(jīng)碘伏和酒精交替消毒后,將轉(zhuǎn)移袋細管從已消毒部分傾斜剪斷。7.7.9.3 取50ml注射器,拔掉推塞后與轉(zhuǎn)移袋細管通過針頭連接口連接。7.7.9.4 將細胞懸液通過注射器套筒導入轉(zhuǎn)移袋,再用適量生理鹽水對離心管進行涮洗并導入轉(zhuǎn)移袋保證終體積為100ml/袋,反復混勻(留樣1ml細胞稀釋液,標注個人信息,無菌密封好-20冰箱永久保存。7.7.9.5 將轉(zhuǎn)移袋中空氣全部排出后,用止血鉗夾緊導管并移出生物安全柜。7.7.9.6 熱合,剪掉多余部分,在回輸袋上粘貼相應(yīng)的回輸信息標簽(核對姓名,ID號,性別等),用外包裝袋密封后,傳出潔凈區(qū)。7.7.9.7 填寫相關(guān)記錄。7.8 微生物檢測控制點與回輸質(zhì)量控制:7.8.1 細胞接種前取單核細胞最后一次清洗上清2m
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