懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)講義

1、懸浮細(xì)胞傳代及細(xì)胞計(jì)數(shù)一、細(xì)胞傳代實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握懸浮細(xì)胞傳代技術(shù)。進(jìn)一步掌握細(xì)胞培養(yǎng)的操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理:培養(yǎng)細(xì)胞生長一定時(shí)間后,需分離再培養(yǎng),否則細(xì)胞因生存空間不夠,細(xì)胞密度過大,致營養(yǎng)不足而引起細(xì)胞衰老、停止生長甚至死亡。為了維持細(xì)胞的存活和生長,必須進(jìn)行再培養(yǎng),即將原培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞分離、稀釋、接種到新培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用品:(一儀器凈化工作臺、離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱(4、-20、-70、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱;(二玻璃器皿吸管(彎頭、直頭、培養(yǎng)瓶、廢液缸、(三塑料器皿吸頭、槍頭、膠塞、移液管、15ml離心管、離心管架(四其他物品微量加樣槍、計(jì)數(shù)板、記號筆、移液槍(五試劑1640培

2、養(yǎng)液、PBS操作步驟:1.準(zhǔn)備:打開培養(yǎng)液,PBS;取出離心管,擰開管蓋,管蓋倒放。從吸管筒中依次取出吸管,裝上吸頭,插入離心管備用。2.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞,放在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)、密度。3.首先觀察培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)液量。用吸管分別吸出兩個(gè)孔中的細(xì)胞連同培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)入離心管中。再另取一只吸管吸取PBS,放入培養(yǎng)板孔中,輕輕吹打孔壁,吸出轉(zhuǎn)入離心管。4.離心,設(shè)置離心機(jī)1000轉(zhuǎn)/分,4-5分鐘。5.取出離心管,輕輕吸出上清,倒入廢液缸。吸取培養(yǎng)液約7ML放入離心管,輕輕吹打細(xì)胞,使之均勻懸浮。6.吸取1ML細(xì)胞懸液1ML轉(zhuǎn)入EP管中,備計(jì)數(shù)用。7.其余的細(xì)胞分別放入六個(gè)孔中,每孔約1ML。8.

3、吸取培養(yǎng)液加入板孔中至1/3孔容量。9.鏡下觀察細(xì)胞是否分布均勻,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。二、細(xì)胞計(jì)數(shù)及生長曲線測定培養(yǎng)細(xì)胞生長過程:潛伏期指數(shù)增生期停滯期潛伏期(latent phase細(xì)胞接種后,先經(jīng)過一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期.此時(shí),細(xì)胞質(zhì)回縮, 胞體呈圓球形.然后細(xì)胞貼附于載體表面,稱貼壁,懸浮期結(jié)束. 細(xì)胞貼壁速度與細(xì)胞種類, 培養(yǎng)基成分,載體的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。一般情況下,原代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁速度慢,可達(dá)10-24 小時(shí)或更多, 而傳代細(xì)胞系貼壁速度快, 通常10-30 分鐘即可貼壁。細(xì)胞貼壁后還需經(jīng)過一個(gè)潛伏階段,才進(jìn)入生長和增殖期.原代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長,約24-96 小時(shí)或更長,

4、連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短,僅需6-24 小時(shí)。(2 指數(shù)增生期(logarithmic growth phase這是細(xì)胞增殖最旺盛的階段,分裂相細(xì)胞增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長是否旺盛的一個(gè)重要標(biāo)志。通常以細(xì)胞分裂相指數(shù)(Mitotic index, MI表示,即細(xì)胞群中每1000 個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%-0.5%,原代細(xì)胞分裂指數(shù)較低,而連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂相指數(shù)可高達(dá)3%-5%。指數(shù)增生期的細(xì)胞活力最好時(shí)期,是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)最佳時(shí)期,也是凍存細(xì)胞的最好時(shí)機(jī)。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下,指數(shù)增生期持續(xù)3-5 天后,隨著細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長空

5、間減少,最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。正常細(xì)胞相互接觸后能抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng),這種現(xiàn)象稱接觸抑制現(xiàn)象(contactinhibition。而惡性腫瘤細(xì)胞無接觸抑制現(xiàn)象,能繼續(xù)移動(dòng)和增殖,導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展,使細(xì)胞發(fā)生堆積(piled up。細(xì)胞接觸匯合成片后,雖然發(fā)生接觸抑制,但只要營養(yǎng)充分,細(xì)胞仍能進(jìn)行增殖分裂,因此細(xì)胞數(shù)仍然在增多。但是,當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大,培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少,代謝產(chǎn)物增多時(shí),細(xì)胞因營養(yǎng)枯竭和代謝產(chǎn)物的影響,導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止,這種現(xiàn)象稱密度抑制現(xiàn)象(Density Inhibition。(3停滯期(Stagnate phase細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后,如不及時(shí)進(jìn)行傳代,細(xì)胞就會(huì)

6、停止增殖,進(jìn)入停止期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)持平,故也稱平臺期(Plateau phase。停滯期細(xì)胞雖不增殖,但仍有代謝活動(dòng)。如不進(jìn)行分離傳代,細(xì)胞會(huì)因培養(yǎng)液中營養(yǎng)耗盡、代謝產(chǎn)物積聚、pH 下降等因素中毒,出現(xiàn)形態(tài)改變,貼壁細(xì)胞會(huì)脫落,嚴(yán)重的會(huì)發(fā)生死亡,因此,應(yīng)及時(shí)傳代。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.能獨(dú)立的進(jìn)行細(xì)胞技術(shù),會(huì)繪制生長曲線,了解細(xì)胞生長的發(fā)育特性。2. 學(xué)習(xí)在科研中如何應(yīng)用生長曲線實(shí)驗(yàn)原理:生長曲線的測定(計(jì)數(shù)法是測定細(xì)胞絕對生長數(shù)的常用方法,也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo),為培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。一般細(xì)胞傳代之后,經(jīng)過長短不同的潛伏期,即進(jìn)入大量分裂的指數(shù)生長期。在細(xì)胞達(dá)到飽和密度后,停止生長,

7、進(jìn)入平頂期,然后退化衰亡。為了準(zhǔn)確描述整個(gè)過程中的細(xì)胞數(shù)目的動(dòng)態(tài)變化,需連續(xù)對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),通常計(jì)數(shù)7天。為精確起見,一般每次計(jì)數(shù)三瓶細(xì)胞并取平均值。典型的生長曲線可分為生長緩慢的潛伏期,成平臺狀的平頂期及退化衰亡四個(gè)部分。以存活細(xì)胞數(shù)對培養(yǎng)時(shí)間做圖,即生長曲線。生長曲線常用于測定藥物等外來因素對細(xì)胞生長的影響。一般在對數(shù)期的1/3-1/2處加藥。細(xì)胞技術(shù)的時(shí)間和次數(shù)依實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩āＡ硗?測定生長曲線的常用方法還有MTT法。計(jì)數(shù)板原理:當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí),通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目,即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。操作步驟:1. 將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈,并將蓋片蓋

8、在計(jì)數(shù)板,放在鏡下觀察。2. 制備細(xì)胞懸液:細(xì)胞從培養(yǎng)板孔轉(zhuǎn)移到離心管,離心1000轉(zhuǎn)4-5分鐘,棄去上清,加入PBS至一定體積(1ML。3. 將細(xì)胞懸液吸出少許,滴加在蓋片邊緣,使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間,靜置3min,注意蓋片下不要有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中。4. 計(jì)算板四大格細(xì)胞總數(shù),壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按公式計(jì)算:細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù)/4×104說明:公式中除以4,因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為:1.0mm(長×1.0mm(寬×0.1mm(高=0.1mm3 而 1ml=1000mm3(注意

9、:鏡下偶見有兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán),應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算,若細(xì)胞團(tuán)10%以上,說明分散不好,需重新稀釋制備細(xì)胞懸液臺盼蘭染色操作步驟:1、制備細(xì)胞懸液,放入EP管中。2、以1:1的比例加入0.4%臺盼蘭染液,染色2一3分鐘。3、吸取少許懸液涂于載玻片上,加上蓋片。4、鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù),計(jì)算細(xì)胞活力。凍存與復(fù)蘇一、哺乳動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存實(shí)驗(yàn)?zāi)康?(1保存種子細(xì)胞,以便隨時(shí)取用。這是保存細(xì)胞的最主要目的。(2減少細(xì)胞被微生物污染的危險(xiǎn)性。(3減少細(xì)胞之間交叉污染的危險(xiǎn)性。(4減少細(xì)胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變。(5避免有限細(xì)胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)原理:細(xì)胞凍存及

10、復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融,實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑,這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性,加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外,減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法,這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化,避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損傷。實(shí)驗(yàn)用品:(一儀器凈化工作臺、離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱(4、-20、-70、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。(二玻璃器皿吸管(彎頭、直頭、培養(yǎng)瓶、玻璃瓶(250ml、100ml、廢液缸; (三塑料器皿吸頭、槍頭、膠塞、

11、移液管(10ml、15ml離心管、凍存管(12ml (四其他物品微量加樣槍、紅血球計(jì)數(shù)板、記號筆、移液槍。(五試劑1640培養(yǎng)液、DMSO(分析純K562細(xì)胞,慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系中的一種。操作步驟:1. 準(zhǔn)備:打開培養(yǎng)液,PBS;取出離心管,擰開管蓋,管蓋倒放。從吸管筒中依次取出吸管,裝上吸頭,插入離心管備用。2. 配制凍存液:吸取9ML培養(yǎng)液放入離心管,用移液槍吸取1ML DMSO溶液,逐滴緩慢加入離心管中。最好把離心管插在冰中。2.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞,放在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)、密度。3. 吸出 1 個(gè)孔中的細(xì)胞連同培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入離心管中。再另取一只吸管吸取 PBS， 放入培養(yǎng)板孔中，輕

12、輕吹打孔壁，吸出轉(zhuǎn)入離心管。 4. 離心，設(shè)置離心機(jī) 1000 轉(zhuǎn) 4-5 分鐘。取出離心管，輕輕吸出上清，倒入廢液 缸。輕輕吸出余下的培養(yǎng)液，注意勿吸出細(xì)胞沉淀。 5. 吸取 1ML 配制好的凍存液加入離心管，與細(xì)胞混勻后，轉(zhuǎn)入凍存管。 6. 標(biāo)注： 標(biāo)明細(xì)胞種類、凍存日期，凍存人。 7. 在 4冰箱中放置 30 分鐘； 然后轉(zhuǎn)入-20， 放置 30 分鐘； 然后再轉(zhuǎn)入-80 放置 1618 小時(shí)（或過夜）；最后放入液氮中長期保存。有條件的地方， 可用凍存盒。 注意事項(xiàng)： （1）凍存過程需緩慢 （2）凍存細(xì)胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90，無微生物污染。 （3）細(xì)胞濃度控制在：1×

13、;1075×107/ml。 （4）使用合適的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑，以保護(hù)細(xì)胞在冷凍過程中免受冰晶破壞。目 前，最常用的冷凍保護(hù)劑是DMSO(二甲基亞砜，使用終濃度為510。但是， 有些細(xì)胞系不能用DMSO作為冷凍保護(hù)劑， 如人白血病細(xì)胞系HL-60。 因?yàn)椋?DMSO 能 誘導(dǎo)HL-60 細(xì)胞分化。 在這種情況下， 可選用其它冷凍保護(hù)劑， 如甘油 （glycele） , 羥乙基淀粉等。 （5）DMSO 稀釋時(shí)會(huì)釋放大量熱量。因此，DMSO 不能直接加到細(xì)胞液中，必須 事先配制。 細(xì)胞復(fù)蘇 操作步驟： （一）準(zhǔn)備工作 1、37水浴 2、準(zhǔn)備一個(gè)內(nèi)裝5-10 ml 細(xì)胞完全培養(yǎng)液離心管 。 （二）復(fù)蘇 1、帶手套，用鑷子將細(xì)胞冷凍管從液氮中取出，迅速放入37水浴中，手持 凍存管不斷搖動(dòng)。觀察完全解凍后移入超凈臺。冷凍管在水浴中解凍時(shí)，液面不 可超過凍存