細(xì)胞工程學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、實(shí)驗(yàn)一 細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)置、設(shè)備和基本要求。2、掌握細(xì)胞培養(yǎng)用器械的清洗、消毒方法及無(wú)菌操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)材料1、實(shí)驗(yàn)設(shè)備：高壓滅菌鍋、電子分析天平、pH計(jì)、超凈工作臺(tái)、濾器、濾泵。2、實(shí)驗(yàn)器材：不同規(guī)格毛刷、燒杯、量筒、攪拌棒、瓷缸（陶瓷或玻璃）。三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）器械的清洗1、玻璃器皿的清洗（植物細(xì)胞培養(yǎng)只需、操作即可）：清水浸泡：浸泡主要是軟化器皿表面所附著的物質(zhì)。刷洗：將浸泡后的玻璃器皿在洗滌劑中用毛刷反復(fù)刷洗，以除去器皿表面的雜質(zhì)。烘干備用。浸酸：將經(jīng)過(guò)刷洗和烘干后的玻璃器皿浸泡在由重鉻酸鉀、濃硫酸配置而成的清潔液中，利用強(qiáng)氧化作用清除瓶皿表面可能

2、殘留的有機(jī)物。浸泡時(shí)間要在6小時(shí)以上，最好過(guò)夜（用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)）。沖洗：浸酸后的器皿從洗液中取出后，用自來(lái)水沖洗10遍以上。再用蒸餾水、三蒸水各清洗3遍以上，取出置于烤箱內(nèi)（4050）烘干（用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)）。2、金屬器械的清洗和消毒：金屬器械不能在清潔液中浸泡，一般用洗滌劑洗刷干凈后，再用自來(lái)水和蒸餾水反復(fù)沖洗干凈，烘干。3、膠塞的清洗和消毒：細(xì)胞培養(yǎng)中使用的膠塞不能用清潔液浸泡。清洗過(guò)程中，要先在水中浸泡，然后2%NaOH溶液煮沸10分鐘。自來(lái)水沖洗晾干后，再用1%的稀鹽酸浸泡30分鐘，最后再用自來(lái)水、蒸餾水、三蒸水進(jìn)行常規(guī)清洗，烘干備用。注意使用后的膠塞應(yīng)及時(shí)浸泡在清水中。4、塑料物品

3、的清洗：塑料物品用后立即用流水沖凈或浸入清水中，防止干涸。一般不用刷洗以防劃痕和損傷。清洗干凈的器皿先在2%NaOH溶液浸泡過(guò)夜，自來(lái)水沖洗晾干后，再用1%的稀鹽酸浸泡30分鐘。最后再用自來(lái)水、蒸餾水、三蒸水進(jìn)行常規(guī)清洗，烘干備用。注：清潔液的配制（盛裝于瓷缸中，用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)玻璃器皿的清潔）成分強(qiáng)酸溶液次強(qiáng)酸溶液弱酸溶液重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml）6310002001202002001001001000（二）器械的消毒滅菌造成細(xì)胞培養(yǎng)失敗的主要原因是發(fā)生污染，特別是微生物的污染，因此對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)中所用的器械進(jìn)行消毒滅菌是非常重要的。最常用的物理消毒方法有如下幾種：1、紫外線消

4、毒：紫外線是一種低能量的電磁輻射，可以殺滅多種微生物。目前，多用紫外燈直接照射培養(yǎng)室內(nèi)空氣、地面、工作臺(tái)表面等進(jìn)行消毒。2、高溫干熱滅菌：一般在烤箱中進(jìn)行，主要用于消毒玻璃器皿。干熱滅菌后的器皿干燥，易于存放。但是，干熱傳導(dǎo)慢，可有冷空氣存留于烤箱內(nèi)，需要較高的溫度和較長(zhǎng)的時(shí)間才能達(dá)到消毒的目的，因此需加溫到160，保持90-120分鐘。消毒后不可馬上將烘箱門(mén)打開(kāi)，以免冷空氣進(jìn)入，影響消毒效果和損壞玻璃器皿或發(fā)生意外。3、壓力蒸汽滅菌：一般使用高壓蒸汽滅菌鍋進(jìn)行。為保證消毒的效果，待消毒的物品不應(yīng)裝得太滿(mǎn)，以便消毒器內(nèi)空氣流通。在加熱升壓之前，打開(kāi)排氣閥門(mén)，以使加熱后消毒器內(nèi)的冷空氣排出。冷空

5、氣排完后，關(guān)閉排氣閥門(mén)，開(kāi)始升壓，待達(dá)到所需壓力后，開(kāi)始計(jì)時(shí)，一般為100KPa、121下滅菌1520分鐘。消毒完畢后，不要立刻打開(kāi)蓋子，應(yīng)先等壓力自行下降到一定程度后，打開(kāi)排氣閥，放氣后，再打開(kāi)消毒器的蓋，將物品取出，放入烤箱內(nèi)烘干。4、過(guò)濾除菌：是將液體或氣體用具有微孔的薄膜過(guò)濾，使大于孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌的目的。目前，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用微孔濾膜濾器除菌，濾膜孔徑為0.220.45m。（三）培養(yǎng)材料的消毒滅菌采自自然界的實(shí)驗(yàn)材料，攜帶微生物及雜質(zhì)，接種前須進(jìn)行表面消毒滅菌，對(duì)內(nèi)部已受微生物侵染的材料應(yīng)予以淘汰。采來(lái)的實(shí)驗(yàn)材料先用流水沖洗1020min或更長(zhǎng)時(shí)間，然后在一定濃

6、度藥劑中浸泡處理（須在超凈工作臺(tái)上操作），進(jìn)行表面消毒滅菌。所用的藥劑種類(lèi)、濃度、處理時(shí)間隨植物種類(lèi)和取用的器官部位的不同而異，常用消毒劑的滅菌效果見(jiàn)表1-1。消毒劑對(duì)植物組織是有毒的，應(yīng)正確選擇其濃度和處理時(shí)間，減少它對(duì)組織的傷害。經(jīng)過(guò)滅菌的材料，需用無(wú)菌水清洗45次，瀝去水分待用。表1-1 常用消毒劑消毒滅菌效果比較表消毒劑使用濃度（%）去除的難易消毒時(shí)間（min）效果次氯酸鈣次氯酸鈉漂白粉溴水過(guò)氧化氫升汞酒精抗生素硝酸銀9102飽和濃度1210120.11707545（mg/L）1易易易易最易較難易中較難5305305302105152100.223060530很好很好很好很好好最好好較

7、好好（四）無(wú)菌操作室的消毒滅菌無(wú)菌材料進(jìn)行接種或傳代時(shí)，必須從各方面防止任何污染物進(jìn)入容器，所以接種區(qū)的消毒至關(guān)重要。由于接種區(qū)的污染源主要是空氣中的細(xì)菌和真菌孢子，因此長(zhǎng)期停用后的無(wú)菌操作室應(yīng)進(jìn)行熏蒸消毒滅菌（常用每立方米含2ml甲醛和1g高錳酸鉀的消毒液或6ml/m3乙二醇等加熱熏蒸）。每次接種前都應(yīng)進(jìn)行地面衛(wèi)生清潔，并用紫外燈照射20min，進(jìn)行空氣的消毒滅菌。對(duì)接種用的超凈工作臺(tái)，每次接種前用紫外燈照射20min，同時(shí)用7075%酒精擦洗，然后方可進(jìn)行培養(yǎng)材料的接種。（五）無(wú)菌操作培養(yǎng)材料接種時(shí)的無(wú)菌操作過(guò)程除上述各項(xiàng)消毒滅菌操作外，還需完成以下無(wú)菌操作步驟，從而獲得接種的無(wú)菌培養(yǎng)材料

8、。1、無(wú)菌操作前的準(zhǔn)備工作：工作人員無(wú)菌操作前需穿好工作服、戴上工作帽和口罩，坐在超凈工作臺(tái)前，將各種操作所用金屬器械浸泡在盛有95%（或70%）酒精溶液的廣口瓶中，點(diǎn)燃灑精燈，在耐熱器皿（如不銹鋼小盤(pán)或搪瓷盤(pán)）中加入少量酒精，將蘸有酒精的金屬器械及器械支架放入耐熱器皿中灼燒，待冷涼后將器械置器械支架上備用，所有操作器械每次使用后都要滅菌；用70%75%的酒精擦拭新培養(yǎng)容器和繼代培養(yǎng)容器表面，放置超凈工作臺(tái)上待用；再用同樣濃度的酒精擦拭雙手和前臂，完成無(wú)菌操作準(zhǔn)備工作。2、無(wú)菌操作步驟：準(zhǔn)備工作完成后，對(duì)來(lái)自于自然生長(zhǎng)條件下的外植體，按前述培養(yǎng)材料的消毒滅菌方法滅菌后取出，放入已消毒滅菌的培養(yǎng)

9、皿中，然后置于超凈工作臺(tái)酒精燈火焰下方，用滅菌剪刀等器械進(jìn)行適當(dāng)分離、切割或其它處理后備用。在酒精燈火焰處將培養(yǎng)容器的瓶塞（蓋）輕輕打開(kāi)，瓶口在火焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，將鑷子放在酒精瓶中蘸酒精，置于酒精燈火焰上灼燒后放回支架，然后迅速灼燎瓶塞（蓋）數(shù)妙后塞回瓶口。對(duì)繼代培養(yǎng)材料的無(wú)菌操作，需在燈焰處打開(kāi)瓶塞（蓋），繼代培養(yǎng)材料為液體培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)直接用滅菌吸管吸取培養(yǎng)細(xì)胞液放入新鮮培養(yǎng)基中；繼代材料為固體培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，用滅菌鑷子挑取適量材料置新鮮培養(yǎng)基上；繼代材料為其它組織時(shí)，用滅菌剪刀或其它器械對(duì)培養(yǎng)材料進(jìn)行適當(dāng)切割后，用滅菌鑷子將其置于新鮮培養(yǎng)基上（中），然后迅速灼燎瓶塞（

10、蓋）數(shù)妙后塞回瓶口。3、污染源及其表現(xiàn)特征當(dāng)培養(yǎng)材料、轉(zhuǎn)接器皿、無(wú)菌操作環(huán)境等消毒滅菌不徹底時(shí)，培養(yǎng)材料則攜帶有微生物，當(dāng)其被轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上時(shí)，微生物繁殖迅速，出現(xiàn)各種污染菌斑。微生物生長(zhǎng)時(shí)分泌出對(duì)植物組織有毒的代謝廢物，致使培養(yǎng)材料死亡或失去使用價(jià)值。在培養(yǎng)過(guò)程中，若培養(yǎng)材料附近出現(xiàn)黏液或混濁的水跡，并有發(fā)酵狀泡沫，則是細(xì)菌性污染。在細(xì)菌性污染中，特別要注意一種呈乳白色的芽孢桿菌，它們出現(xiàn)在培養(yǎng)基表面，或呈滴形云霧狀存在于培養(yǎng)基內(nèi)，若出現(xiàn)應(yīng)嚴(yán)格滅菌。而培養(yǎng)基表面出現(xiàn)的黃色、白色、黑色等不同顏色的霉菌，屬真菌性污染。此外，需提及與微生物污染無(wú)關(guān)的酚類(lèi)物質(zhì)污染，因它也是培養(yǎng)材料常遇到的

11、問(wèn)題，它是由于組織中的多酚氧化酶被激活，使細(xì)胞中的代謝發(fā)生變化，酚類(lèi)物質(zhì)被氧化后產(chǎn)生醌類(lèi)，這類(lèi)物質(zhì)呈棕褐色，使培養(yǎng)材料褐變，甚至接種后使培養(yǎng)基變褐，嚴(yán)重影響培養(yǎng)物的生長(zhǎng)發(fā)育?？梢岳靡恍┛寡趸瘎?，如抗壞血酸、半胱氨酸等進(jìn)行材料的預(yù)處理或預(yù)培養(yǎng)，或者在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑或吸收酚類(lèi)物質(zhì)的化合物，如聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、活性碳等來(lái)減輕醌類(lèi)物質(zhì)的毒害。實(shí)驗(yàn)二 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的配制一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握含血清細(xì)胞培養(yǎng)液的配制方法。2、掌握胰蛋白酶溶液的配制方法。二、實(shí)驗(yàn)材料1、實(shí)驗(yàn)設(shè)備：電子分析天平、pH計(jì)、超凈工作臺(tái)、濾器、濾泵。2、實(shí)驗(yàn)器材：燒杯、量筒、

12、攪拌棒、血清瓶（分裝培養(yǎng)液用）、0.22m濾膜。三、細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM的配制動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)使用的培養(yǎng)液一般由合成培養(yǎng)基和新生牛血清配制而成。合成培養(yǎng)基有商品出售，即商品培養(yǎng)基或稱(chēng)干粉培養(yǎng)基。根據(jù)不同的細(xì)胞種類(lèi)，可以選擇不同的合成培養(yǎng)基。其中最常見(jiàn)最常使用的商品培養(yǎng)基為DMEM和RPMI-1640干粉培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)僅以DMEM為例，介紹其配制方法。1、按包裝袋上的說(shuō)明，將一袋DMEM粉劑用新鮮三（次）蒸餾水溶解。2、按包裝袋上的說(shuō)明，將一定量的NaHCO3加入DMEM溶液中。3、加入抗生素，使青霉素鈉的終濃度達(dá)到100g/ml，（硫酸）鏈霉素的終濃度達(dá)到100U/ml。4、調(diào)培養(yǎng)液pH至7.07.

13、2（此時(shí)培養(yǎng)液為鮮紅色，也稱(chēng)櫻桃紅色）。5、超凈臺(tái)內(nèi)過(guò)濾除菌。6、加入經(jīng)滅活處理的新生牛血清，其中濃度為10%20%（根據(jù)實(shí)際情況，血清可在細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)加入）。7、分裝，-20貯存?zhèn)溆茫ú患訙缁钛宓呐囵B(yǎng)基可于4保存1個(gè)月）。四、胰蛋白酶溶液的配制1、D-Hanks溶液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取NaCl 8.0g、KCl 0.4g、Na2HPO412H2O 0.716g、KH2PO4 0.06g、NaHCO3 0.35 g，溶解于三（次）蒸餾水中，調(diào)pH至7.07.2，定容為1000ml。高壓滅菌后，于超凈臺(tái)內(nèi)加入過(guò)濾除菌的青霉素、（硫酸）鏈霉素，使其終濃度分別為100U/ml，100g/ml。4冰箱

14、保存待用。2、胰蛋白酶消化液的配制：用D-Hanks溶液將胰蛋白酶配成濃度為0.25%的工作液，過(guò)濾除菌后，-20貯存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)三 動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng)及凍存一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、  掌握細(xì)胞傳代培養(yǎng)的原理及操作方法。2、 掌握細(xì)胞凍存的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理 傳代培養(yǎng)是組織培養(yǎng)的常規(guī)保種方法之一。也是幾乎所有細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞不斷生長(zhǎng)增殖。對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，單層細(xì)胞互相匯合，整個(gè)瓶底逐漸被細(xì)胞覆蓋。對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞相互匯集成團(tuán)。這時(shí)需要進(jìn)行分離培養(yǎng)，否則細(xì)胞會(huì)因生存空間不足，營(yíng)養(yǎng)障礙而死亡。細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中的過(guò)程稱(chēng)為

15、傳代（或稱(chēng)繼代）。傳代可獲得大量細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)所需。 體外培養(yǎng)的細(xì)胞，隨著傳代次數(shù)的增加，其各種生物特性會(huì)漸漸發(fā)生變化。為此，需將培養(yǎng)的細(xì)胞及時(shí)凍存。直接凍存細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境形成冰晶，從而使細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生一系列變化，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡。因此，凍存細(xì)胞時(shí)常向培養(yǎng)液中加入適量的甘油或DMSO(二甲基亞砜)，從而使冰點(diǎn)下降，通過(guò)緩慢凍存，避免或減少冰晶的形成。三、實(shí)驗(yàn)材料1、實(shí)驗(yàn)設(shè)備：超凈工作臺(tái)、倒置相差顯微鏡、pH計(jì)、CO2培養(yǎng)箱、臺(tái)式離心機(jī)、恒溫?fù)u床等。2、實(shí)驗(yàn)器材：吸量管、培養(yǎng)皿、離心管、凍存管、細(xì)胞記數(shù)板、細(xì)胞計(jì)數(shù)器、微量移液器等。3、實(shí)驗(yàn)試劑：D-Hanks溶液、含10%新生牛血清的DMEM

16、培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶溶液、細(xì)胞凍存液。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）細(xì)胞傳代1、貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞（1）取80%匯合或剛匯合形成單層的細(xì)胞，吸棄舊培養(yǎng)液，用平衡鹽溶液洗去殘留的培養(yǎng)液。（2）加入少量的胰蛋白酶液，37放置3-5分鐘，倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞變圓后，用滅菌的吸量管進(jìn)行吹打，使細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶壁。（3）終止消化，吸棄消化液，加入含有血清的培養(yǎng)液。（4）用吸管吸取培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液溶液，反復(fù)吹打培養(yǎng)瓶底壁，使細(xì)胞分散。（5）吹打獲得的細(xì)胞懸液經(jīng)1,000 rpm離心5分鐘，棄上清，將細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)液重新懸浮后記數(shù)。（6）按照一定的細(xì)胞密度將部分細(xì)胞接種于新培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)給一定量的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培

17、養(yǎng)。2、懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞（1）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)，1,000rpm,離心5分鐘。（2）棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)液到離心管中，反復(fù)吹打，使細(xì)胞分散。（3）細(xì)胞記數(shù)。（4）按照一定的細(xì)胞密度將部分細(xì)胞接種于新培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)給一定量的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。（二）細(xì)胞凍存：1、配置凍存液：即含10%DMSO及20%小牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。2、依照傳代的方法把消化好的細(xì)胞收集于離心管中，計(jì)數(shù)后離心。3、去除離心后的上清，加入凍存液，使細(xì)胞密度達(dá)到5×106 - 1×107/ml。4、吹打細(xì)胞制成懸液，分裝入凍存管中。5、細(xì)胞分級(jí)冷凍要點(diǎn)緩慢逐步降溫：4冰箱1小時(shí)；-20冰箱1小時(shí)

18、；-80冰箱24-48h；液氮罐中長(zhǎng)期保存。實(shí)驗(yàn)四 化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷的敏感實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆漳[瘤細(xì)胞藥敏實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與操作及結(jié)果分析。二、實(shí)驗(yàn)原理腫瘤細(xì)胞針對(duì)不同的化療藥物的殺傷，有不同的敏感性。篩選出針對(duì)腫瘤高敏感而毒性小的化療藥物，對(duì)于指導(dǎo)腫瘤治療的臨床用藥有重要意義。其實(shí)驗(yàn)原理為：將一定細(xì)胞數(shù)的腫瘤細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，加入不同種類(lèi)、不同濃度的化療藥物，作用24-48小時(shí)后，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活情況，來(lái)判定腫瘤細(xì)胞對(duì)各種化療藥物的敏感性，從而篩選出針對(duì)這種腫瘤有效的化療藥物。三、實(shí)驗(yàn)材料1、實(shí)驗(yàn)設(shè)備：離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀2、實(shí)驗(yàn)器材：吸管、離心管、微量吸液管、微量移液

19、器、96孔培養(yǎng)板3、實(shí)驗(yàn)試劑：MTT、含10% FCS的培養(yǎng)基、PBS、DMSO（二甲基亞砜）、胰酶4、化療藥物：順鉑（DDP）、足葉乙甙（VP-16）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、長(zhǎng)春新堿（VCR）5、細(xì)胞株：HeLa（人宮頸癌細(xì)胞株）、HeP-2（人喉癌細(xì)胞株）、HCT/8（人結(jié)腸癌細(xì)胞株）、U251（人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株）四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）化療藥物濃度配置不同劑量組藥物實(shí)驗(yàn)終濃度(g/ml)分組血漿峰值濃度倍數(shù)DDP5-FuVP-16VCR110120200060082112200600.830.11.22060.0840.010.1220.60.008使用的化療藥物濃度按照血漿峰值濃度(g/m

20、l)= 50 ×（臨床每日用量（mg/ Kg）/5000）×2 ×103）計(jì)算，以10倍、1 倍、0.1 倍、0.01 倍實(shí)驗(yàn)，四種藥物具體用量見(jiàn)上表：（二）步驟1、細(xì)胞培養(yǎng)及加藥（1）將HeLa、HeP-2、HCT/8、U251消化，計(jì)數(shù)、以每孔1×105細(xì)胞數(shù)接種到96孔板，每孔培養(yǎng)基液體為200µl，每一張96孔板接種兩種細(xì)胞。（2）將4種化療藥物以四種濃度，10µl加入各個(gè)孔中，做5平行孔，剩余孔做對(duì)照組。（3）將96孔板放入CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48小時(shí)。2、藥物殺傷效率的測(cè)定（1）向培養(yǎng)48小時(shí)后的細(xì)胞孔內(nèi)加入10µ

21、l MTT ，37作用3小時(shí)。（2）吸棄孔內(nèi)液體，用PBS洗一次，加入200µl DMSO，室溫作用5分鐘，可以輕微震蕩，使藍(lán)色結(jié)晶全部溶解。（3）在酶標(biāo)儀492nm處測(cè)定吸光度值。（4）計(jì)算細(xì)胞的殺傷敏感率：敏感率（%）=（對(duì)照組OD492藥物組OD492）/ 對(duì)照組OD492×100%，超過(guò)50%為高度敏感。思考題在設(shè)計(jì)藥物對(duì)細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)注意哪幾點(diǎn)？實(shí)驗(yàn)五 細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、  掌握雜交瘤技術(shù)的原理和細(xì)胞融合的基本方法。2、  了解篩選雜交瘤細(xì)胞，克隆化培養(yǎng)，單克隆抗體的制備與鑒定。二、實(shí)驗(yàn)原理雜交瘤技術(shù)主要是由免疫動(dòng)物，細(xì)胞融合，

22、篩選雜交瘤細(xì)胞，克隆化培養(yǎng)，單克隆抗體的制備與鑒定等一系列實(shí)驗(yàn)組成的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，其核心是細(xì)胞融合。免疫動(dòng)物及細(xì)胞融合：為了獲得單克隆抗體，首先需要用特定的抗原免疫純系動(dòng)物已獲得分泌預(yù)定抗體的B淋巴細(xì)胞，將分泌預(yù)定抗體的B淋巴細(xì)胞和具有無(wú)限繁殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合成為雜交瘤細(xì)胞，這種雜交瘤細(xì)胞獲得了雙親本細(xì)胞的特性，既有分泌抗體的能力，又有無(wú)限繁殖的能力。通常采用聚乙二醇促融。篩選雜交瘤細(xì)胞，在細(xì)胞融合的過(guò)程，除了形成雜交瘤細(xì)胞外，還可能存在B淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的融合，骨髓瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的融合及未融合的親代細(xì)胞，脾臟細(xì)胞在體外培養(yǎng)10天左右會(huì)自行衰亡，對(duì)雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)影響，而未融合的骨髓

23、瘤細(xì)胞或其自身融合物，由于生長(zhǎng)快，會(huì)抑制雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此必須進(jìn)行選擇培養(yǎng)，通常應(yīng)用HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞。HAT培養(yǎng)基是在一般的培養(yǎng)基內(nèi)添加了葉酸拮抗物氨基喋呤，用以阻斷嘌呤和嘧啶的內(nèi)源性生物合成途徑，并提供了核苷酸的前體胸腺嘧啶核苷、次黃嘌呤等，供細(xì)胞外源性生物合成用。細(xì)胞DNA合成有主要通路和旁路兩條途徑，當(dāng)細(xì)胞DNA合成主要通路被氨基喋呤阻斷時(shí)，細(xì)胞可利用旁路進(jìn)行DNA的合成。在雜交瘤技術(shù)中應(yīng)用的骨髓瘤細(xì)胞是經(jīng)過(guò)用嘌呤類(lèi)似物8-氮鳥(niǎo)嘌呤或6-巰基鳥(niǎo)嘌呤篩選而得到的遺傳基因缺陷型細(xì)胞系，它們?nèi)鄙俅吸S嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶或胸腺嘧啶核苷激酶，無(wú)法利用補(bǔ)充的次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷

24、旁路合成DNA，從而導(dǎo)致骨髓瘤細(xì)胞死亡，雜交瘤細(xì)胞在染色體雜交后，經(jīng)旁路合成DNA， 使雜交瘤細(xì)胞得以繁殖生存?？寺』囵B(yǎng)：生長(zhǎng)繁殖的雜交瘤細(xì)胞并非每個(gè)都能分泌預(yù)定的抗體。因此，必須利用免疫熒光檢測(cè)技術(shù)，免疫酶測(cè)定技術(shù)等手段，篩選出穩(wěn)定分泌預(yù)定抗體的雜交瘤細(xì)胞。為了保證分泌抗體的單一性，還必須通過(guò)有限稀釋法或軟瓊脂克隆培養(yǎng)法進(jìn)行多克隆化培養(yǎng)，這樣就可以用來(lái)大量制備單克隆抗體。單克隆抗體的大量制備與鑒定：制備單克隆抗體的方法有兩種，一是動(dòng)物體內(nèi)誘生法，即將雜交瘤細(xì)胞接種于同系小鼠或裸鼠腹腔內(nèi)，經(jīng)一定的時(shí)間，動(dòng)物腹腔內(nèi)產(chǎn)生含單克隆抗體的腹水；另一類(lèi)是體外培養(yǎng)法，如懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，即采用轉(zhuǎn)瓶或發(fā)酵罐式

25、的生物反應(yīng)器以及中空纖維細(xì)胞和微囊化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。三、實(shí)驗(yàn)材料1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：7-12周齡BALB/C小鼠。2、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞MOPC-21。3、手術(shù)器械：大鉤鑷、眼科剪。4、實(shí)驗(yàn)器皿：玻璃平皿、吸量管、50 ml離心管、孔徑45m尼龍紗網(wǎng)、96孔培養(yǎng)板。5、實(shí)驗(yàn)試劑：碘棉、75%乙醇、HAT選擇培養(yǎng)基、PEG1000溶液、無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基。 RPMI-1640培養(yǎng)液的配制：按包裝袋上的說(shuō)明，用新鮮三次蒸餾水配制。內(nèi)含10%新生牛血清，2mmol/L左旋谷氨酰胺、100g/ml 青霉素鈉、100U/ml（硫酸）鏈霉素，調(diào)pH=7.07.2，過(guò)濾除菌，分裝，-20貯存?zhèn)溆?。HA

26、T培養(yǎng)液的配制：在含10%小牛血清的RPMI1640中，加次黃嘌呤136g/ml，氨基喋呤0.19g/ml，胸腺嘧啶3.88g/ml，冷凍避光保存（氨基喋呤對(duì)光敏感）。PEG1000溶液（50%）的配制：取25ml PEG1000 溶液加入25ml無(wú)小牛血清的RPMI1640溶液，常溫保存。6實(shí)驗(yàn)設(shè)備：超凈工作臺(tái)、倒置相差顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、臺(tái)式離心機(jī)、電子分析天平、酸度計(jì)等。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)：骨髓瘤細(xì)胞以懸浮或半貼壁形式生長(zhǎng)，用吸管吹打使細(xì)胞分散，傳代培養(yǎng)，通常是細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用于融合實(shí)驗(yàn)的骨髓瘤細(xì)胞還必須對(duì)HAT培養(yǎng)液敏感。在融合實(shí)驗(yàn)前兩周，細(xì)胞要培養(yǎng)在篩選建株時(shí)應(yīng)

27、用的堿基類(lèi)似物致死劑8-鳥(niǎo)嘌呤培養(yǎng)基中。融合前一天傳代一次，接種濃度可為4×1055×105/ml并換為常規(guī)培養(yǎng)液。2、制備飼養(yǎng)層細(xì)胞（小鼠腹腔滲出細(xì)胞）：為了使融合后的雜交瘤細(xì)胞獲得最佳的生長(zhǎng)條件以及增加雜交瘤的產(chǎn)量，常需制備飼養(yǎng)層。BALB/C小鼠脫頸處死后，75酒精浸泡5min，無(wú)菌暴露腹腔，腹腔內(nèi)注射10ml RPMI-1640培養(yǎng)液，吸出腹腔滲出細(xì)胞調(diào)整濃度到1×105/ml，接種于96孔板，每孔100l。3、免疫脾細(xì)胞制備：（1）免疫動(dòng)物：根據(jù)骨髓瘤細(xì)胞株的來(lái)源選擇脾細(xì)胞的供體。目前應(yīng)用的最普遍的是BALB/C小鼠，免疫動(dòng)物所用的抗原劑量取決于免疫原性

28、。細(xì)菌、病毒顆粒性抗原一般具有較強(qiáng)的免疫原性，用這類(lèi)抗原免疫動(dòng)物可不用佐劑，而可溶性抗原常需加佐劑，在小鼠頸背部皮下多點(diǎn)注射或腹腔注射，隔24周后，取同量的抗原加不完全佐劑追加免疫一次，再間隔4周，取同量的抗原不加佐劑經(jīng)靜脈或腹腔追加免疫。（2）制備免疫脾細(xì)胞懸液：BALB/C小鼠脫頸處死后，75酒精浸泡5min，無(wú)菌暴露腹腔取脾，放入無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行研磨，尼龍紗網(wǎng)過(guò)濾，吸取脾細(xì)胞懸液進(jìn)行離心（1500rpm，5min），棄上清，加少量培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，一般一個(gè)脾臟平均可得1×108個(gè)脾細(xì)胞。4、細(xì)胞融合：（1）融合前一天將PEG1000放入CO2培養(yǎng)箱中調(diào)整p

29、H至7.2-7.4。（2）將PEG1000和培養(yǎng)液置37水箱中溫?zé)?。?）將骨髓瘤細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞以1：5的比例（2×107個(gè)骨髓瘤細(xì)胞和1×108個(gè)脾細(xì)胞混合），用小玻璃棒輕輕地混合無(wú)血清培養(yǎng)液中的細(xì)胞，避免用吸管強(qiáng)烈地吹吸以免損傷細(xì)胞，離心1500rpm，5min。（4）棄掉所用的上清（PEG的濃度是嚴(yán)格的，若遺留上清液將影響PEG濃度），不要旋動(dòng)或敲打試管，保持細(xì)胞團(tuán)完整。（5）將試管放在恒溫干浴中，保持37溫?zé)幔?ml吸管慢慢地將37預(yù)溫的50%PEG1000溶液0.8ml加至密集的細(xì)胞團(tuán)中，用吸管尖端慢慢攪動(dòng)，使PEG與細(xì)胞混合，但不要吹吸。（6）試管仍放在干浴

30、中，用吸管尖端繼續(xù)緩緩攪動(dòng)1分鐘。（7）在1分鐘內(nèi)加完1ml預(yù)溫的培養(yǎng)液，試管仍放在干浴中以保持溫度，重復(fù)一次此操作。（8）于2分鐘內(nèi)加入10ml37預(yù)溫的培養(yǎng)液。（9）1500r/min離心10分鐘。（10）去除上清液，重新將細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，使最后濃度為1×106細(xì)胞/0.12ml （相當(dāng)于5ml吸管的2滴）。（11）用無(wú)菌的5ml吸管，將細(xì)胞懸液加于已在前一天接種了飼養(yǎng)細(xì)胞（每孔含1×104飼養(yǎng)細(xì)胞/0.1ml)的96孔培養(yǎng)板中，每孔2滴。 思考題制備雜交瘤細(xì)胞的關(guān)鍵是什么？實(shí)驗(yàn)六 植物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類(lèi)及配制一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解植物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類(lèi)及營(yíng)養(yǎng)要求。2、掌

31、握MS培養(yǎng)基的配制方法。二、實(shí)驗(yàn)材料1、實(shí)驗(yàn)設(shè)備：高壓滅菌鍋、電子分析天平、pH計(jì)、超凈工作臺(tái)。2、實(shí)驗(yàn)器材：電磁爐、燒杯、量筒、攪拌棒、吸量管、移樣槍。三、植物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類(lèi)在100多年的植物組織、器官和細(xì)胞離體培養(yǎng)研究中，研制開(kāi)發(fā)了數(shù)十種適宜不同植物、不同組織、不同細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的培養(yǎng)基配方，但多數(shù)培養(yǎng)基是在幾種普遍應(yīng)用的培養(yǎng)基上演變而來(lái)的，其中應(yīng)用最為廣泛的仍為MS培養(yǎng)基。植物組織培養(yǎng)基早期的建立，如White提出的根培養(yǎng)基和Gautheret提出的愈傷組織培養(yǎng)基，都是由先前的用于整體植物栽培的營(yíng)養(yǎng)液發(fā)展而來(lái)的。以后所有的各種培養(yǎng)基又都是在White培養(yǎng)基和Gautheret培養(yǎng)基的基礎(chǔ)

32、上形成的。各種培養(yǎng)基在無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)組成上的差異主要是鹽和離子數(shù)量上的不同。常用培養(yǎng)基中根據(jù)無(wú)機(jī)鹽的含量可以分為4類(lèi)，分述于下：1、高無(wú)機(jī)鹽含量培養(yǎng)基：高無(wú)機(jī)鹽含量培養(yǎng)基中，鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽含量較高，微量元素種類(lèi)齊全，養(yǎng)分?jǐn)?shù)量及比例較合適，廣泛用于植物的器官、花藥、細(xì)胞及原生質(zhì)體的培養(yǎng)。主要有MS培養(yǎng)基和ER培養(yǎng)基。2、較高硝酸鉀含量培養(yǎng)基：較高硝酸鉀含量培養(yǎng)基適合于木本植物、十字花科植物和單子葉植物的組織和花藥培養(yǎng)。主要有B5培養(yǎng)基和N6培養(yǎng)基。3、中等無(wú)機(jī)鹽含量培養(yǎng)基：中等無(wú)機(jī)鹽含量培養(yǎng)基中，大量元素約為MS培養(yǎng)基的一半，微量元素種類(lèi)減少，但含量較MS的高，適合于花藥培養(yǎng)。主要有Nitsch培

33、養(yǎng)基和NT培養(yǎng)基。4、低無(wú)機(jī)鹽含量培養(yǎng)基：低無(wú)機(jī)鹽量培養(yǎng)基中，大量元素含量大幅降低而且種類(lèi)減少，多數(shù)用于生根培養(yǎng)基。主要有White培養(yǎng)基和Heller培養(yǎng)基。各種植物培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)組成及配方如下表：表6-1 植物培養(yǎng)基種類(lèi)及成分培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基（mg/L）MS（1962）ER（1965）B5（1968）N6（1975）Nitsch1963NT（1971）White（1963）Heller（1953）NH4NO3KNO3CaCl2·2H2OCaCl2MgSO4·7H2O1 6501 900 440 3701 2001 900 440 3702 527.50 1502502 8

34、30 166 185 720 950 166 185 825 950 220 1 233 80 750 75 250KH2PO4（NH4）2SO4Ca（NO3）2·4H2ONaNO3Na2SO4 170340 134 400 463 68 680 300 200600NaH2PO4·H2OKClKIH3BO3MnSO4·4H2O 0.83 6.20 22.30 0.63 2.23 150 0.75 3.00 0.80 1.60 4.40 10.00 25.00 0.83 6.20 22.30 19.00 65.00 0.75 1.50 5.00 125 750 0

35、.01 1.00 0.10MnSO4·H2OZnSO4·7H2OZnSO4·4H2OZn·Na2·EDTANa2MoO4·2H2O 8.60 0.25 15.00 0.025 10.00 2.00 0.25 3.80 10.00 0.25 8.60 0.25 3.00 1.00MoO3CuSO4·5H2OCoCl2·6H2OCoSO4·7H2OAlCl3 0.025 0.0250.0025 0.00250.025 0.025 0.025 0.025 0.03 0.001 0 .01 0.030.03NiC

36、l2·6H2OFeCl3·6H2OFe2（SO4）3FeSO4·7H2ONa2·EDTA·2H2O 27.80 37.3027.80 37.3027.80 37.3027.80 37.3027.80 37.3027.80 37.30 2.50 0.03 1.00肌醇煙酸鹽酸吡哆醇鹽酸硫胺素甘氨酸100 0.50 0.50 0.10 2.000.50 0.50 0.50 2.00 100 1.00 1.00 10.00 0.50 0.50 1.00 2.00 1005.00 0.50 0.50 2.00 100 1.00 0.05 0.01 0.

37、01 3.00葉酸生物素蔗糖D-甘露醇30 00040 00020 00050 0000.50 0.0520 000 10 000127 00020 000四、MS培養(yǎng)基的配制植物細(xì)胞培養(yǎng)基種類(lèi)很多，如MS、ER、B5、N6、NT和White等。本實(shí)驗(yàn)以MS完全培養(yǎng)基為例，介紹植物細(xì)胞培養(yǎng)基的配制方法。（一）MS培養(yǎng)基母液的配制母液的配制是按藥品的種類(lèi)和性質(zhì)分別配制，單獨(dú)保存或幾種混合保存。配制好的母液種類(lèi)一般有大量元素、微量元素、鈣鹽、鐵鹽、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)和單獨(dú)保存的各種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)類(lèi)物質(zhì)。大量元素一般配制成10倍濃度的母液，微量元素和有機(jī)物常配制成100倍濃度的母液。表6-2 MS培養(yǎng)基配方母 液成

38、 分規(guī)定量（mg/L）擴(kuò)大倍數(shù)稱(chēng)取量（mg）母液體積（mL）配1L培養(yǎng)基吸取量（mL）編號(hào)種類(lèi)1大量元素KNO31 9001019 0001000100NH4NO31 65016 500MgSO4·7H2O3703 700KH2PO41701 7002鈣鹽CaCl2·2H2O440104 40010001003微量元素MnSO4·4H2O22.31002 230100010ZnSO4·7H2O8.60860H3BO36.20620KI0.8383Na2Mo4·2H2O0.2525CuSO4·5H2O0.0252.5CoCl2·

39、;6H2O0.0252.54鐵鹽Na2·EDTA37.301003 730100010FeSO4·4H2O27.802 7805有機(jī)物質(zhì)甘氨酸2.005010050010鹽酸硫胺素0.105鹽酸吡哆醇0.5025煙酸0.5025肌醇1005 000表6-2提供了MS培養(yǎng)基母液的配方。將各種化合物按指定擴(kuò)大倍數(shù)準(zhǔn)確稱(chēng)量、分別溶解后，按先后次序加入蒸餾水中，最后用蒸餾水定容。注意：在混合定容時(shí)，一定要掌握藥劑的先后次序或稀釋度，以免發(fā)生沉淀。鈣鹽和鐵鹽由于與其它母液混合容易發(fā)生沉淀反應(yīng)，因此需單獨(dú)配制。鐵鹽為螯合狀態(tài)時(shí)，有利于植物在適宜的pH下吸收和利用，因此需與螯合劑Na2&

40、#183;EDTA混合配制。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)類(lèi)物質(zhì)一般分別配制成0.21.0mg/L的母液，用時(shí)按量吸取。某些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不溶于水，需用不同溶劑進(jìn)行溶解，如NAA、2,4-D、IAA、IBA、GA3是醇溶性的，配制時(shí)先用少量95%酒精溶解，然后再用蒸餾水定溶；KT、6-BA、2ip、ZT先溶于少量1mol/L鹽酸中，然后再用蒸餾水定容；葉酸先用少量稀氨水溶解后再定容。配制好的各種母液倒入棕色瓶中，貼好標(biāo)簽，保存于4冰箱中備用。注意：母液保存于冰箱中的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般為12個(gè)月，當(dāng)母液出現(xiàn)沉淀或霉菌團(tuán)時(shí)，則不能再使用。（二）MS完全培養(yǎng)基的配制以配制1 000mL MS完全培養(yǎng)基為例，配制全過(guò)程如下：1

41、、 在潔凈的不銹鋼（或搪瓷）容器中加入1/2終體積（500mL）的蒸餾水；2、 按表2內(nèi)容規(guī)定的量，精確吸取各種母液，依次加入到盛有1/2終體積蒸餾水的不銹鋼（或搪瓷）容器中，記錄此時(shí)的總體積。注意：母液不能混合后加入，也不能同時(shí)加入，必須依次緩慢加入，且要一邊加入一邊攪拌，以免造成電解質(zhì)局部濃度過(guò)高而發(fā)生沉淀反應(yīng)；3、 根據(jù)培養(yǎng)目的及要求，加入所需量的各種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，記錄此時(shí)的總體積（如用于長(zhǎng)春花葉愈傷組織的誘導(dǎo)：加入2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、 NAA 1.0mg/L、KT 0.2mg/L）；4、 加入30g蔗糖，5g聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrro

42、lidone，PVP，抗氧化劑，防止或減輕植物組織褐化，也可用一定量的維生素C、活性碳代替，或不加，視情況而定），充分混勻后，補(bǔ)充蒸餾水至終體積1 000mL，然后用1mol/L鹽酸或1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基至pH5.8；5、 精確稱(chēng)取15g瓊脂加入其中，在電磁爐上煮沸溶解瓊脂。此過(guò)程需加以攪拌，防止瓊脂在鍋底燒焦或沸騰溢出；6、 瓊脂溶解后，及時(shí)將培養(yǎng)基分裝于150mL三角瓶中，約50mL/瓶，包膜密封，并于100KPa、121下滅菌1520分鐘。冷卻備用。注意：培養(yǎng)基的pH直接影響培養(yǎng)物對(duì)離子的吸收，過(guò)酸或過(guò)堿不僅影響到培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)，而且還影響到瓊脂的凝固，pH低于5.5時(shí)，瓊脂凝

43、固程度不好，pH高于6.0時(shí)，瓊脂過(guò)度凝固，培養(yǎng)基變硬，不利于培養(yǎng)材料對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及對(duì)代謝廢物的排放，從而影響培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)。培養(yǎng)基的pH可用酸度計(jì)測(cè)試，并用1mol/L鹽酸或1mol/L氫氧化鈉調(diào)整至適宜范圍（1mol/L鹽酸配制方法：取12mol/L HCl 84mL，加入蒸餾水定容至1 000mL；1mol/L氫氧化鈉配制方法：稱(chēng)40g NaOH，溶解后加入蒸餾水，定容至1 000 mL）。培養(yǎng)的植物材料其生長(zhǎng)最適pH范圍為5.66.0，培養(yǎng)基經(jīng)高壓高溫滅菌后，由于某些成分的降解或氧化，酸度會(huì)增加，pH一般可降低0.2，因此配制植物培養(yǎng)基時(shí)，通常調(diào)整pH至5.8。對(duì)于某些不能高壓高溫

44、滅菌的試劑或藥品，必須過(guò)濾除菌，待培養(yǎng)基滅菌后未凝固之前（4560）加入，并輕搖使混勻。這時(shí)，每個(gè)培養(yǎng)容器的裝入量和過(guò)濾除菌后的物質(zhì)都要事先計(jì)算好，定量加入其中。植物培養(yǎng)基的配制程序可用流程圖表示如下： 水藥品 混勻 pH調(diào)整 瓊脂 加熱溶解 糖 玻璃器皿 水洗 干燥 分裝 密封 接種 冷卻 高溫蒸汽滅菌 實(shí)驗(yàn)七 長(zhǎng)春花葉片愈傷組織的誘導(dǎo)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)對(duì)長(zhǎng)春花葉片愈傷組織的誘導(dǎo)，分析生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)長(zhǎng)春花葉片離體培養(yǎng)的作用，熟練掌握植物組織離體培養(yǎng)培的基本操作技術(shù)，了解植物組織在離體培養(yǎng)條件下脫分化的條件及特點(diǎn)。二、實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)植物細(xì)胞全能性理論，利用MS培養(yǎng)基，加入一定濃度的生長(zhǎng)素和細(xì)

45、胞分裂素對(duì)長(zhǎng)春花葉片組織進(jìn)行培養(yǎng)，在光照或黑暗條件下均可誘導(dǎo)長(zhǎng)春花葉片組織發(fā)生脫分化而產(chǎn)生愈傷組織，這已經(jīng)在許多植物的組織培養(yǎng)中得到證實(shí)，甚至在一些低等植物（如葫蘆蘚）中也得到了證實(shí)。三、實(shí)驗(yàn)材料1、實(shí)驗(yàn)設(shè)備：超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、pH計(jì)、光照培養(yǎng)箱、暗培養(yǎng)箱。2、實(shí)驗(yàn)器材：三角瓶（150 mL）、棕色瓶（100 mL，500 mL，1000 mL）、長(zhǎng)柄鑷子、塑料燒杯（500 mL，l000 mL）、玻璃燒杯（100 mL、500 mL，l000 mL）、量筒（100 mL，500 mL，1000 mL）、培養(yǎng)皿（=12 cm）、手術(shù)刀。3、實(shí)驗(yàn)試劑：萘乙酸（Napthylacetic a

46、cid，NAA）、6-芐基氨基嘌呤（6-Benzylamino purine，6-BA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）、KT（kinetin，KT）、升汞（HgCl）、次氯酸鈉溶液、95%酒精、蔗糖（Sucrose）、瓊脂（Agar）、MS基本培養(yǎng)基母液。 4、試劑配制：（1）MS基本培養(yǎng)基母液：見(jiàn)實(shí)驗(yàn)六表6-2（2）1 mol/L NaOH：將40g NaOH溶解在1升蒸餾水中，攪拌均勻。（3）1 mol/L HCl：用蒸餾水將12mol/L的濃鹽酸稀釋12倍。（4）生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液： 0.2 mg/mL萘乙酸（NAA）溶液：

47、精確稱(chēng)取20mg萘乙酸，用少量1 mol/L NaOH溶解后，用蒸餾水稀釋并定容到100 ml。 0.2 mg/mL 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）溶液：精確稱(chēng)取20 mg 2,4-二氯苯氧乙酸，用少量1 mol/L的NaOH溶解后，用蒸餾水稀釋并定容到100ml。 0.2 mg/mL 6-芐氨基嘌呤（6-BA）溶液：精確稱(chēng)取20 mg 6-芐基氨基嘌呤，用少量1 mol/L的HCl溶解后，用水稀釋并定容到100ml。 0.1 mg/mL KT（kinetin，KT）溶液：精確稱(chēng)取10 mg KT，用少量1 mol/L的HCl溶解后，用水稀釋并定容到100ml。（5）75的消毒酒精：精確量

48、取75ml無(wú)水乙醇溶于100ml蒸餾水中。（6）0.1%升汞（HgCl）溶液：精確稱(chēng)取1 g HgCl，用蒸餾水溶解并定容到1 000ml，盛裝于棕色試劑瓶中避光保存。（7）10%次氯酸鈉溶液：精確量取100ml次氯酸鈉溶液溶，用蒸餾水溶解并定容到1 000ml，盛裝于棕色試劑瓶中避光保存。5、實(shí)驗(yàn)用植株：長(zhǎng)春花幼苗。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、MS完全培養(yǎng)基的配制：（1）將各種貯液按比例混合，配制成MS培養(yǎng)基（具體操作見(jiàn)實(shí)驗(yàn)六）；（2）分別加入2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、 NAA 1.0mg/L、KT 0.2mg/L（此激素配方只適用于長(zhǎng)春花葉片愈傷組織的誘導(dǎo)。對(duì)于不同植物的外

49、植體來(lái)說(shuō)，影響其脫分化的激素種類(lèi)和用量是不一樣的，必需通過(guò)正交試驗(yàn)來(lái)篩選才能獲得最佳配方）；（3）培養(yǎng)基中加入3蔗糖，完全溶解后加蒸餾水至終體積；（4）用l N的NaOH調(diào)整培養(yǎng)基至pH 5.8；（5）加入15g/L瓊脂，將培養(yǎng)基置電磁爐上煮沸至瓊脂完全溶解，然后分裝到150ml三角瓶中，每瓶約50 ml，用封口膜包扎瓶口；（6）將三角瓶放入高壓滅菌鍋，于121、100KPa下滅菌1520 min。待壓力下降為零，溫度降低到105以下，打開(kāi)放氣閥排氣后，取出三角瓶，平放冷卻備用；（7）按上述方法高壓滅菌蒸餾水、空三角瓶、培養(yǎng)皿（帶濾紙）及其它相關(guān)用具。2、外植體的表面消毒與接種培養(yǎng)：（1）取長(zhǎng)

50、春花完全展開(kāi)的幼葉，用自來(lái)水流水沖洗12 h；（2）在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌水將葉片洗滌23次，每次1 min，然后浸于含75酒精的無(wú)菌三角瓶中輕搖30s，再移入0.1升汞溶液中輕搖58 min或10的次氯酸鈉溶液中輕搖810 min（消除外植體表面的微生物），無(wú)菌水洗滌35次（消毒液對(duì)外植體有很大傷害，必須清洗干凈），每次3 min；（3）將消毒后的長(zhǎng)春花葉片置于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)（有無(wú)菌濾紙），用手術(shù)刀將無(wú)菌葉片切成5mm×5 mm大?。唬?）將適宜大小的外植體接種到培養(yǎng)基上，每個(gè)三角瓶中接入34塊葉外植體；（5）將接種好的三角瓶置于光培養(yǎng)箱（光周期為：光照16 h和黑暗8 h，光照強(qiáng)度約

51、l500 lx左右）或暗培養(yǎng)箱內(nèi)的培養(yǎng)架上，培養(yǎng)溫度為26±1；（6）每天觀察培養(yǎng)情況，記錄結(jié)果。如：接種培養(yǎng)后，外植體（培養(yǎng)材料）在形態(tài)學(xué)上的變化情況，愈傷組織開(kāi)始出現(xiàn)時(shí)間、愈傷組織誘導(dǎo)率、形態(tài)、生長(zhǎng)速率、顏色變化及質(zhì)地等指標(biāo)?！舅伎碱}】影響長(zhǎng)春花葉外植體脫分化的條件及特點(diǎn)是什么？實(shí)驗(yàn)八 植物愈傷組織細(xì)胞的傳代培養(yǎng)1、  掌握植物愈傷組織細(xì)胞傳代培養(yǎng)的原理及操作方法。2、 了解植物細(xì)胞培養(yǎng)的意義。二、實(shí)驗(yàn)原理 和動(dòng)物細(xì)胞傳代培養(yǎng)一樣，植物細(xì)胞傳代培養(yǎng)也是組織培養(yǎng)的常規(guī)保種方法之一，是幾乎所有細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞不斷生長(zhǎng)增殖，培養(yǎng)基中

52、的營(yíng)養(yǎng)成分逐漸耗盡，同時(shí)也積累大量的代謝廢物，從而反饋抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致細(xì)胞褐化而死。這時(shí)需要進(jìn)行分離培養(yǎng)，否則細(xì)胞會(huì)因生存空間不足，營(yíng)養(yǎng)障礙，生長(zhǎng)條件惡化而死亡。細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分離后轉(zhuǎn)到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)的過(guò)程稱(chēng)為傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)可獲得大量細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)所需。三、實(shí)驗(yàn)材料1、實(shí)驗(yàn)設(shè)備：超凈工作臺(tái)、pH計(jì)、高壓滅菌鍋、生化培養(yǎng)養(yǎng)箱。2、實(shí)驗(yàn)器材：三角瓶（150 mL）、棕色瓶（100 mL，500 mL，1000 mL）、長(zhǎng)柄鑷子、塑料燒杯（500 mL，l000 mL）、玻璃燒杯（100 mL、500 mL，l000 mL）、量筒（100 mL，500 mL，1000 mL）、

53、培養(yǎng)皿（=12 cm）、手術(shù)刀。3、實(shí)驗(yàn)試劑：萘乙酸（Napthylacetic acid，NAA）、6-芐基氨基嘌呤（6-Benzylamino purine，6-BA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）、KT（kinetin，KT）、95%酒精、蔗糖（Sucrose）、瓊脂（Agar）、MS基本培養(yǎng)基母液。 （4）生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液： 0.2 mg/mL萘乙酸（NAA）溶液：精確稱(chēng)取20mg萘乙酸，用少量1 mol/L NaOH溶解后，用蒸餾水稀釋并定容到100 ml。 0.2 mg/mL 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）溶液：精確稱(chēng)取20 mg 2,4-二氯苯氧乙酸，用少量1 mol/L的NaOH溶解后，用蒸餾水稀釋并定容到100ml。 0.2 mg/mL 6-芐氨基嘌呤（6-BA）溶液：精確稱(chēng)取20 mg 6-芐基氨基嘌呤，用少量1 mol/L的HCl溶解后，用水稀釋并定容到100ml。 0.1 mg/mL KT（kinetin，KT）溶液：精確稱(chēng)取10 mg KT，用少量1 mol/L的HCl溶解后，用水稀釋并定容到100ml。（5）75的消毒酒精：精確量取75ml無(wú)水乙醇溶于100ml蒸餾水中。5、實(shí)