內(nèi)吞與內(nèi)膜系統(tǒng)

1、植物細(xì)胞植物細(xì)胞胞吞作用胞吞作用和和內(nèi)膜系統(tǒng)內(nèi)膜系統(tǒng) 的熒光顯微觀察的熒光顯微觀察植物細(xì)胞的吞排作用植物細(xì)胞的吞排作用細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)所需要的物質(zhì)分別在細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)所需要的物質(zhì)分別在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(如蛋白質(zhì)、脂類如蛋白質(zhì)、脂類)和和高爾基體高爾基體(細(xì)胞壁的一些組分，如果膠、半纖維素細(xì)胞壁的一些組分，如果膠、半纖維素)合成，合成，運(yùn)輸小泡運(yùn)輸小泡胞吐作用分泌至胞外或質(zhì)膜上胞吐作用分泌至胞外或質(zhì)膜上，促進(jìn)，促進(jìn)新的細(xì)新的細(xì)胞膜胞膜和和細(xì)胞壁細(xì)胞壁的生長(zhǎng)的生長(zhǎng)n另一方面，在細(xì)胞擴(kuò)展增長(zhǎng)過程中一些另一方面，在細(xì)胞擴(kuò)展增長(zhǎng)過程中一些過剩的蛋白質(zhì)、多過剩的蛋白質(zhì)、多糖、細(xì)胞壁前體物質(zhì)糖、細(xì)胞壁前體物質(zhì)等細(xì)胞成

2、分，需要通過等細(xì)胞成分，需要通過胞吞作用胞吞作用重重新回到胞質(zhì)中使之得以新回到胞質(zhì)中使之得以及時(shí)回收，循環(huán)利用及時(shí)回收，循環(huán)利用， 即細(xì)胞的內(nèi)吞和外排兩個(gè)過程保持基本的相對(duì)平衡即細(xì)胞的內(nèi)吞和外排兩個(gè)過程保持基本的相對(duì)平衡n在整個(gè)膜泡吞排作用（在整個(gè)膜泡吞排作用（cytosis）中，必須有）中，必須有能量能量的保的保證。證。例如，例如，膜泡組裝形成過程中膜泡組裝形成過程中的小的小G蛋白，蛋白，運(yùn)輸過程運(yùn)輸過程中的中的細(xì)胞骨架及相應(yīng)的馬達(dá)蛋白，以及細(xì)胞骨架及相應(yīng)的馬達(dá)蛋白，以及膜融合過程膜融合過程中中Rab蛋白等蛋白等均發(fā)生均發(fā)生GTP或或ATP的水解反應(yīng)。的水解反應(yīng)。內(nèi)膜系統(tǒng)內(nèi)膜系統(tǒng)(endom

3、embrane systems) 內(nèi)膜系統(tǒng)是指內(nèi)膜系統(tǒng)是指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體高爾基體、囊泡囊泡、溶酶體溶酶體和和液液泡泡等細(xì)胞器。這些等細(xì)胞器。這些細(xì)胞器的膜是相互細(xì)胞器的膜是相互流動(dòng)的流動(dòng)的, 處于動(dòng)態(tài)處于動(dòng)態(tài)平衡平衡, 在功能上也在功能上也是相互協(xié)同的。是相互協(xié)同的。FM類染料類染料 nFM類染料是水溶性的苯乙烯類復(fù)合物，對(duì)細(xì)胞無毒性作用，類染料是水溶性的苯乙烯類復(fù)合物，對(duì)細(xì)胞無毒性作用，使用方便使用方便n常廣泛用于質(zhì)膜和囊泡等的各類研究常用的染料有常廣泛用于質(zhì)膜和囊泡等的各類研究常用的染料有FM1-43（Ex510/Em626）和）和FM4-64（Ex558/Em734）。）。nFM

4、類染料與類染料與質(zhì)膜質(zhì)膜及及內(nèi)膜細(xì)胞器內(nèi)膜細(xì)胞器特異結(jié)合后發(fā)出高強(qiáng)度的熒特異結(jié)合后發(fā)出高強(qiáng)度的熒光，需要借助光，需要借助胞吞作用胞吞作用才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。nFM4-64在水相中沒有熒光在水相中沒有熒光，只有插入脂質(zhì)生物膜后才顯示，只有插入脂質(zhì)生物膜后才顯示較強(qiáng)的熒光，胞吞回收的囊泡因吞進(jìn)細(xì)胞內(nèi)部而被熒光標(biāo)記，較強(qiáng)的熒光，胞吞回收的囊泡因吞進(jìn)細(xì)胞內(nèi)部而被熒光標(biāo)記，利用這種熒光探針能夠?qū)?xì)胞的胞吞過程進(jìn)行有效標(biāo)記。利用這種熒光探針能夠?qū)?xì)胞的胞吞過程進(jìn)行有效標(biāo)記。FM類染料染色原理類染料染色原理一、材料、試劑一、材料、試劑1.材料：材料： 煙草懸浮細(xì)胞煙草懸浮細(xì)胞 2.試劑：試劑：

5、1）煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基）煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基 2）FM4-64 （膜染料）（膜染料） 3）疊氮化鈉）疊氮化鈉 4）山梨醇）山梨醇 5）ER Tracker-Blue/White (內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特異染料內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特異染料) 二、實(shí)驗(yàn)步驟二、實(shí)驗(yàn)步驟n取取3個(gè)共聚焦專用培養(yǎng)皿，分別編號(hào)、；個(gè)共聚焦專用培養(yǎng)皿，分別編號(hào)、；n往中加入往中加入198 L 含含BY2細(xì)胞培養(yǎng)液（細(xì)胞培養(yǎng)液（1000mL移液器）移液器）和和2 L FM4-64；n往中加入往中加入178 L含含BY2細(xì)胞培養(yǎng)液（細(xì)胞培養(yǎng)液（1000mL移液器）移液器）和和20 L山梨醇山梨醇；n往中加入往中加入194 L含含BY2細(xì)胞培養(yǎng)液（細(xì)胞培

6、養(yǎng)液（1000mL移液器）移液器）和和4 L NaN3；n置顯微鏡下觀察中的熒光分布模式；置顯微鏡下觀察中的熒光分布模式；n觀察完畢中的觀察完畢中的FM4-64后再往中加入后再往中加入4 L ER Blue/white；n往、中分布加入往、中分布加入2 L FM4-64，隨后先觀察中的熒，隨后先觀察中的熒光分布；光分布；n接著再觀察中的熒光分布模式；接著再觀察中的熒光分布模式；n最后再次觀察中最后再次觀察中FM4-64、ER-Blue/White雙染下的熒雙染下的熒光分布。光分布。內(nèi)膜系統(tǒng)及內(nèi)吞作用的熒光標(biāo)記觀察內(nèi)膜系統(tǒng)及內(nèi)吞作用的熒光標(biāo)記觀察 取取3個(gè)共聚焦專用培養(yǎng)皿，分別編號(hào)、；個(gè)共聚焦專

7、用培養(yǎng)皿，分別編號(hào)、； 往中加入往中加入178 L含含BY2細(xì)胞培養(yǎng)液（細(xì)胞培養(yǎng)液（1000mL移液器）和移液器）和20 L山梨醇；山梨醇； 往中加入往中加入194 L含含BY2細(xì)胞培養(yǎng)液（細(xì)胞培養(yǎng)液（1000mL移液器）和移液器）和4 L NaN3； 往中加入往中加入198 L 含含BY2細(xì)胞培養(yǎng)液（細(xì)胞培養(yǎng)液（1000mL移液器）和移液器）和2 L FM4-64； 置顯微鏡下觀察中的熒光分布模式；置顯微鏡下觀察中的熒光分布模式； 觀察完畢中的觀察完畢中的FM4-64后再往中加入后再往中加入4 L ER Blue/white； 往、中分布加入往、中分布加入2 L FM4-64，隨后先觀察中的

8、熒光分布；，隨后先觀察中的熒光分布； 接著再觀察中的熒光分布模式；接著再觀察中的熒光分布模式； 最后再次觀察中最后再次觀察中FM4-64、ER-Blue/White雙染下的熒光分布。雙染下的熒光分布。三、結(jié)果與分析三、結(jié)果與分析正常正常BY2 的的FM4-64標(biāo)記標(biāo)記 FM4-64先標(biāo)記于先標(biāo)記于BY2外周，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)外周，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。逐漸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。疊氮化鈉疊氮化鈉處理的的處理的的BY2 的的FM4-64標(biāo)記標(biāo)記 疊氮化鈉能抑制疊氮化鈉能抑制BY2的的呼吸作用呼吸作用，進(jìn)而抑制細(xì)胞的，進(jìn)而抑制細(xì)胞的內(nèi)吞內(nèi)吞作用作用，導(dǎo)致，導(dǎo)致FM4-64不會(huì)進(jìn)入不會(huì)進(jìn)入BY2內(nèi)部，說明內(nèi)部，說明FM4-64是通過是通過內(nèi)吞作用內(nèi)吞作用而不是而不是擴(kuò)散擴(kuò)散進(jìn)入進(jìn)入BY2的。的。質(zhì)壁分離質(zhì)壁分離的的BY2 的的FM4-64標(biāo)記標(biāo)記 用山梨醇處理用山梨醇處理BY2 2-3分鐘，使分鐘，使BY2發(fā)生質(zhì)壁發(fā)生質(zhì)壁分離，證明分離，證明FM4-64是一種是一種膜膜染料。染料。 ER tracker-Blue/white和和FM4-64雙標(biāo)記雙標(biāo)記 細(xì)胞膜顯示紅色，而一部分細(xì)胞器顯示紫色（紅色細(xì)胞膜顯示紅色，而一部分細(xì)胞器顯示紫色（紅色藍(lán)色疊加）表明內(nèi)吞的藍(lán)色疊加）表明內(nèi)吞的FM染料部分進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。染料部分進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)報(bào)告1）