蛋白質(zhì)純化技術(shù)PPT幻燈片課件

1、蛋白質(zhì)的分離純化與鑒定蛋白質(zhì)的分離純化與鑒定Isolation, Purification and Identification of Protein1分子生物學(xué)圣經(jīng)分子生物學(xué)圣經(jīng)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南分子克隆實(shí)驗(yàn)指南2為什么要純化蛋白質(zhì)？為什么要純化蛋白質(zhì)？理論意義：理論意義：深入研究某種蛋白質(zhì)的功能深入研究某種蛋白質(zhì)的功能以及作用機(jī)制，如信號(hào)通路中的蛋白以及作用機(jī)制，如信號(hào)通路中的蛋白質(zhì)質(zhì)應(yīng)用價(jià)值應(yīng)用價(jià)值-蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程 醫(yī)藥、工業(yè)、科研醫(yī)藥、工業(yè)、科研 作為藥物靶點(diǎn)作為藥物靶點(diǎn)蛋白質(zhì)是生命功能的執(zhí)行者蛋白質(zhì)是生命功能的執(zhí)行者3蛋白質(zhì)工程中進(jìn)行蛋白質(zhì)純化的必要性蛋白質(zhì)工程中進(jìn)行蛋白質(zhì)純化的

2、必要性 首先，需要單一的蛋白質(zhì)作為實(shí)驗(yàn)材料，首先，需要單一的蛋白質(zhì)作為實(shí)驗(yàn)材料，研究其結(jié)構(gòu)與功能研究其結(jié)構(gòu)與功能； 其次，其次，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾改造對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾改造時(shí)需要單時(shí)需要單一的蛋白質(zhì)作為原材料；一的蛋白質(zhì)作為原材料； 最后，為了生產(chǎn)性能更優(yōu)良的蛋白質(zhì)，最后，為了生產(chǎn)性能更優(yōu)良的蛋白質(zhì)，需要對(duì)設(shè)計(jì)改造過(guò)的蛋白質(zhì)進(jìn)行大量純需要對(duì)設(shè)計(jì)改造過(guò)的蛋白質(zhì)進(jìn)行大量純化，從而化，從而開(kāi)發(fā)出相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)出相關(guān)產(chǎn)品。4本章概要本章概要蛋白質(zhì)純化方法蛋白質(zhì)純化方法蛋白質(zhì)純化原則蛋白質(zhì)純化原則純化步驟純化步驟蛋白質(zhì)的鑒定蛋白質(zhì)的鑒定5一、蛋白純化方法一、蛋白純化方法蛋白質(zhì)純化的根據(jù)：蛋白質(zhì)純化的根據(jù)： 不

3、同的蛋白質(zhì)，理化性質(zhì)不同。不同的蛋白質(zhì)，理化性質(zhì)不同。理化性質(zhì)不同的原因：理化性質(zhì)不同的原因： 氨基酸的數(shù)目和序列不同。氨基酸的數(shù)目和序列不同。61.與蛋白質(zhì)分離純化相關(guān)的理化特性與蛋白質(zhì)分離純化相關(guān)的理化特性分子大小分子大小分子形狀分子形狀帶電特性帶電特性溶解特性溶解特性與配體特異性結(jié)合不同與配體特異性結(jié)合不同吸附性質(zhì)吸附性質(zhì)變性和復(fù)性變性和復(fù)性71.1分子大小分子大小蛋白質(zhì)分子大小主要取決于：蛋白質(zhì)分子大小主要取決于： 蛋白質(zhì)肽鏈的數(shù)目蛋白質(zhì)肽鏈的數(shù)目 每條肽鏈的氨基酸殘基數(shù)目。每條肽鏈的氨基酸殘基數(shù)目。幾百幾百百萬(wàn)百萬(wàn) Da常用方法常用方法 透析透析 超濾超濾 凝膠過(guò)濾凝膠過(guò)濾 離心離心

4、8 透析透析(dialysis)利用利用透析袋透析袋把大把大分子蛋白質(zhì)與小分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開(kāi)分子化合物分開(kāi)的方法。的方法。910 超濾法超濾法 應(yīng)用應(yīng)用正壓或離心力正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過(guò)使蛋白質(zhì)溶液透過(guò)有一定截留分子量有一定截留分子量的超濾膜的超濾膜，達(dá)到濃，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目縮蛋白質(zhì)溶液的目的。的。11 超濾法超濾法 應(yīng)用應(yīng)用正壓或離心力正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過(guò)使蛋白質(zhì)溶液透過(guò)有一定截留分子量有一定截留分子量的超濾膜的超濾膜，達(dá)到濃，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目縮蛋白質(zhì)溶液的目的。的。12凝膠過(guò)濾凝膠過(guò)濾 是按照天然蛋白質(zhì)是按照天然蛋白質(zhì)相對(duì)分子相對(duì)分子質(zhì)量大小質(zhì)量大小進(jìn)行

5、分離的技術(shù)，又稱(chēng)進(jìn)行分離的技術(shù)，又稱(chēng)為為分子篩層析或排阻層析分子篩層析或排阻層析。 1314超速離心超速離心離心離心（centrifugation）：利用機(jī)械的快速：利用機(jī)械的快速旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，將不同密度的物旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，將不同密度的物質(zhì)分離開(kāi)來(lái)的方法。質(zhì)分離開(kāi)來(lái)的方法。 超速離心法超速離心法 (ultracentrifugation)：60萬(wàn)萬(wàn) g ， 6萬(wàn)萬(wàn)8萬(wàn)萬(wàn) r/min。可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)分子?？捎脕?lái)測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。量。15超速離心超速離心161.2分子形狀分子形狀形狀形狀 蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)在離心離心通過(guò)溶液時(shí)，或通過(guò)通過(guò)溶液時(shí)，或通過(guò)膜膜、凝凝膠過(guò)濾填料顆粒膠過(guò)濾填料顆粒

6、或或電泳凝膠電泳凝膠中時(shí)，都會(huì)受中時(shí)，都會(huì)受到分子形狀的影響。到分子形狀的影響。方法方法 梯度離心梯度離心 電泳電泳171.3電荷電荷原理原理蛋白質(zhì)的凈電荷與蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的凈電荷與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)等電點(diǎn)pI以以及及環(huán)境環(huán)境pH值值有關(guān)（有關(guān)（pHpI，），）方法方法電泳電泳離子交換層析離子交換層析18191.4溶解度溶解度原理原理 蛋白質(zhì)分子表面蛋白質(zhì)分子表面親水性和疏水性帶電基團(tuán)親水性和疏水性帶電基團(tuán)不同不同，因此在溶劑中的溶解度不同。，因此在溶劑中的溶解度不同。 通過(guò)通過(guò)改變改變pH、離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度或或加入有機(jī)試劑加入有機(jī)試劑，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的凝聚進(jìn)而形成沉淀。促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的凝聚進(jìn)而形成沉

7、淀。方法：沉淀法方法：沉淀法 鹽析法（鹽析法（eg. 硫酸銨）硫酸銨） 有機(jī)溶劑沉淀法（有機(jī)溶劑沉淀法（eg. 丙酮）丙酮） 等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法20 蛋白質(zhì)在高濃度中性鹽溶液中會(huì)沉淀析出，蛋白質(zhì)在高濃度中性鹽溶液中會(huì)沉淀析出，稱(chēng)為稱(chēng)為鹽析。鹽析。 鹽析原理：鹽析原理： 高濃度鹽離子破壞蛋白質(zhì)高濃度鹽離子破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化分子表面的水化膜膜，影響蛋白質(zhì)，影響蛋白質(zhì)分子表面所帶電荷分子表面所帶電荷，從而，從而引起蛋白質(zhì)沉淀，但通常不會(huì)引起蛋白質(zhì)引起蛋白質(zhì)沉淀，但通常不會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性。的變性。鹽析法鹽析法211.5配體特異性結(jié)合配體特異性結(jié)合 原理原理 生物大分子的某些特定結(jié)構(gòu)區(qū)域能

8、夠生物大分子的某些特定結(jié)構(gòu)區(qū)域能夠特異性識(shí)特異性識(shí)別其他分子別其他分子并并可逆結(jié)合可逆結(jié)合，生物分子間的這種結(jié)，生物分子間的這種結(jié)合能力稱(chēng)為合能力稱(chēng)為親和力親和力。 方法方法 將具有親和力的兩個(gè)分子中的一個(gè)固定在不溶將具有親和力的兩個(gè)分子中的一個(gè)固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性對(duì)另一個(gè)分子進(jìn)行分離純化。性對(duì)另一個(gè)分子進(jìn)行分離純化。 分類(lèi)分類(lèi) 免疫親和層析免疫親和層析 生物親和層析生物親和層析 金屬螯合親和層析金屬螯合親和層析221.6吸附性質(zhì)吸附性質(zhì) 原理原理 蛋白質(zhì)可吸附在不同材料的表面，如金屬、蛋白質(zhì)可吸附在不同材料的表面，如金屬

9、、陶瓷、塑料等。陶瓷、塑料等。 方法方法 疏水層析疏水層析231.7變性和復(fù)性變性和復(fù)性 原理原理 變性：變性：蛋白質(zhì)在一定的理化條件下會(huì)失去原有蛋白質(zhì)在一定的理化條件下會(huì)失去原有的空間結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及部分理化特性。的空間結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及部分理化特性。 復(fù)性：復(fù)性：當(dāng)變性條件去除后恢復(fù)原有的空間結(jié)構(gòu)當(dāng)變性條件去除后恢復(fù)原有的空間結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能。及生物學(xué)功能。 方法方法 如，利用尿素的變性和復(fù)性方法，從包涵體中如，利用尿素的變性和復(fù)性方法，從包涵體中純化原核表達(dá)蛋白純化原核表達(dá)蛋白242. 分離方法分離方法在實(shí)驗(yàn)操作上，分為：在實(shí)驗(yàn)操作上，分為：沉淀法沉淀法離心法離心法電泳法電泳法超濾法超

10、濾法相分配法相分配法層析法層析法2526* *不可能有一套統(tǒng)一的方法適用于分離純不可能有一套統(tǒng)一的方法適用于分離純化所有的蛋白質(zhì)，化所有的蛋白質(zhì)，* *但每一種蛋白質(zhì)但每一種蛋白質(zhì)可能可能都有一套適合的分都有一套適合的分離純化程序，離純化程序，* *而且所用的主要技術(shù)手段都基本相同。而且所用的主要技術(shù)手段都基本相同。Note27二、蛋白質(zhì)純化的總原則和純化步驟二、蛋白質(zhì)純化的總原則和純化步驟總原則總原則以合理的效率、速度、收率和純度，以合理的效率、速度、收率和純度，將目標(biāo)蛋白從細(xì)胞的全部其他成分，將目標(biāo)蛋白從細(xì)胞的全部其他成分，特別是從雜蛋白中分離出來(lái)，特別是從雜蛋白中分離出來(lái)，同時(shí)仍保留其生

11、物學(xué)活性和化學(xué)完整同時(shí)仍保留其生物學(xué)活性和化學(xué)完整性。性。28二、蛋白質(zhì)純化的總原則和純化步驟二、蛋白質(zhì)純化的總原則和純化步驟步驟步驟選擇實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)材料預(yù)處理選擇實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)材料預(yù)處理蛋白質(zhì)的提取蛋白質(zhì)的提取蛋白質(zhì)的粗分級(jí)蛋白質(zhì)的粗分級(jí)蛋白質(zhì)的細(xì)分級(jí)蛋白質(zhì)的細(xì)分級(jí)蛋白質(zhì)的鑒定蛋白質(zhì)的鑒定 29蛋白質(zhì)純化的前期準(zhǔn)備蛋白質(zhì)純化的前期準(zhǔn)備 關(guān)于蛋白質(zhì)我們已知什么？關(guān)于蛋白質(zhì)我們已知什么？最好的來(lái)源？最好的來(lái)源？蛋白質(zhì)純度要求？活性要求？蛋白質(zhì)純度要求？活性要求？純化蛋白的量？純化蛋白的量？如何進(jìn)行鑒定？如何進(jìn)行鑒定？純化時(shí)間長(zhǎng)短？純化時(shí)間長(zhǎng)短？最終花費(fèi)？最終花費(fèi)？純化方案？純化方案？301、選

12、擇實(shí)驗(yàn)材料及預(yù)處理、選擇實(shí)驗(yàn)材料及預(yù)處理選擇實(shí)驗(yàn)材料選擇實(shí)驗(yàn)材料 物種的選擇物種的選擇 組織的選擇組織的選擇實(shí)驗(yàn)材料預(yù)處理實(shí)驗(yàn)材料預(yù)處理 液體材料液體材料過(guò)濾過(guò)濾離心離心 固體材料固體材料洗滌：自來(lái)水洗滌：自來(lái)水蒸餾水蒸餾水提取緩沖液提取緩沖液材料破碎：材料破碎：31材料破碎材料破碎機(jī)械剪碎機(jī)械剪碎研磨研磨反復(fù)凍融法反復(fù)凍融法超聲破碎法超聲破碎法高壓勻漿法高壓勻漿法酶解法酶解法322、蛋白質(zhì)的提取、蛋白質(zhì)的提取提取分離原則提取分離原則 盡可能多地提取目的蛋白，同時(shí)避免活性盡可能多地提取目的蛋白，同時(shí)避免活性丟失丟失（溫度過(guò)高、（溫度過(guò)高、 pH、有機(jī)試劑、金屬、有機(jī)試劑、金屬離子、蛋白酶等因素

13、）離子、蛋白酶等因素） 選擇合適的選擇合適的pH、選擇合適的離子強(qiáng)度、選擇合適的離子強(qiáng)度332、蛋白質(zhì)的提取、蛋白質(zhì)的提取 提取液成分的確定提取液成分的確定 pH 緩沖液：緩沖液：Tris-HCl, Tris-Gly, Gly-HCl, 檸檬檸檬酸酸-檸檬酸鈉檸檬酸鈉 離子：離子：動(dòng)物動(dòng)物 NaCl, 植物植物KCl 還原劑還原劑:DTT 蛋白酶抑制劑：蛋白酶抑制劑：EDTA, PMSF 金屬離子螯合劑金屬離子螯合劑: EDTA, EGTA去污劑去污劑:SDS, CHAPS, Triton X-100, Tween-20甘油甘油 溫度溫度 04343、蛋白質(zhì)的粗分級(jí)（粗提）、蛋白質(zhì)的粗分級(jí)（粗

14、提） 使用蛋白質(zhì)提取緩沖液提取實(shí)驗(yàn)材料后，使用蛋白質(zhì)提取緩沖液提取實(shí)驗(yàn)材料后，蛋白提取液中目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度往往較低，蛋白提取液中目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度往往較低，采取一些簡(jiǎn)單的方法采取一些簡(jiǎn)單的方法使目標(biāo)蛋白質(zhì)濃縮，使目標(biāo)蛋白質(zhì)濃縮，同時(shí)去除大量的雜質(zhì)同時(shí)去除大量的雜質(zhì)。 常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)：常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)：沉淀法（鹽析、有機(jī)溶沉淀法（鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、等電點(diǎn)沉淀）、超速離心、透析、劑沉淀、等電點(diǎn)沉淀）、超速離心、透析、超濾超濾354、蛋白質(zhì)的細(xì)分級(jí)、蛋白質(zhì)的細(xì)分級(jí) 粗分級(jí)只是使蛋白質(zhì)得到濃縮和初步分離粗分級(jí)只是使蛋白質(zhì)得到濃縮和初步分離純化，多數(shù)情況下純化，多數(shù)情況下還要根據(jù)蛋白質(zhì)分子大還要根據(jù)蛋白質(zhì)

15、分子大小、分子形狀、分子表面特征或分子帶電小、分子形狀、分子表面特征或分子帶電狀況進(jìn)一步純化狀況進(jìn)一步純化。 常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)：常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)：層析層析364.1. 層析層析（ chromatography ）固定相：凝膠固定相：凝膠流動(dòng)相：緩沖液流動(dòng)相：緩沖液原理：原理：37BioGelA agaroseBioGel P acrylamideSephadex glucose (dextrose)Sepharose agaroseSephacryl glucose + acrylamideSephacel cellulose38 層析裝置層析裝置（Chromatographic equipmen

16、t）蠕動(dòng)泵蠕動(dòng)泵層析柱層析柱檢測(cè)器檢測(cè)器記錄儀記錄儀部分收集器部分收集器39 40414.1. 層析層析（ chromatography ） 分子篩層析分子篩層析（ Gel filtration ） 離子交換層析離子交換層析（ Ion exchange ） 疏水作用層析疏水作用層析（ Hydrophobic interaction ） 親和層析親和層析（ Affinity ）424.1.1 分子篩層析分子篩層析 （Gel filtration） 原理原理 也稱(chēng)為凝膠過(guò)濾、排阻層析。是以也稱(chēng)為凝膠過(guò)濾、排阻層析。是以多孔凝膠多孔凝膠材材料為支持物，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液流經(jīng)此支持物時(shí)，料為支持物，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)

17、溶液流經(jīng)此支持物時(shí)，分子大小不同分子大小不同的蛋白質(zhì)所受到的的蛋白質(zhì)所受到的阻滯作用不同阻滯作用不同而而先后流出先后流出，從而達(dá)到分離純化的目的。，從而達(dá)到分離純化的目的。 凝膠介質(zhì)凝膠介質(zhì) 葡聚糖葡聚糖 （glucose） 瓊脂糖瓊脂糖 （agarose） 聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（acrylamide） 纖維素（纖維素（cellulose）43分子篩層析分子篩層析Gel filtration chromatographyHydrophilicNo spontaneous binding to proteins.Chemically and physically stableRigid to

18、allow a high linear flow-rate親水親水對(duì)蛋白質(zhì)親和力低對(duì)蛋白質(zhì)親和力低物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定流速穩(wěn)定流速穩(wěn)定44分子篩層析分子篩層析Gel filtration chromatography45分子篩層析分子篩層析Gel filtration chromatography46分子篩層析分子篩層析Gel filtration chromatography474.1.2 離子交換層析離子交換層析（ Ion exchange ）原理原理 在一定的在一定的pH條件下，不同的蛋白質(zhì)帶有條件下，不同的蛋白質(zhì)帶有的的電荷的種類(lèi)和數(shù)量不同電荷的種類(lèi)和數(shù)量不同，因此它們，因

19、此它們與帶與帶電的凝膠顆粒間的電荷相互作用不同電的凝膠顆粒間的電荷相互作用不同。 利用蛋白質(zhì)和帶電凝膠之間作用力的差別，利用蛋白質(zhì)和帶電凝膠之間作用力的差別，把蛋白質(zhì)分開(kāi)的層析方法。把蛋白質(zhì)分開(kāi)的層析方法。484.1.2 離子交換層析離子交換層析（ Ion exchange ）種類(lèi)種類(lèi) 陽(yáng)離子交換柱陽(yáng)離子交換柱：凝膠帶負(fù)電荷，蛋白質(zhì)帶：凝膠帶負(fù)電荷，蛋白質(zhì)帶正電荷正電荷 陰離子交換柱陰離子交換柱：凝膠帶正電荷，蛋白質(zhì)帶：凝膠帶正電荷，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷負(fù)電荷介質(zhì)介質(zhì) 惰性支持物惰性支持物：瓊脂糖，葡聚糖：瓊脂糖，葡聚糖 帶電基團(tuán)帶電基團(tuán)：羧甲基：羧甲基帶負(fù)電；二乙基氨帶負(fù)電；二乙基氨基基帶正電帶正

20、電 平衡離子平衡離子： 負(fù)電基團(tuán)：負(fù)電基團(tuán)：H+或或Na+ 正電基團(tuán)：正電基團(tuán)：OH-或或Cl-49離子交換層析離子交換層析（ Ion exchange ）陽(yáng)離子交換：陽(yáng)離子交換：陰離子陰離子 先，先，陽(yáng)離子陽(yáng)離子 后后陰離子交換：陰離子交換：陽(yáng)離子陽(yáng)離子 先，先，陰離子陰離子 后后504.1.3 親和層析親和層析（Affinity chromatography）原理原理 利用利用蛋白質(zhì)與配體專(zhuān)一性識(shí)別并結(jié)合蛋白質(zhì)與配體專(zhuān)一性識(shí)別并結(jié)合的特的特性而分離蛋白質(zhì)的一種層析方法。性而分離蛋白質(zhì)的一種層析方法。 將配體固定于支持物上，當(dāng)混合樣品流過(guò)將配體固定于支持物上，當(dāng)混合樣品流過(guò)此支持物時(shí)，此支持

21、物時(shí)，只有目標(biāo)蛋白能與配體專(zhuān)一只有目標(biāo)蛋白能與配體專(zhuān)一性結(jié)合性結(jié)合。先用緩沖液洗脫雜蛋白，然后改。先用緩沖液洗脫雜蛋白，然后改變洗脫條件，將目標(biāo)蛋白洗脫下來(lái)。變洗脫條件，將目標(biāo)蛋白洗脫下來(lái)。51親和層析親和層析（Affinity chromatography）52His-親合示意圖（親合示意圖（金屬螯合層析金屬螯合層析） 鎳柱（鎳柱（Ni-NTA）534.1.4 疏水作用層析疏水作用層析 原理原理 蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)與介質(zhì)疏蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)與介質(zhì)疏水配體的可逆相互作用水配體的可逆相互作用 方法方法 高離子強(qiáng)度下待分離的樣品吸高離子強(qiáng)度下待分離的樣品吸附在疏水介質(zhì)上，然后降低離附在疏水介質(zhì)上，

22、然后降低離子強(qiáng)度選擇性將樣品解吸，子強(qiáng)度選擇性將樣品解吸，疏疏水弱的物質(zhì)先洗脫，疏水強(qiáng)的水弱的物質(zhì)先洗脫，疏水強(qiáng)的物質(zhì)后洗脫物質(zhì)后洗脫。544.2.電泳電泳（ Electrophoresis ） 電泳就是帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電泳就是帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)。電性相反的電極移動(dòng)。55蛋白質(zhì)常用電泳技術(shù)蛋白質(zhì)常用電泳技術(shù) 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE） SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） 等電聚焦電泳等電聚焦電泳（ Isoelectric focusing- IEF） 雙向電泳雙向電泳（ Two Dimensiona

23、l Electrophoresis ）564.2.1 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS： 1、覆蓋蛋白質(zhì)表面電荷，消除電荷差異、覆蓋蛋白質(zhì)表面電荷，消除電荷差異 2、改變蛋白質(zhì)分子構(gòu)象，消除形狀差異、改變蛋白質(zhì)分子構(gòu)象，消除形狀差異57電泳法測(cè)目標(biāo)蛋白的分子量電泳法測(cè)目標(biāo)蛋白的分子量584.2.2不連續(xù)不連續(xù)PAGE分離蛋白質(zhì)的原理分離蛋白質(zhì)的原理 在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，所帶電荷、分子大小在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，所帶電荷、分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)在凝膠中能夠被分離。和形狀不同的蛋白質(zhì)在凝膠中能夠被分離。 原理原理 電荷效應(yīng)電荷效應(yīng) 濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)快慢離子效應(yīng)快慢離子效應(yīng)凝膠濃度

24、差效應(yīng)凝膠濃度差效應(yīng) 分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)594.2.3 等電聚焦電泳等電聚焦電泳（Isoelectric focusingIEF）60等電聚焦等電聚焦（Isoelectric focusing）614.2.4 雙向電泳雙向電泳 第一向：等電聚焦第一向：等電聚焦 （pI） 第二向：第二向：SDS-PAGE (MW) 雙向電泳技術(shù)是雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中蛋白質(zhì)多研究中蛋白質(zhì)多肽鏈分離純化和鑒定的主要實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。肽鏈分離純化和鑒定的主要實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。62Isoelectric focusingSDS gel electrophoresis63Two Dimensional El

25、ectrophoresis of E. coli Proteins - more than 2,000 proteins were visualized64蛋白質(zhì)純化策略蛋白質(zhì)純化策略方案設(shè)計(jì)篇方案設(shè)計(jì)篇Proteinpurificationstrategy65三、純化方案設(shè)計(jì)原則三、純化方案設(shè)計(jì)原則確定純化目標(biāo)確定純化目標(biāo)purity, activity and quantity充分了解目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性充分了解目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性to simplify technique selection and optimisation確定活性測(cè)定方法確定活性測(cè)定方法fast det

26、ection of protein activity/recovery and critical contaminants 盡量減少純化步驟盡量減少純化步驟extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically66確定純化目標(biāo)確定純化目標(biāo)67三、純化方案設(shè)計(jì)原則三、純化方案設(shè)計(jì)原則確定目標(biāo)確定目標(biāo)purity, activity and quantity充分了解目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性充分了解目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性to simplify technique selection and optimisati

27、on確定活性測(cè)定方法確定活性測(cè)定方法fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 盡量減少純化步驟盡量減少純化步驟extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically68三、純化方案設(shè)計(jì)原則三、純化方案設(shè)計(jì)原則確定目標(biāo)確定目標(biāo)purity, activity and quantity充分了解目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性充分了解目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性to simplify technique selection an

28、d optimisation確定活性測(cè)定方法確定活性測(cè)定方法fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 盡量減少純化步驟盡量減少純化步驟extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically69 嚴(yán)格依據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的嚴(yán)格依據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的特殊生物學(xué)性質(zhì)特殊生物學(xué)性質(zhì)，來(lái)，來(lái)設(shè)計(jì)活性檢測(cè)方案設(shè)計(jì)活性檢測(cè)方案 常見(jiàn)檢測(cè)方法常見(jiàn)檢測(cè)方法: 酶學(xué)檢測(cè)酶學(xué)檢測(cè) enzymatic assays. 配體檢測(cè)配體檢測(cè) ligand-bi

29、nding assays 免疫檢測(cè)免疫檢測(cè) immunological assays活性測(cè)定方法的要求：快速、簡(jiǎn)便、特異和定量活性測(cè)定方法的要求：快速、簡(jiǎn)便、特異和定量確定活性檢測(cè)方法確定活性檢測(cè)方法70三、純化方案設(shè)計(jì)原則三、純化方案設(shè)計(jì)原則確定目標(biāo)確定目標(biāo)purity, activity and quantity充分了解目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性充分了解目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性to simplify technique selection and optimisation確定活性測(cè)定方法確定活性測(cè)定方法fast detection of protein activity/recove

30、ry and critical contaminants 盡量減少純化步驟盡量減少純化步驟extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically71盡量減少純化步驟盡量減少純化步驟 純化步驟越多，樣品損失越大（產(chǎn)量、活性）純化步驟越多，樣品損失越大（產(chǎn)量、活性）72 減少每步操作時(shí)間減少每步操作時(shí)間 to avoid lengthy procedures which risk losing activity/reducing recovery 減少添加物減少添加物 additives may need to be

31、removed in an extra purification step or may interfere with activity assays 早期除去降解物（如蛋白酶）早期除去降解物（如蛋白酶） for example, proteases 每步使用不同的純化方法每步使用不同的純化方法 to take advantage of sample characteristics which can be used for separation (size, charge, hydrophobicity, ligand specificity)KEEP IT SIMPLE!盡量減少純化步驟盡

32、量減少純化步驟73四、蛋白質(zhì)的鑒定四、蛋白質(zhì)的鑒定 1. 濃度測(cè)定：濃度測(cè)定：凱氏定氮法、紫外吸收法凱氏定氮法、紫外吸收法 2. 純度測(cè)定：純度測(cè)定：電泳法電泳法 3. 特性測(cè)定：特性測(cè)定： 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量與等電點(diǎn)的測(cè)定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量與等電點(diǎn)的測(cè)定 氨基酸組成及順序分析氨基酸組成及順序分析 蛋白質(zhì)結(jié)晶與結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)結(jié)晶與結(jié)構(gòu)分析 蛋白質(zhì)活性及功能測(cè)定蛋白質(zhì)活性及功能測(cè)定741 濃度測(cè)定濃度測(cè)定凱氏定氮法凱氏定氮法紫外吸收法紫外吸收法分光光度法分光光度法考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)法751 濃度測(cè)定濃度測(cè)定凱氏定氮法：凱氏定氮法： 蛋白質(zhì)平均含氮量為蛋白質(zhì)平均含氮量為16，首先測(cè)定氮的，首先測(cè)定氮的含量，進(jìn)而估算蛋白質(zhì)的含量。含量，進(jìn)而估