植物細胞程序性死亡(PCD)的誘導、形態(tài)觀察

1、首都師范大學生物實驗報告科目：細胞生物學 班級：師范班 姓名：王攀 學號：1110800065實驗名稱：植物細胞程序性死亡PCD的誘導、形態(tài)觀察 日期：10.30一、 實驗目的：1、了解植物細胞PCD的概念 2、掌握植物細胞PCD的誘導方法、和統(tǒng)計方法 3、了解動物細胞凋亡過程的方法 二、 實驗原理：1、細胞死亡：細胞死亡作為生物體的一種常見現(xiàn)象，在動物細胞中有三種方式：凋亡apoptosis，自噬autophagy和壞死necrosis。前兩種類型屬于細胞程序性死亡programmed cell death，PCD。細胞壞死是細胞在遭受極度刺激時引起的細胞死亡，以細胞質膜的破裂為特征，造成內

2、含物的炎性泄露，是一種非正常死亡。 細胞的PCD是細胞的一種“主動性死亡行為，從形態(tài)上和功能上都與細胞壞死有很大的不同。2、植物中細胞程序性死亡PCD：目前可依據(jù)液泡膜破裂后，是否在細胞質中發(fā)生快速降解將PCD分為兩個大類。 第一類為自溶性autolyticPCD，與液泡中的水解酶的釋放有關，在液泡破裂后，導致細胞質的快速去除。 第二種為非自溶PCD，non-autolytic，即液泡膜破裂但是沒有出現(xiàn)快速的細胞質的去除。目前鑒定細胞的PCD類型，還是以細胞形態(tài)學為主。3、動植物細胞凋亡標準：動物：凋亡 ：凋亡小體，或者在細胞外表的水泡，感染病原體后在其他細胞中的降解。自噬：自噬小體，自溶酶體

3、，和小的促進細胞溶解的液泡數(shù)目的增加 壞死：沒有上面的定義的標準。植物：自溶：植物膜破裂之后對細胞質的快速清理。非自溶： 沒有對細胞質的快速清理。其他：染色質濃縮 細胞核破裂 自我標記信號 自食信號 細胞膨脹，細胞器膨脹，質膜破裂 染色質濃縮。液泡體積增加細胞質體積減小 需要Ca2+的內流，細胞質皺縮，細胞器膨脹，小泡增多但體積不增加。三、 實驗步驟1、 植物細胞凋亡：參加較高濃度的CaCL2誘導，觀察和統(tǒng)計誘發(fā)產生的PCD細胞。用改良苯酚品紅染色觀察PCD細胞核發(fā)生染色質凝集condensation、趨邊化(margination)、 產生PCD小泡等形態(tài)學上的變化。 （1） 形態(tài)觀察：洋蔥

4、內表皮， 100mmol/LCaCl2 500mmol/LCaCl2 注意都用PBS6.5配置處理兩小時，用于形態(tài)觀察和凋亡統(tǒng)計。（2） PCD計數(shù)2、動物細胞凋亡觀察：觀看錄像。四、 實驗材料洋蔥鱗莖內表皮、細胞PCD誘導劑Ca2+、形態(tài)學觀察染色液改良苯酚品紅五、 實驗結果1、 植物細胞凋亡觀察：1觀察數(shù)據(jù)：處理計數(shù)PCD率平均數(shù)據(jù)0.1M CaCl2 2 hr 47/116(如圖A)46/115(如圖B)108/26(如圖C)30/120(如圖D)23/93(如圖E)31%PCD率41%40%24%25%25%0.5M CaCl2 2 hr 23/63(如圖F)39/86(如圖G)30/

5、73(如圖H)23/67(如圖I)37/89(如圖J)39.6%PCD率36%45%41%34%42%Ck20/97(如圖K)20.6%2觀察圖片：ABA：0.1M CaCl2 誘導2h的PCD觀察10*40B：0.1M CaCl2 誘導2h的PCD觀察10*40CDC：0.1M CaCl2 誘導2h的PCD觀察10*40D：0.1M CaCl2 誘導2h的PCD觀察10*40EFE：0.1M CaCl2 誘導2h的PCD觀察10*40F：0.5M CaCl2誘導20-30min的PCD觀察10*40GHG：0.5M CaCl2誘導20-30min的PCD觀察10*40H：0.5M CaCl2

6、誘導20-30min的PCD觀察10*40IJI：0.5M CaCl2誘導20-30min的PCD觀察10*40J：0.5M CaCl2誘導20-30min的PCD觀察10*40KK：對照組，光鏡10X40（3） 觀察總結：<1>經過觀察，洋蔥內皮細胞都有一定數(shù)量的凋亡。沒有經過氯化鈣的細胞PCD率最低，其次為低濃度氯化鈣處理后的洋蔥細胞，PCD率最高的為是經過高濃度氯化鈣處理后的洋蔥細胞?？梢娀瘜W脅迫因子氯化鈣的濃度越高，對細胞凋亡影響越大。<2>凋亡的細胞形態(tài)也各有不同，有的為細胞核變形，有的為質壁別離現(xiàn)象明顯，有的為細胞膜皺縮，細胞質濃縮，細胞核呈新月形，有的為染

7、色質濃縮聚集，凝聚的染色質與細胞質成分包裹在一起，形成較多的近球狀凋亡小體。2、 動物細胞凋亡觀察：看錄像1細胞色素C作為一種信號物質，在細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞液，線粒體里的細胞色素c通過熒光標記，被染成黃綠色。2磷脂酰絲氨酸Phosphatidylserine, PS正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的外表，暴露在細胞外環(huán)境中，紅顏色出現(xiàn)，為eat me信號。3帶有紅色信號的DNA被切斷，膜把細胞質和被切斷的dna包成小體，紅的包著著藍的為凋亡小體。被吞噬細胞吞噬掉。六、 改良與建議1、 植物細胞的凋亡主觀臆斷比較嚴重，不能肯定或確定它是否凋亡。在給細胞計數(shù)的時候，雖然可以照下來再計數(shù)，但是還是有一定困難，希望下一回可以用計數(shù)器。2、 植物細胞在高濃氯化鈣浸泡下，很多細胞都出現(xiàn)了質壁別離現(xiàn)象，有時可能會被判斷