SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量

1、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量測(cè)定蛋白質(zhì)分子量 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?學(xué)習(xí)并掌握SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的技術(shù)。 實(shí)驗(yàn)原理 1. 在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），使蛋白樣品與SDS結(jié)合形成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，由于復(fù)合物分子量的不同，在電泳中反應(yīng)出不同的遷移率。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品在該系統(tǒng)電泳中所作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，推算出被測(cè)蛋白樣品分子量的近似值。實(shí)驗(yàn)原理 2. 在蛋白質(zhì)混合樣品中各蛋白質(zhì)組分的分子大小和形狀以及所帶電荷多少等因素所造成的電泳遷移率有差別。在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），形成蛋白質(zhì)SDS

2、復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合了大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)，形成了僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間的天然的電荷差異，此時(shí)，蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小，而其它因素對(duì)電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計(jì)。 實(shí)驗(yàn)原理3. 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)值呈直線關(guān)系，符合下列方程： 10Mr = bmR + K 式中：Mr為蛋白質(zhì)分子量，mR為相對(duì)遷移率，b為斜率，K為截距。在條件一定時(shí)，b 和K均為常數(shù)。 若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知蛋白質(zhì)在

3、相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。 實(shí)驗(yàn)步驟1.裝板：將垂直板型電泳裝置內(nèi)的板狀凝膠模子取出，將玻璃片洗凈、涼干、嵌入凹槽中，形成一個(gè)“夾心”凝膠腔，把裝好的凝膠腔置于仰放的電極上槽。將電泳槽、凝膠模子串成一體的垂直板型電泳裝置，垂直放置在水平臺(tái)面上，灌注膠液。 實(shí)驗(yàn)步驟T=12% 20ml T=3% 5ml ml 貯液 8 ml 貯液 0.6 ml 分離膠緩沖液 pH8.9 5 ml 濃縮膠緩沖液 pH6.3 0.62 ml 蒸餾水 5.33 ml 蒸餾水 2.76 ml 10SDS 0.2 ml 10SDS 0.05 ml 1%TEMED 1.33 ml 1

4、%TEMED 1 ml 10%AP 0.2 ml 10%AP 0.05 ml 2. 配液：按照下表所列的試劑用量配制合適的凝膠 實(shí)驗(yàn)步驟3.凝膠液的灌注和聚合：用移液管將所配制的分離膠緩沖液沿著凝膠腔的長(zhǎng)玻璃板的內(nèi)面緩緩注入，然后加滿蒸餾水。一小時(shí)后，待分離膠凝固，倒出蒸餾水，用濾紙吸干，加濃縮膠，將梳子插入膠液頂部。 實(shí)驗(yàn)步驟4.加樣：用微量注射器依次在各個(gè)樣品槽加樣，加樣 量 如 下 N 5 l P20lJ5lX5l標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)全部加入實(shí)驗(yàn)步驟5.電泳：上槽接負(fù)極，下槽接正極，打開(kāi)直流電源，剛開(kāi)始時(shí)，電流控制在12A，樣品進(jìn)膠后，緩慢升高電流至4050A。保持電流強(qiáng)度不變。待指示劑染料靠遷移至下沿11.5cm處停止電泳，需23h。實(shí)驗(yàn)步驟6.剝膠和固定：電泳結(jié)束后，取下凝膠膜，卸下凝膠膜上的橡膠框，用鑷子將短玻璃撬開(kāi)后取出凝膠板。放入溴酚藍(lán)固定液中，固定2h以上或過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)步驟7.染色：棄去固定液，加入染色液。染色4h以上或過(guò)夜。8.脫色：染色完畢，傾出染色液，換23次脫色液，脫色一晝夜。9.觀察測(cè)量：用直尺分別量取各條帶與凝膠頂端的距離 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.相對(duì)遷移率mR =樣品遷移距離（