第二十章 臨床免疫檢驗的質(zhì)量保證

1、第一章第一章 血液標(biāo)本采集與處理血液標(biāo)本采集與處理臨床免疫學(xué)檢驗技術(shù)第二十章第二十章 臨床免疫檢驗的質(zhì)量保證臨床免疫檢驗的質(zhì)量保證張 瑞目 錄第一節(jié) 基本概念第二節(jié) 臨床免疫學(xué)檢驗的技術(shù)特點第三節(jié) 分析前質(zhì)量保證第四節(jié) 分析中質(zhì)量保證第五節(jié) 分析后質(zhì)量保證第一節(jié)第一節(jié) 基本概念基本概念質(zhì)量監(jiān)控（質(zhì)量監(jiān)控（quality assurance, QA）臨床實驗室為證明提供給患者臨床診療或臨床實驗臨床實驗室為證明提供給患者臨床診療或臨床實驗數(shù)據(jù)的有效性而采取的一系列措施，涵蓋了實驗室數(shù)據(jù)的有效性而采取的一系列措施，涵蓋了實驗室檢測前、中、后的所有活動。檢測前、中、后的所有活動。重點提示敏感性（Sen

2、sitivity）特異性(Specificity)陽性預(yù)測值(Positive Predictive Value, PPV)陰性預(yù)測值(Negative Predictive Value, NPV)精密度(Precision)準(zhǔn)確度(Accuracy)室內(nèi)質(zhì)量控制(Internal Quality Control, IQC)室間質(zhì)量評價(External Quality Control, EQC)第二節(jié)第二節(jié) 臨床免疫學(xué)檢驗的技術(shù)特點臨床免疫學(xué)檢驗的技術(shù)特點重點提示陽性反應(yīng)判斷值的設(shè)定臨床預(yù)測值根據(jù)陽性預(yù)測值對免疫測定方法的分類：篩查試驗；診斷試驗；確認(rèn)試驗一、陽性反應(yīng)判斷值的設(shè)定在大部分的免

3、疫測定中，陽性人群標(biāo)本檢測值的范圍與陰性人群標(biāo)本檢測值的范圍往往會存在部分的重疊，因此為了判斷定性免疫測定的結(jié)果，需要設(shè)定判斷陰性或陽性結(jié)果的陽性反應(yīng)判斷值(cut-off value)。二、臨床預(yù)測值 結(jié)結(jié) 果果 50%感染率感染率 30%感染率感染率 10%感染率感染率 1%感染率感染率 0.5%感染率感染率 檢出 (+)未檢出 () 檢出 (+)未檢出 () 檢出 (+)未檢出 () 檢出(+)未檢出() 檢出(+) 未檢出() +49,500 50029,700 300 9,900 100 990 10 495 5 50049,500 70069,300 900 89,100 990

4、98,010 99598,505敏感性(TP/TP+FN) 99% 99% 99% 99% 99%特異性(TN/TN+FP) 99% 99% 99% 99% 99%陽性預(yù)示值TP/TP+FP49500/49500+500=99.0%29700/29700+700=94.6%9900/9900+900=91.67%990/990+990=50%495/495+995=33.2%陰性預(yù)示值TN/TN+FN49500/49500+500=99.0%69300/69300+300=99.6%89100/89100+100=99.89%98010/98010+10=99.99%98505/98505+5

5、=99.99%三、根據(jù)陽性預(yù)測值對免疫測定方法的分類篩查試驗 (screening tests) 用于檢測整個人群或部分人群中抗原或抗體的存在情況。一般而言，篩查試驗應(yīng)當(dāng)具有較高的臨床敏感性（即臨床檢出率大于95%），對其特異性的要求（和陽性預(yù)測值）則取決于對各種因素的綜合考慮，例如假陽性結(jié)果是否會對被檢測人經(jīng)濟或心理上產(chǎn)生嚴(yán)重的不良影響、對誤診病例的治療是否會產(chǎn)生嚴(yán)重的后果（例如，由于風(fēng)疹抗體水平較高，而懷疑妊娠期感染，為避免感染造成的不良后果，需要進行流產(chǎn)手術(shù)以終止妊娠）、是否有可以對陽性篩查結(jié)果進行確認(rèn)的方法、確認(rèn)是否易于執(zhí)行、確認(rèn)方法是否價格昂貴等。通常情況下，篩查試驗結(jié)果陰性提示被檢

6、測人待測物陰性的可能性很高，而篩查試驗結(jié)果陽性僅提示陽性結(jié)果的可能，但需要進一步的確認(rèn)。診斷試驗診斷試驗診斷試驗 (diagnostic tests) (diagnostic tests) 用于檢測臨床上已懷疑某種疾病的患者中抗原或抗體的存在情況。如果待測的抗原或抗體對于治療以及判斷預(yù)后有重要意義，則該診斷試驗應(yīng)當(dāng)具有足夠高的敏感性。如果試驗的結(jié)果可以很容易地通過確認(rèn)試驗進行確認(rèn)，且確認(rèn)試驗的準(zhǔn)確性高，那么對診斷試驗的特異性要求可適當(dāng)降低。確認(rèn)試驗確認(rèn)試驗（確認(rèn)試驗（confirmatory testsconfirmatory tests）用于對篩查試驗或者診斷試驗結(jié)果的確認(rèn)。對于確認(rèn)試驗，特

7、異性和陽性預(yù)測值比敏感性和陰性預(yù)測值更為重要，確認(rèn)試驗的特異性應(yīng)當(dāng)大于99%。確認(rèn)試驗可以是免疫測定，也可以是培養(yǎng)或核酸檢測。一般來說，可以作為確認(rèn)試驗的免疫測定方法有免疫印跡試驗、重組免疫印跡、抗體中和試驗等，但這些方法不一定就是確認(rèn)試驗，這取決于試劑的特異性是否足夠高。如果診斷試驗本身的特異性和陽性預(yù)測值就很高，那么就沒有必要再使用確認(rèn)試驗進行結(jié)果的確認(rèn)。第三節(jié)第三節(jié) 分析前質(zhì)量保證分析前質(zhì)量保證分析前質(zhì)量保證分析前質(zhì)量保證檢驗項目的申請患者的準(zhǔn)備標(biāo)本的采集標(biāo)本的運送標(biāo)本的接收標(biāo)本的保存血清中影響檢測結(jié)果的常見內(nèi)源性干擾因素血清中影響檢測結(jié)果的常見血清中影響檢測結(jié)果的常見內(nèi)源性干擾因素內(nèi)源

8、性干擾因素l1.類風(fēng)濕因子（類風(fēng)濕因子（RF） （1）稀釋標(biāo)本）稀釋標(biāo)本（2）改變酶標(biāo)抗體）改變酶標(biāo)抗體（3）標(biāo)本中）標(biāo)本中RF用變性用變性IgG預(yù)先封閉預(yù)先封閉（4）測定抗原時，在標(biāo)本中加入使）測定抗原時，在標(biāo)本中加入使RF降解的還降解的還原劑原劑l2.補體補體 （1）血清標(biāo)本加熱滅活補體）血清標(biāo)本加熱滅活補體（2）使用雞特異性抗體）使用雞特異性抗體l3.異嗜性抗體異嗜性抗體 （1）在標(biāo)本或標(biāo)本稀釋液中加入過量的動物）在標(biāo)本或標(biāo)本稀釋液中加入過量的動物Ig（2）使用特異的兔）使用特異的兔F(ab)2片段作為固相或測定酶標(biāo)抗體。片段作為固相或測定酶標(biāo)抗體。（3）使用靶特異的非）使用靶特異的非I

9、g親和蛋白替代固相或其中一個酶標(biāo)親和蛋白替代固相或其中一個酶標(biāo)抗體?？贵w。（4）使用特異的雞抗體作為固相和測定抗體。）使用特異的雞抗體作為固相和測定抗體。l4.其他自身抗體其他自身抗體 抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等，能與其相應(yīng)抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等，能與其相應(yīng)靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，干擾相應(yīng)抗原測定。靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，干擾相應(yīng)抗原測定。為避免上述情況出現(xiàn)，可在測定前用理化方為避免上述情況出現(xiàn)，可在測定前用理化方法將其解離。法將其解離。l5.溶菌酶溶菌酶 第四節(jié)第四節(jié) 分析中的質(zhì)量保證分析中的質(zhì)量保證重點提示重點提示實驗室環(huán)境條件儀器設(shè)備維護校準(zhǔn)試劑方法的性能驗證標(biāo)準(zhǔn)操作程序的建立人員培訓(xùn)標(biāo)

10、本前處理室內(nèi)質(zhì)量控制室間質(zhì)量評價或?qū)嶒炇议g比對實驗室環(huán)境條件實驗室環(huán)境條件空間充分合理的空間良好的照明空調(diào)設(shè)備實驗室環(huán)境條件的控制溫度濕度不只是為了儀器設(shè)備運行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)與環(huán)境溫度和濕度均有關(guān)系實驗室儀器設(shè)備及管理加樣器：維護、校準(zhǔn)熒光顯微鏡：維護、校準(zhǔn)水浴箱：維護、校準(zhǔn)酶標(biāo)儀：維護、校準(zhǔn)洗板機：維護離心機：維護生物安全柜：維護冰箱：維護試劑方法的性能驗證精密度或重復(fù)性（定性和定量）準(zhǔn)確度（定性和定量）線性（定量）可報告范圍（定量）檢出限（定性）參考區(qū)間（定量）抗干擾能力（定性和定量）標(biāo)準(zhǔn)操作程序的建立需要將每個操作步驟標(biāo)準(zhǔn)化，并形成標(biāo)準(zhǔn)操作程序。最重要的是在測定中，所有的實驗技術(shù)人員在

11、進行相關(guān)測定時，必須嚴(yán)格按相應(yīng)的SOP進行操作，除非經(jīng)實際工作證明正在使用的SOP中有不適當(dāng)之處時，才可對SOP按一定程序進行修改。人員培訓(xùn)實驗人員需具有一定的專業(yè)技術(shù)知識和經(jīng)驗，包括檢測技術(shù)的基本原理、實驗操作、儀器設(shè)備的使用、維護和保養(yǎng)、質(zhì)量保證、質(zhì)量控制、生物安全、結(jié)果的報告和解釋等。從實際工作來看，不同的操作者所得到的測定結(jié)果，往往差異很大。因此人員的培訓(xùn)非常重要，應(yīng)根據(jù)實際工作的需要，建立定期培訓(xùn)計劃。標(biāo)本前處理標(biāo)本前處理血液采集后，如收集管中無促凝劑或抗凝劑，則血液通常在半小時后開始凝固，18小時24小時完全凝固。日常檢驗中，常在血液還未開始凝固時即離心分離血清，此時分離出的血清仍

12、殘留部分纖維蛋白原，易造成假陽性結(jié)果。因此，血液標(biāo)本采集后，應(yīng)使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?。室?nèi)質(zhì)量控制統(tǒng)計室內(nèi)質(zhì)量控制方法非統(tǒng)計室內(nèi)質(zhì)量控制方法Levey-Jennings質(zhì)控圖方法也稱Shewhart質(zhì)控圖，是由美國的Shewhart于1924年首先提出，并用于工業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。二十世紀(jì)五十年代初，Levey-Jennings將其引入臨床檢驗的質(zhì)量控制。經(jīng)Henry和Segalove的改良，即為目前常用的Levey-Jennings質(zhì)控圖。Levey-Jennings質(zhì)控圖方法Levey-Jennings質(zhì)控圖方法統(tǒng)計學(xué)含義穩(wěn)定條件

13、下，在20個IQC結(jié)果中不應(yīng)有多于1個結(jié)果超過2SD（95.5%可信限）限度；在1000個測定結(jié)果中超過3SD（99.7%可信限）的結(jié)果不多于3個。如以3s為失控限，假失控的概率為0.3%。 陽性率的統(tǒng)計室內(nèi)質(zhì)量控制方法按統(tǒng)計學(xué)規(guī)律，一個事件發(fā)生的概率小于5%被稱為小概率事件，即發(fā)生的可能性很小。當(dāng)一個小概率事件發(fā)生時，則可能有誤差存在，有必要對其發(fā)生的原因進行分析。對每天的日常病人結(jié)果中陽性率出現(xiàn)的概率進行計算，如果這種結(jié)果出現(xiàn)的概率小于5%時，則可判為失控。 根據(jù)二項式分布的概率計算如在一個實驗室中某檢測結(jié)果的陽性率為p，計算在n個患者樣本中有m個陽性結(jié)果的概率。根據(jù)二項式分布的概率計算公

14、式如下： Pm= Pm5%為失控。此時，陰性標(biāo)本可以發(fā)出報告，所有陽性標(biāo)本在查清原因后重做。 根據(jù)二項式分布的概率計算如果一個實驗室檢測HBsAg，平常病人結(jié)果的陽性率為10%，即p=0.1, 在某一次檢測19個樣本出現(xiàn)5個陽性結(jié)果，14個陰性結(jié)果，則檢測過程中是否存在污染的可能性可通過下述方法計算。即計算在19個樣本中出現(xiàn)至少5個陽性結(jié)果的概率，此時的概率為1-（獲得0個或1個或2個或3個或4個陽性結(jié)果的概率）即：1P(0)+P(1)+P(2)+P(3)+P(4)=10.919+19(0.9)18(0.1) +171(0.9)17 (0.1)2+969(0.9)16(0.1)3+3 876(

15、0.9)15(0.1)4=0.035說明在該實驗室19個標(biāo)本中獲得5個或5個以上陽性結(jié)果的概率為3.5%，屬于小概率事件，結(jié)果失控，有假陽性結(jié)果的可能。非統(tǒng)計室內(nèi)質(zhì)量控制方法在檢測臨床標(biāo)本的同時，檢測靶抗原或抗體接近試劑測定下限的質(zhì)控品，并與臨床標(biāo)本的測定同時進行，以判斷檢測的有效性。檢測結(jié)果為陽性，則質(zhì)控品在控。適用于定性和半定量免疫檢驗，如沉淀試驗、凝集試驗、熒光免疫試驗、固相膜免疫分析技術(shù)或非定量的酶免疫試驗和化學(xué)發(fā)光免疫試驗等。抗核抗體熒光免疫試驗室內(nèi)質(zhì)控品1:1001:1601:3201:6401:1000弱陽性樣本弱陽性樣本較強陽性樣本較強陽性樣本室內(nèi)質(zhì)控品的基本條件基質(zhì)與待測標(biāo)本

16、一致室內(nèi)質(zhì)控品要求其所含待測物的濃度接近試驗或臨床決定性水平良好的穩(wěn)定性靶值或預(yù)期結(jié)果已定無已知的傳染危險性單批可大量獲得價廉失控后的常見原因測定操作中的隨機誤差儀器的問題試劑的問題室內(nèi)質(zhì)控品失效室內(nèi)質(zhì)控的局限性可確保實驗室室內(nèi)測定質(zhì)量的一致性，確保臨床測定過程及結(jié)果在精密度方面達到預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)。但不能保證在單個的測定樣本中不出現(xiàn)誤差。比如標(biāo)本吸取錯誤、結(jié)果記錄錯誤等。室間質(zhì)量評價為客觀地比較某一實驗室的測定結(jié)果與靶值的差異，由外單位機構(gòu)，采取一定的方法，連續(xù)、客觀地評價實驗室的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)誤差并校正結(jié)果，使各實驗室之間的結(jié)果具有可比性。是對實驗室操作和實驗方法的回顧性評價，而不是用來決定實時的測

17、定結(jié)果的可接受性。通過參與EQA，實驗室可對自己的實驗操作進行糾正，從而起到自我教育的作用。第五節(jié)第五節(jié) 分析后的質(zhì)量保證分析后的質(zhì)量保證重點提示重點提示結(jié)果的報告與解釋檢驗后標(biāo)本的保存與處理咨詢服務(wù)結(jié)果的報告基本信息患者的姓名、性別、年齡； 送檢科室或單位名稱；標(biāo)本采集時間和實驗室接收標(biāo)本時間；標(biāo)本的編號或條碼；檢測項目；標(biāo)本類型；檢測方法和主要設(shè)備等。結(jié)果的報告篩查試驗或診斷試驗的陽性結(jié)果應(yīng)當(dāng)報告為“反應(yīng)性”或“陽性反應(yīng)”。如未發(fā)生抗原抗體的反應(yīng)，則報告為“陰性”。確認(rèn)試驗的結(jié)果可直接報告“陽性”或“陰性”。結(jié)果的報告將檢測結(jié)果對應(yīng)檢測項目的名稱，列在報告單上。定量檢測應(yīng)注明項目的參考區(qū)間

18、或檢測方法的線性或測定范圍；定性檢測篩查試驗或診斷試驗報告 “反應(yīng)性”（陽性反應(yīng)）或“陰性”，確認(rèn)試驗的結(jié)果報告“陽性”或“陰性”，并提供報告結(jié)果的測定范圍。檢測人、審核人、復(fù)核人簽字，結(jié)果報告日期和備注。結(jié)果的解釋需清楚說明結(jié)果對疾病的診斷意義，即指出該檢測結(jié)果提示疾病的可能性。說明在何種情況下有可能為假陽性或假陰性結(jié)果。排除假陽性或假陰性結(jié)果的方法（進一步檢測或追蹤）。如果已在進行進一步的檢測，應(yīng)在報告中予以說明。臨床解釋的責(zé)任屬于臨床醫(yī)生，臨床醫(yī)生通過綜合患者臨床信息解釋結(jié)果和其他檢測結(jié)果來對特定的免疫測定結(jié)果作出最終解釋。檢驗后標(biāo)本的保存與處理檢驗后標(biāo)本的保存檢驗后標(biāo)本的檢索檢驗后標(biāo)本的處理咨詢服務(wù)咨詢服務(wù)的提供與臨床的溝通本章小結(jié)由于免疫學(xué)檢驗的原理主要是抗原抗體的相互作用，陽性反應(yīng)判斷值的設(shè)定決定了免疫測定存在假陽性和假陰性的可能。對于臨床而言，免疫測定方法的臨床預(yù)測值是最為重要的參數(shù)。根據(jù)陽性預(yù)測值的高低，可將免疫測定方法分為篩查試驗、診斷試驗和確認(rèn)試驗三種。臨床上絕大部分開展的免疫學(xué)檢驗，都是僅能作為篩查試驗或診斷試驗，陽性結(jié)果僅代表在檢測中發(fā)生了抗原抗體的陽性反應(yīng)，但陽性反應(yīng)可能是真陽性，也可能是假陽性，也就是說存