掃描電子顯微鏡的設(shè)計(jì)思想和工作原理

1、掃描電鏡主要觀察表面形貌（二次電子像），還可以得到反映成份信息的背散射電子像。掃描電鏡還可以接一些附件，如EDS進(jìn)行元素成份分析；EBDS進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)分析等等。透射電子顯微鏡分辨率比掃描電鏡高（如掃描電鏡最高1nm，透射電鏡0.2nm甚至更高），主要可以進(jìn)行內(nèi)部形貌觀察，晶體結(jié)構(gòu)分析，特別是微區(qū)（微米、納米）的像觀察和結(jié)構(gòu)分析，可以得到原子尺度的像。如配備一定附件，如EDS進(jìn)行微區(qū)元素成份分析，STEM可以得到更容易解釋的像，EELS可以進(jìn)行化學(xué)狀態(tài)分析等等。掃描電子顯微鏡的設(shè)計(jì)思想和工作原理，早在1935年便已被提出來了。1942年，英國(guó)首先制成一臺(tái)實(shí)驗(yàn)室用的掃描電鏡，但由于成像的分辨率很差

2、，照相時(shí)間太長(zhǎng)，所以實(shí)用價(jià)值不大。經(jīng)過各國(guó)科學(xué)工作者的努力，尤其是隨著電子工業(yè)技術(shù)水平的不斷發(fā)展，到 1956年開始生產(chǎn)商品掃描電鏡。近數(shù)十年來，掃描電鏡已廣泛地應(yīng)用在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、冶金學(xué)等學(xué)科的領(lǐng)域中，促進(jìn)了各有關(guān)學(xué)科的發(fā)展。 一掃描電鏡的特點(diǎn) 和光學(xué)顯微鏡及透射電鏡相比，掃描電鏡具有以下特點(diǎn)： (一) 能夠直接觀察樣品表面的結(jié)構(gòu)，樣品的尺寸可大至120mm×80mm×50mm。 (二) 樣品制備過程簡(jiǎn)單，不用切成薄片。 (三) 樣品可以在樣品室中作三度空間的平移和旋轉(zhuǎn)，因此，可以從各種角度對(duì)樣品進(jìn)行觀察。 (四) 景深大，圖象富有立體感。掃描電鏡的景深較光學(xué)顯微鏡大幾百

3、倍，比透射電鏡大幾十倍。 (五) 圖象的放大范圍廣，分辨率也比較高?？煞糯笫畮妆兜綆资f倍，它基本上包括了從放大鏡、光學(xué)顯微鏡直到透射電鏡的放大范圍。分辨率介于光學(xué)顯微鏡與透射電鏡之間，可達(dá)3nm。 (六) 電子束對(duì)樣品的損傷與污染程度較小。 (七) 在觀察形貌的同時(shí)，還可利用從樣品發(fā)出的其他信號(hào)作微區(qū)成分分析。 二掃描電鏡的結(jié)構(gòu)和工作原理 (一) 結(jié)構(gòu) 1鏡筒 鏡筒包括電子槍、聚光鏡、物鏡及掃描系統(tǒng)。其作用是產(chǎn)生很細(xì)的電子束(直徑約幾個(gè)nm)，并且使該電子束在樣品表面掃描，同時(shí)激發(fā)出各種信號(hào)。 2電子信號(hào)的收集與處理系統(tǒng) 在樣品室中，掃描電子束與樣品發(fā)生相互作用后產(chǎn)生多種信號(hào)，其中包括二次電

4、子、背散射電子、X射線、吸收電子、俄歇(Auger)電子等。在上述信號(hào)中，最主要的是二次電子，它是被入射電子所激發(fā)出來的樣品原子中的外層電子，產(chǎn)生于樣品表面以下幾nm至 幾十nm的區(qū)域，其產(chǎn)生率主要取決于樣品的形貌和成分。通常所說的掃描電鏡像指的就是二次電子像，它是研究樣品表面形貌的最有用的電子信號(hào)。檢測(cè)二次電子的檢測(cè)器(圖15(2)的探頭是一個(gè)閃爍體，當(dāng)電子打到閃爍體上時(shí)，1就在其中產(chǎn)生光，這種光被光導(dǎo)管傳送到光電倍增管，光信號(hào)即被轉(zhuǎn)變成電流信號(hào)，再經(jīng)前置放大及視頻放大，電流信號(hào)轉(zhuǎn)變成電壓信號(hào)，最后被送到顯像管的柵極。 3電子信號(hào)的顯示與記錄系統(tǒng) 掃描電鏡的圖象顯示在陰極射線管(顯像管)上，

5、并由照相機(jī)拍照記錄。顯像管有兩個(gè)，一個(gè)用來觀察，分辨率較低，是長(zhǎng)余輝的管子；另一個(gè)用來照相記錄，分辨率較高，是短余輝的管子。 4真空系統(tǒng)及電源系統(tǒng) 掃描電鏡的真空系統(tǒng)由機(jī)械泵與油擴(kuò)散泵組成，其作用是使鏡筒內(nèi)達(dá)到 10(410(5托的真空度。電源系統(tǒng)供給各部件所需的特定的電源。 (二) 工作原理 從電子槍陰極發(fā)出的直徑20(m30(m的電子束，受到陰陽極之間加速電壓的作用，射向鏡筒，經(jīng)過聚光鏡及物鏡的會(huì)聚作用，縮小成直徑約幾毫微米的電子探針。在物鏡上部的掃描線圈的作用下，電子探針在樣品表面作光柵狀掃描并且激發(fā)出多種電子信號(hào)。這些電子信號(hào)被相應(yīng)的檢測(cè)器檢測(cè)，經(jīng)過放大、轉(zhuǎn)換，變成電壓信號(hào)，最后被送到

6、顯像管的柵極上并且調(diào)制顯像管的亮度。顯像管中的電子束在熒光屏上也作光柵狀掃描，并且這種掃描運(yùn)動(dòng)與樣品表面的電子束的掃描運(yùn)動(dòng)嚴(yán)格同步，這樣即獲得襯度與所接收信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)應(yīng)的掃描電子像，這種圖象反映了樣品表面的形貌特征。第二節(jié) 掃描電鏡生物樣品制備技術(shù)大多數(shù)生物樣品都含有水分，而且比較柔軟，因此，在進(jìn)行掃描電鏡觀察前，要對(duì)樣品作相應(yīng)的處理。掃描電鏡樣品制備的主要要求是：盡可能使樣品的表面結(jié)構(gòu)保存好，沒 有變形和污染，樣品干燥并且有良好導(dǎo)電性能。 一樣品的初步處理 (一) 取材 取材的基本要求和透射電鏡樣品制備相同，可參考第十四章超薄切片技術(shù)中所提的要求。但是，對(duì)掃描電鏡來說，樣品可以稍大些，面積可

7、達(dá)8mm×8mm，厚度可達(dá)5mm。對(duì)于易卷曲的樣品如血管、胃腸道粘膜等，可固定在濾紙或卡片紙上，以充分暴露待觀察的組 織表面。 (二) 樣品的清洗 用掃描電鏡觀察的部位常常是樣品的表面，即組織的游離面。由于樣品取自活體組織，其表面常有血液、組織液或粘液附著，這會(huì)遮蓋樣品的表面結(jié)構(gòu)，影響觀察。因此，在樣品固定之前，要將這些附著物清洗干凈。清洗的方法有以下幾種： 1用等滲的生理鹽水或緩沖液清洗； 2用5%的蘇打水清洗； 3用超聲震蕩或酶消化的方法進(jìn)行處理。例如清洗腸粘膜表面的粘液，可用下面的方法： 清洗液配方：透明質(zhì)酸酶 300 (g糜蛋白酶 10 mg生理鹽水 100 ml清洗液的pH

8、為5.56。清洗的方法是將樣品浸泡在配好的清洗液中，邊浸泡邊震蕩30分鐘，最后用雙蒸水洗3次。無論用哪種清洗方法，注意在清洗時(shí)不要損傷樣品。 (三) 固定 固定所用的試劑和透射電鏡樣品制備相同，常用戊二醛及鋨酸雙固定。由于樣品體積較大，固定時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)。也可用快速冷凍固定。 (四) 脫水 樣品經(jīng)漂洗后用逐級(jí)增高濃度的酒精或丙酮脫水，然后進(jìn)入中間液，一般用醋酸異戊酯作中間液。 二樣品的干燥 掃描電鏡觀察樣品要求在高真空中進(jìn)行。無論是水或脫水溶液，在高真空中都會(huì)產(chǎn)生劇烈地汽化，不僅影響真空度、污染樣品，還會(huì)破壞樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu)。因此，樣品在用電鏡觀察之前必須進(jìn)行干燥。干燥的方法有以下幾種： (一)

9、 空氣干燥法 空氣干燥法又稱自然干燥法，就是將經(jīng)過脫水的樣品，讓其暴露在空氣中使脫水劑逐漸揮發(fā)干燥。這種方法的最大優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行和節(jié)省時(shí)間；它的主要缺點(diǎn)是在干燥過程中，組織會(huì)由于脫水劑揮發(fā)時(shí)表面張力的作用而產(chǎn)生收縮變形。因此，該方法一般只適用 于表面較為堅(jiān)硬的樣品。 (二) 臨界點(diǎn)干燥法 臨界點(diǎn)干燥法是利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)時(shí)，其表面張力等于零的特性，使樣品的液體完全汽化，并以氣體方式排掉，來達(dá)到完全干燥的目的。這樣就可以避免表面張力的影響，較好地保存樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu)。此法操作較為方便，所用的時(shí)間也不算長(zhǎng)，一般約23小 時(shí)即可完成，所以是最為常用的干燥方法。但用此法，需要特殊儀器設(shè)備。 臨界點(diǎn)干燥是

10、在臨界點(diǎn)干燥儀中進(jìn)行的，操作步驟如下： 1固定、脫水：按常規(guī)方法進(jìn)行。如樣品是用乙醇脫水的，在脫水至100%后，要用純丙酮置換1520分鐘。 2轉(zhuǎn)入中間液：由純丙酮轉(zhuǎn)入中間液醋酸異戊酯中，時(shí)間約1530分鐘。 3移至樣品室：將樣品從醋酸異戊酯中取出，放入樣品盒，然后移至臨界點(diǎn)干燥儀的樣品室內(nèi)，蓋上蓋并擰緊以防漏氣。 4用液體二氧化碳置換醋酸異戊酯：在達(dá)到臨界狀態(tài)(31(C , 72.8大氣壓)后，將溫度再升高10(C，使液體二氧化碳?xì)饣?，然后打開放氣閥門，逐漸排出氣體，樣品即完全干燥。 (三) 冷凍干燥法 冷凍干燥法是將經(jīng)過冷凍的樣品置于高真空中，通過升華除去樣品中的水分或脫水劑的過程。冷凍干

11、燥的基礎(chǔ)是冰從樣品中升華，即水分從固態(tài)直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，不經(jīng)過中間的液態(tài)，不存在氣相和液相之間的表面張力對(duì)樣品的作用，從而減輕在干燥過程中對(duì)樣 品的損傷。冷凍干燥法有兩種，即含水樣品直接冷凍干燥和樣品脫水后冷凍干燥。 1含水樣品直接冷凍干燥法 1.1 取材固定：按常規(guī)方法進(jìn)行。 1.2 置于冷凍保護(hù)劑中：將樣品置于冷凍保護(hù)劑中浸泡數(shù)小時(shí)。常用的冷凍保護(hù)劑為10%20%二甲基亞砜水溶液，或15%40%甘油水溶液。 1.3 驟冷：將經(jīng)過保護(hù)劑處理的樣品迅速投入用液氮預(yù)冷至(150(C的氟利昂冷凍劑中，使樣品中的水分很快凍結(jié)。 1.4 干燥：將已凍結(jié)的樣品移到冷凍干燥器內(nèi)已預(yù)冷的樣品臺(tái)上，抽真空，經(jīng)幾

12、小時(shí)或數(shù)天后，樣品即達(dá)到干燥。 本方法不需要脫水，避免了有機(jī)溶劑對(duì)樣品成分的抽提作用，不會(huì)使樣品收縮，也是較早使用的方法。但是，由于花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，消耗液氮多，容易產(chǎn)生冰晶損傷，因此未被廣泛應(yīng)用。 2樣品脫水后冷凍干燥 樣品用乙醇或丙酮脫水后過渡到某些易揮發(fā)的有機(jī)溶劑中，然后連同這些溶劑一起冷凍并在真空中升華而達(dá)到干燥。和前一種方法比較，本方法的優(yōu)點(diǎn)是不會(huì)產(chǎn)生冰晶損傷， 且干燥時(shí)間短。不足之處是有機(jī)溶劑對(duì)樣品成分有抽提作用，造成部分內(nèi)含物丟失。乙腈(acetonitrile)真空干燥法：這是一種利用乙腈在急速蒸發(fā)時(shí)會(huì)冷卻固化的性質(zhì)將樣品干燥的方法。其操作步驟如下： (1). 固定、水洗：按常規(guī)方法

13、進(jìn)行。 (2). 乙腈置換：使用50%?70%?80%?90%的乙腈水溶液置換，最后用100%乙腈代替，每步驟1520分鐘。 (3). 干燥：至純乙腈時(shí)，放入真空鍍膜臺(tái)抽真空，乙腈和樣品在真空中很快致冷而被凍結(jié)(凍結(jié)的溫度為(45(C)，變成冰狀固體。然后繼續(xù)抽真空，使凍結(jié)的乙腈升華，約需30分鐘，樣品即達(dá)干燥。 樣品干燥后要粘在樣品臺(tái)上。對(duì)于不鍍膜而直接觀察的樣品，必須用導(dǎo)電膠來粘固；對(duì)于要鍍膜的樣品，則可以用膠水或萬能膠來代替，微細(xì)的樣品如粉末、纖維等也可用雙面膠紙來粘貼。 三樣品的導(dǎo)電處理 生物樣品經(jīng)過脫水、干燥處理后，其表面不帶電，導(dǎo)電性能也差。用掃描電鏡觀察時(shí)，當(dāng)入射電子束打到樣品上

14、，會(huì)在樣品表面產(chǎn)生電荷的積累，形成充電和放電效應(yīng)，影響對(duì)圖象的觀察和拍照記錄。因此在觀察之前要進(jìn)行導(dǎo)電處理，使樣品表面導(dǎo)電。常用的導(dǎo)電方法有以下幾種： (一) 金屬鍍膜法 金屬鍍膜法是采用特殊裝置將電阻率小的金屬，如金、鉑、鈀等蒸發(fā)后覆蓋在樣品表面的方法。樣品鍍以金屬膜后，不僅可以防止充電、放電效應(yīng)，還可以減少電子束對(duì)樣品的損傷作用，增加二次電子的產(chǎn)生率，獲得良好的圖象。 1真空鍍膜法 真空鍍膜法是利用真空 膜儀進(jìn)行的。其原理是在高真空狀態(tài)下把所要噴鍍的金屬加熱，當(dāng)加熱到熔點(diǎn)以上時(shí)，會(huì)蒸發(fā)成極細(xì)小的顆粒噴射到樣品上，在樣品表面形成一層金屬膜，使樣品導(dǎo)電。噴鍍用的金屬材料應(yīng)選擇熔點(diǎn)低、化學(xué)性能穩(wěn)

15、定、在高溫下和鎢不起作用以及有高的二次電子產(chǎn)生率、膜本身沒有結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)在一般選用金或金和碳。為了獲得細(xì)的顆粒，有用鉑或用金鈀、鉑鈀合金的。金屬膜的厚度一般為10nm20nm。真空鍍膜法所形成的膜，金屬顆粒較粗，膜不夠均勻，操作較復(fù)雜并且費(fèi)時(shí)，目前已經(jīng)較少使用。 2離子濺射鍍膜法 在低真空(0.10.01乇)狀態(tài)下，在陽極與陰極兩個(gè)電極之間加上幾百至上千伏的直流電壓時(shí)，電極之間會(huì)產(chǎn)生輝光放電。在放電的過程中，氣體分子被電離成帶正電的陽離子和帶負(fù)電的電子，并在電場(chǎng)的作用下，陽離子被加速跑向陰極，而電子被加速跑向陽極 。如果陰極用金屬作為電極(常稱靶極)，那么在陽離子沖擊其表面時(shí)，就會(huì)將其表面的金屬粒

16、子打出，這種現(xiàn)象稱為濺射。此時(shí)被濺射的金屬粒子是中性，即不受電場(chǎng)的作用，而靠重力作用下落。如果將樣品置于下面，被濺射的金屬粒子就會(huì)落到樣品表面，形 成一層金屬膜，用這種方法給樣品表面鍍膜，稱為離子濺射鍍膜法，圖15(3顯示該法的原理。 圖15(3 離子濺射鍍膜法原理圖 和真空鍍膜法比較，離子濺射鍍膜法具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)由于從陰極上飛濺出來的金屬粒子的方向是不一致的，因而金屬粒子能夠進(jìn)入到樣品表面的縫隙和凹陷處，使樣品表面均勻地鍍上一層金屬膜，對(duì)于表面凹凸不平的樣品，也能形成很好的金屬膜，且顆粒較 細(xì)。(2)受輻射熱影響較小，對(duì)樣品的損傷小。(3)消耗金屬少。(4)所需真空度低，節(jié)省時(shí)間。 (

17、二) 組織導(dǎo)電法 用金屬鍍膜法使樣品表面導(dǎo)電，需要特殊的設(shè)備，操作比較復(fù)雜，同時(shí)對(duì)樣品有一定程度的損傷。為了克服這些不足，有人采用組織導(dǎo)電法(又稱導(dǎo)電染色法)，即利用某些金屬 溶液對(duì)生物樣品中的蛋白質(zhì)?脂類和醣類等成分的結(jié)合作用，使樣品表面離子化或產(chǎn)生導(dǎo)電性能好的金屬鹽類化合物，從而提高樣品耐受電子束轟擊的能力和導(dǎo)電率。 此法的基本處理過程是將經(jīng)過固定、清洗的樣品，用特殊的試劑處理后即可觀察。由于不經(jīng)過金屬鍍膜，所以不僅能節(jié)省時(shí)間，而且可以提高分辨率，還具有堅(jiān)韌組織，加強(qiáng)固定效果的作用。 組織導(dǎo)電法主要有碘化鉀導(dǎo)電染色法、碘化鉀-醋酸鉛導(dǎo)電法、丹寧酸鋨酸導(dǎo)電法等。比較常用的是丹寧酸鋨酸導(dǎo)電法，

18、其具體操作方法如下： (1)樣品處理：按常規(guī)方法取材、清洗及用戊二醛固定。 (2)導(dǎo)電染色：將樣品放入2%4%丹寧酸溶液中浸泡。如果觀察表面結(jié)構(gòu)，浸泡時(shí)間為30分鐘；如果觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)，浸泡時(shí)間為8小時(shí)，即可過夜。在浸泡過程中，可更換一次溶液。 (3)清洗及再固定：用磷酸緩沖液充分清洗，然后放入1%鋨酸中固定24小時(shí)，再用磷酸緩沖液清洗。 (4)脫水和干燥：按常規(guī)方法。 (5)掃描電鏡觀察。 四幾種特殊的樣品制備技術(shù) (一) 細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)冷凍割斷法 1972年，日本學(xué)者田中敬一采用冷凍樹脂割斷法將細(xì)胞打開，用掃描電鏡觀察細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。后來他又以二甲基亞砜代替樹脂進(jìn)行冷凍割斷取得成功，該方法簡(jiǎn)便，結(jié)構(gòu)清晰，已得到廣泛應(yīng)用。其操作方法如下： 1取材和固定：為了使細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰