不同地理位置的微生物差別

1、取自中國不同地區(qū)活性污泥樣本中細菌群落的 焦磷酸測序分析 蔣一凡&劉苗苗&熊蓓蓓材料：活性污泥 來源:8城市，10市政WWTPs，曝氣池東部 西北 北部：SJZ（工廢） 這些WWTPs主要處理生活污水，大多數(shù)WWTPs采用（A/O，A/A/O，OD） 樣本處理：無菌塑料瓶（11） -80 一個晚上 干冰運輸 實驗室WX（CAST）MASSZ（工廢，SBR）HF（工廢）NJLZ（工廢，CASS）ULMQ（AB）研究目標 估計來自不同地理位置樣本的細菌群落組成的相似性和差異性 獲得活性污泥樣本中微生物相互作用的更好理解研究意義研究這些復雜又多樣化群體物種（共生模式）之間的相互作用能

2、夠很好地理解在污水處理過程中這些細菌群體的作用 作用：細菌在活性污泥中起主導因素而且在去除有機污染物，毒素和營養(yǎng)素起到重要作用對活性污泥中細菌組成的更好理解可以提供有用的信息去改善污水處理效率以及闡明微生物對活性污泥的形成，發(fā)展和功能的影響研究方法的確定 第二代高通量測序：提供足夠的序列長度來覆蓋復雜的微生物群體 網(wǎng)路分析：分類關(guān)系是活性污泥中細菌群落形成的主導因素研究方法及過程 DNA提取 PCR擴增（聚合酶鏈式反應(yīng)） 焦磷酸測序 序列分析 數(shù)據(jù)分析 網(wǎng)路分析各研究方法的目的 高通量測序：活性污泥樣本中細菌群落的組成 NMDS和ANOSIM：活性污泥中細菌群落構(gòu)成的顯著的地理性差異 16s

3、rRNA基因檢測技術(shù)：細菌多樣性 網(wǎng)路分析：10個污水廠中細菌的共生模式DNA提取50ml樣本，4000rpm（4）離心15min將懸浮液倒出，每個樣本的三倍顆粒量（大約0.3g）用來DNA提取0.8%瓊脂糖凝膠電泳：原DNA分析土壤微生物DNA強力提取試劑盒(人工指令):相同樣本中抽取的三份DNA進行結(jié)合和提純生物光度計：分析提取DNA的質(zhì)量PCR擴增細菌的16S rRNA基因擴增： 引物533R（5-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3） 引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3）533R：Roche 454“A”焦磷酸序列適配物，唯一的10 個堿基對序列 27

4、F：Roche 454“B”反應(yīng)體系（50 l）：10 l 5 Prime STAR Buffer (Mg2+Plus），0.2 mM dNTP，0.4 M的每個正向和反向引物，2.0 U TaKaRa Prime STAR HS DNA 聚合酶 ，100200 ng DNA模板循環(huán)條件：95C初始變性5min，94C 進行24個變性周期30s，55C退火30s，72C擴展30s，72C 擴展5minPCR產(chǎn)物：2%瓊脂糖凝膠檢查，DNA凝膠提取試劑盒提純焦磷酸測序 擴增子庫：三個獨立PCR產(chǎn)物的混合物 目的：使?jié)撛诘膱鯬CR誤差最小化 不同污泥樣本的擴增子混合 目的：實現(xiàn)同等質(zhì)量濃度 合并后

5、的樣本被送到上海的Majorbio公司進行基于Roche 454 FLX鈦平臺的焦磷酸測序 獲得的原始數(shù)據(jù)已經(jīng)存入NCBI short-reads歸檔數(shù)據(jù)庫(加入數(shù)字：SRX450095）序列分析獲得的序列數(shù)據(jù)使用Mothur1.30然后454SOP進行處理在進一步分析中排除：不包含精確匹配到引物的序列，含有任何模棱兩可的讀數(shù)和/或者擁有平均質(zhì)量分數(shù)少于27且少于200個核苷酸(除了引物/堿基對序列區(qū)域)的序列 how? 兩兩母體的距離用Mothur計算，在3%的距離使用更進一步的臨界方法，獲得的數(shù)據(jù)集中到OTUs序列被隨意二次抽樣,所獲得的序列的最小值 進行alpha和beta多樣性分析數(shù)據(jù)

6、分析二次抽樣的序列被用來分析alpha的多樣性，包括使用Mothur中的summary.single指令進行Chao1和Goods的覆蓋率估計NMDS分析使用R vegan（版本：2.15.0）來研究細菌群落組成的相似性。0.2的應(yīng)力水平對于NMDS情景是可以被接受的。相似性分析被用來檢測不同群落的細菌群落組成的差異性（如西北和東部群落），相似度分析用來識別OTUs，OTUs指定西北或者東部樣本。Mantel測試采用在R 2.15.0 環(huán)境下的vegan并通過999個排列數(shù)字實施：研究細菌群落組成的差異性和樣本所處地理距離之間存在的聯(lián)系Heat map通過R gplots執(zhí)行：比較在每個樣本中

7、最充沛的屬的細菌群落網(wǎng)路分析建立一個相關(guān)母體：通過計算細菌屬間所有可能的成對秩的等級相關(guān)來設(shè)想網(wǎng)路界面的相關(guān)性只考慮那些發(fā)生在所有樣本中關(guān)系比例總共超過1%的至少3個樣本的屬充分同時發(fā)生的事件：秩的相關(guān)系數(shù)不僅0.6（或者-0.6），而且統(tǒng)計上顯著的（P0.05）穩(wěn)定的相關(guān)性。統(tǒng)計分析使用R Hmisc。在描述從充分屬的成對比較中識別的穩(wěn)定相關(guān)性的相關(guān)網(wǎng)路中，每個節(jié)點表示一種屬，每一條線表示一種強烈和顯著的相關(guān)性在觀察網(wǎng)路之后使用Gephi進行計算圖表分析11、各樣品的覆蓋率為90以上，表明足夠測序深度圖表分析2 每個活性污泥的細菌群落分配在分類單元為門的分類結(jié)果圖表分析3每個樣品中的前10豐

8、富屬被選定（所有的10個樣品共37個屬），與其他樣品中它們的豐富度使用熱圖分析進行比較。有三個屬至少在7個樣品中都是大量的（1%），包括Haliscomenobacter、暖繩菌屬、TM7_genus_IS，在37個豐富屬中，發(fā)現(xiàn)了如Iamia、Ilumatobacter、分枝桿菌等好氧菌。同時，大量的厭氧菌諸如Ignavibacterium，Anaerolinea和Caldilinea也被發(fā)現(xiàn)。一些屬，包括GP4、GP6和OD1_genus_IS，沒有得到很好的觀察，并且不能明確地分為需氧或厭氧細菌。分析圖表4細菌群落組合物與采樣的地理位置密切相關(guān)ANOSIM：確定在不同的地理位置收集的樣品

9、細菌群落組成是否存在顯著的統(tǒng)計學差異。如東部和西北部（R =1，P 0.40.4說明網(wǎng)路具有模塊化說明網(wǎng)路具有模塊化顯著和穩(wěn)定的內(nèi)部正相關(guān)和門的顯著和穩(wěn)定的內(nèi)部正相關(guān)和門的相互聯(lián)系。酸桿菌門的成員（屬相互聯(lián)系。酸桿菌門的成員（屬Gp 3Gp 3，Gp4Gp4，Gp6Gp6，Gp7,Gp16Gp7,Gp16，Gp Gp 1717）, ,共現(xiàn)頻率為共現(xiàn)頻率為2.942.94，比隨機聯(lián)，比隨機聯(lián)系下預(yù)測的更高系下預(yù)測的更高, ,正如從觀察到的正如從觀察到的共生事件和理論隨意性共生事件共生事件和理論隨意性共生事件計算的一樣。正相關(guān)由圖計算的一樣。正相關(guān)由圖4a4a中橙中橙色厚邊緣直觀地顯示。此外色厚邊

10、緣直觀地顯示。此外, ,對于對于門的相關(guān)性，門的相關(guān)性，-變形菌的成員往變形菌的成員往往與放線菌和壁厚菌門的成員共往與放線菌和壁厚菌門的成員共現(xiàn)。圖現(xiàn)。圖4 b4 b演示了一些細菌屬之間演示了一些細菌屬之間的負相關(guān)。一個獨立門的負相關(guān)的負相關(guān)。一個獨立門的負相關(guān)在桿菌門的在桿菌門的HaliscomenobacterHaliscomenobacter和和FerruginibacterFerruginibacter之中被發(fā)現(xiàn)之中被發(fā)現(xiàn)結(jié)論 從中國西北和東部收集的活性污泥樣本中的細菌群落組成顯然不同 核心屬與活性污泥的地理位置及處理方法無關(guān) 網(wǎng)路分析：從61細菌屬鑒定，總共165對顯著和穩(wěn)定的相關(guān)性（正相關(guān)和負相關(guān)），2個網(wǎng)路化模塊具有模塊化結(jié)構(gòu)無錫蘭州馬鞍山蘇州石家莊烏魯木齊合肥南京*process測序從反向引物（533R）開始，原序列的反向互補序列被轉(zhuǎn)換。剩下的序列用Mothur采用NAST（接近調(diào)整空間終端）算法與細菌SILVA 16S rRNA 基因模型進行比對，因為這個模型已經(jīng)提供變化區(qū)域的質(zhì)量比對。Mothur 中“pre.cluster”指令被用來消除那些有可能由于焦磷酸測序引起誤差的序列。PCR嵌合體使用chimera.uchime指令實現(xiàn)用默認參數(shù)的Mothur軟件進行檢查和消除。剩下的序列被送到網(wǎng)上工