細(xì)胞劃痕專業(yè)課件

1、1細(xì)胞劃痕實驗2一、基本原理一、基本原理細(xì)胞劃痕（細(xì)胞劃痕（Wound Healing ）法是簡捷測定細(xì)胞遷移運）法是簡捷測定細(xì)胞遷移運動與修復(fù)能力的方法，類似體外傷口愈合模型，在體動與修復(fù)能力的方法，類似體外傷口愈合模型，在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上，用微量槍頭外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上，用微量槍頭或其它硬物在細(xì)胞生長的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部或其它硬物在細(xì)胞生長的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實驗設(shè)定的時間（例分的細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實驗設(shè)定的時間（例如如24h），取出細(xì)胞培養(yǎng)板，觀察周邊細(xì)胞是否遷移），取出細(xì)胞培養(yǎng)板，觀察周邊細(xì)胞是否遷移（修復(fù)

2、）至中央劃痕區(qū)，以此判斷細(xì)胞的生長遷移能（修復(fù)）至中央劃痕區(qū)，以此判斷細(xì)胞的生長遷移能力，實驗通常需設(shè)定正常對照組和實驗組，實驗組是力，實驗通常需設(shè)定正常對照組和實驗組，實驗組是加了某種處理因素或藥物、外源性基因等的組別，通加了某種處理因素或藥物、外源性基因等的組別，通過不同分組之間的細(xì)胞對于劃痕區(qū)修復(fù)能力的不同，過不同分組之間的細(xì)胞對于劃痕區(qū)修復(fù)能力的不同，可以判斷各組細(xì)胞的遷移與修復(fù)能力可以判斷各組細(xì)胞的遷移與修復(fù)能力 3二、實驗步驟二、實驗步驟 準(zhǔn)備：所有能滅菌的器械都要滅菌，直尺和準(zhǔn)備：所有能滅菌的器械都要滅菌，直尺和marker筆在操作前紫外照射筆在操作前紫外照射30min（超凈臺內(nèi)

3、（超凈臺內(nèi)）1.先用先用marker筆在筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻孔板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每隔得劃橫線，大約每隔0.51cm一道，橫穿過孔。每一道，橫穿過孔。每孔至少穿過孔至少穿過5條線。條線。2.在孔中加入約在孔中加入約5105個細(xì)胞，具體數(shù)量因細(xì)胞不個細(xì)胞，具體數(shù)量因細(xì)胞不同而不同，掌握為過夜能鋪滿。同而不同，掌握為過夜能鋪滿。3.第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜，不同孔之間最好使劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜，不同孔之間最好使用同一槍頭。用同一槍頭。4.用用PBS洗細(xì)胞洗細(xì)胞3次，去掉劃下的細(xì)

4、胞，次，去掉劃下的細(xì)胞，加入無血清加入無血清或低血清培養(yǎng)基?；虻脱迮囵B(yǎng)基。5.放入放入37度度5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按按0，6，12，24小時取樣，拍照小時取樣，拍照。4culture Insert 方法（保證劃痕的均一度）方法（保證劃痕的均一度）1. 準(zhǔn)備細(xì)胞，培養(yǎng)液。準(zhǔn)備細(xì)胞，培養(yǎng)液。2. 如圖，將細(xì)胞接種于如圖，將細(xì)胞接種于Dish中間的中間的Insert，細(xì)胞長滿，細(xì)胞長滿Insert 區(qū)域后用鑷子區(qū)域后用鑷子移除移除Insert即可產(chǎn)生即可產(chǎn)生500 m寬度的劃痕。寬度的劃痕。3. 每隔每隔4-6小時拍照記錄。小時拍照記錄。4. 根據(jù)收集圖片數(shù)據(jù)分析實驗結(jié)果。根據(jù)

5、收集圖片數(shù)據(jù)分析實驗結(jié)果。細(xì)胞定位格子培養(yǎng)皿56三、實驗結(jié)果三、實驗結(jié)果 統(tǒng)計方法：使用統(tǒng)計方法：使用Image J軟件打開圖片后，隨機劃取軟件打開圖片后，隨機劃取6至至8條水平線，計算細(xì)胞間距離的均值，測量劃痕區(qū)域的像素條水平線，計算細(xì)胞間距離的均值，測量劃痕區(qū)域的像素定量比較細(xì)胞遷移的速度。定量比較細(xì)胞遷移的速度。其他結(jié)果分析工具：其他結(jié)果分析工具：Wound Healing Image Analysis WimScratch http:/dxy.me/UfYzii Image Pro Plus78劃痕結(jié)果圖劃痕結(jié)果圖90h6h12h24h小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3109、 人的價值，

6、在招收誘惑的一瞬間被決定。2022-3-172022-3-17Thursday, March 17, 202210、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2022-3-172022-3-172022-3-173/17/2022 8:44:45 PM11、人總是珍惜為得到。2022-3-172022-3-172022-3-17Mar-2217-Mar-2212、人亂于心，不寬余請。2022-3-172022-3-172022-3-17Thursday, March 17, 202213、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。2022-3-172022-3-172022-3-172022-3-173/17/202

7、214、抱最大的希望，作最大的努力。2022年3月17日星期四2022-3-172022-3-172022-3-1715、一個人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。2022年3月2022-3-172022-3-172022-3-173/17/202216、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2022-3-172022-3-17March 17, 202217、一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。2022-3-172022-3-172022-3-172022-3-1712 四、注意事項：四、注意事項： 1.在用在用PBS緩沖液沖洗時，注意貼壁慢慢加入，緩沖液沖洗時，注意貼壁慢慢加入，以免沖散單層貼壁細(xì)胞，影

8、響實驗拍照結(jié)果。以免沖散單層貼壁細(xì)胞，影響實驗拍照結(jié)果。 2.一般做劃痕實驗，都是無血清或者低血清一般做劃痕實驗，都是無血清或者低血清（2%）否則細(xì)胞增殖就不能忽略。（也可用絲）否則細(xì)胞增殖就不能忽略。（也可用絲裂霉素處理一小時）裂霉素處理一小時） 3.按照按照6孔板背后畫線的垂直方向劃痕，可以形孔板背后畫線的垂直方向劃痕，可以形成若干交叉點，作為固定的檢測點，以解決了前成若干交叉點，作為固定的檢測點，以解決了前后觀察時位置不固定的問題。后觀察時位置不固定的問題。9、 人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2022-3-172022-3-17Thursday, March 17, 202210、

9、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2022-3-172022-3-172022-3-173/17/2022 8:44:45 PM11、人總是珍惜為得到。2022-3-172022-3-172022-3-17Mar-2217-Mar-2212、人亂于心，不寬余請。2022-3-172022-3-172022-3-17Thursday, March 17, 202213、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。2022-3-172022-3-172022-3-172022-3-173/17/202214、抱最大的希望，作最大的努力。2022年3月17日星期四2022-3-172022-3-172022-3-17

10、15、一個人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。2022年3月2022-3-172022-3-172022-3-173/17/202216、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2022-3-172022-3-17March 17, 202217、一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。2022-3-172022-3-172022-3-172022-3-1714 特點：特點： 1. 在一定程度上模擬了體內(nèi)細(xì)胞遷移的過程。在一定程度上模擬了體內(nèi)細(xì)胞遷移的過程。2. 價格低廉，操作簡單。還有很重要的一點在于細(xì)胞外價格低廉，操作簡單。還有很重要的一點在于細(xì)胞外圍環(huán)境簡單單純，容易控制。圍環(huán)境簡單單純，容易控制。3.

11、與包括活細(xì)胞成像在內(nèi)的顯微鏡系統(tǒng)兼容，可用于分與包括活細(xì)胞成像在內(nèi)的顯微鏡系統(tǒng)兼容，可用于分析細(xì)胞間的相互作用。析細(xì)胞間的相互作用。4. 研究細(xì)胞遷移的體外實驗中最簡單的方法。研究細(xì)胞遷移的體外實驗中最簡單的方法。15舉例：抗腫瘤藥物舉例：抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶對腫瘤細(xì)胞遷移的影響（細(xì)胞劃痕法氟尿嘧啶對腫瘤細(xì)胞遷移的影響（細(xì)胞劃痕法） 一、一、實驗原理：細(xì)胞劃痕法是測定腫瘤細(xì)胞運動實驗原理：細(xì)胞劃痕法是測定腫瘤細(xì)胞運動特性方法之一，其借鑒體外細(xì)胞致傷愈合實驗?zāi)Ｌ匦苑椒ㄖ唬浣梃b體外細(xì)胞致傷愈合實驗?zāi)Ｐ?，在體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上劃痕致傷，加入藥型，在體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上劃痕致傷，加入藥物觀察其抑

12、制腫瘤細(xì)胞遷移的能力物觀察其抑制腫瘤細(xì)胞遷移的能力 二、實驗材料：二、實驗材料：1） 細(xì)胞系及其培養(yǎng)：肝腫瘤細(xì)細(xì)胞系及其培養(yǎng)：肝腫瘤細(xì)胞胞HepG2 2） 24孔板孔板 移液器移液器 倒置顯微鏡倒置顯微鏡 3） 主要試劑：主要試劑：PBS DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)液 0.25%胰酶胎牛血清胰酶胎牛血清 5-氟尿嘧啶溶液（氟尿嘧啶溶液（1ug/ml） 16三、實驗步驟三、實驗步驟 1制備單層細(xì)胞：細(xì)胞密度制備單層細(xì)胞：細(xì)胞密度510105 /mLHep G2細(xì)胞鋪于細(xì)胞鋪于24孔孔板（每孔板（每孔500 uL）上，加入含）上，加入含10胎牛血清的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)液培養(yǎng)培養(yǎng)1624 h,使形

13、成單層細(xì)胞使形成單層細(xì)胞 2劃痕劃痕 ：以五氟尿嘧啶（：以五氟尿嘧啶（5Fu）為例，首先配制）為例，首先配制1 g/L母液母液(使用無菌蒸餾水配制，精密量?。∈褂脽o菌蒸餾水配制，精密量?。?，取45 L該母液用該母液用PBS稀釋至稀釋至1.1 mL，得濃度，得濃度40 g/mL5Fu溶液溶液 ，用，用10 uL移液槍槍頭（或者移液槍槍頭（或者無菌牙簽）在單層細(xì)胞上呈一字劃痕，用無菌牙簽）在單層細(xì)胞上呈一字劃痕，用PBS清洗清洗3次，然后加入次，然后加入上面配好上面配好5Fu溶液，平行兩個樣本，孵育溶液，平行兩個樣本，孵育24 h，換成含，換成含10胎牛胎牛血清的血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)液孵育

14、孵育24 h 3觀察并拍照：吸去培養(yǎng)液，用觀察并拍照：吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗清洗3次，倒置熒光顯微鏡下次，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照觀察并拍照 1718四、注意事項：四、注意事項： 1 實驗時應(yīng)注意細(xì)胞生長狀況，選擇適當(dāng)細(xì)胞實驗時應(yīng)注意細(xì)胞生長狀況，選擇適當(dāng)細(xì)胞接種濃度，對不同細(xì)胞要觀察細(xì)胞貼接種濃度，對不同細(xì)胞要觀察細(xì)胞貼 壁率等，確壁率等，確定實驗時細(xì)胞的接種數(shù)量和培養(yǎng)時間，保證培養(yǎng)定實驗時細(xì)胞的接種數(shù)量和培養(yǎng)時間，保證培養(yǎng)終止時密度適當(dāng)。終止時密度適當(dāng)。 2 用用PBS緩沖液沖洗時，注意貼壁慢慢加入，緩沖液沖洗時，注意貼壁慢慢加入，免沖散單層貼壁細(xì)胞影響實驗拍照結(jié)果。免沖散單層貼壁細(xì)胞

15、影響實驗拍照結(jié)果。 3 藥物篩選過程，其對細(xì)胞遷移能力影響也是重藥物篩選過程，其對細(xì)胞遷移能力影響也是重要的一方面，要的一方面，實驗設(shè)計過程需實驗設(shè)計過程需 要選擇適當(dāng)陽性對要選擇適當(dāng)陽性對照組和陰性對照組。照組和陰性對照組。199、 人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。22.3.1722.3.17Thursday, March 17, 202210、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。*3/17/2022 8:44:45 PM11、人總是珍惜為得到。22.3.17*Mar-2217-Mar-2212、人亂于心，不寬余請。*Thursday, March 17, 202213、生氣是拿別人做錯的事來懲

16、罰自己。22.3.1722.3.17*March 17, 202214、抱最大的希望，作最大的努力。2022年3月17日星期四*22.3.1715、一個人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。2022年3月*22.3.17*March 17, 202216、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。*3/17/202217、一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。*22.3.17謝謝大家謝謝大家9、 人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2022-3-172022-3-17Thursday, March 17, 202210、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2022-3-172022-3-172022-3-173/17/2022 8:44:45 PM11、人總是珍惜為得到。2022-3-172022-3-172022-3-17Mar-2217-Mar-2212、人亂于心，不寬余請。2022-3-172022-3-172022-3-17Thursday, March 17, 202213、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。2022-3-172022-3-1720