16S信息分析報告2-北京奧維森

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上 16srDNA信息分析1.標準信息分析（初級）1.1 基本數(shù)據(jù)處理（使用內(nèi)部撰寫的程序對原始的測序數(shù)據(jù)進行基本處理） 通過Illumina平臺（Miseq）進行Paired-end測序，下機數(shù)據(jù)經(jīng)過去除低質量reads(Q20, 90%標準過濾)，并trim掉reads2 尾部100bp 低質量序列；每個樣品數(shù)據(jù)產(chǎn)出詳細統(tǒng)計結果見下表：表1-1 reads數(shù)據(jù)統(tǒng)計：# Samples# HQ reads (total)# HQ reads (mean±SD)CA17110,6516,509±2,175HC19163,6908,615±3

2、,081LK13127,4169,801±2,858Total49401,7578,199±2,992注：原來的樣本中CA15由于原始Reads數(shù)太少（只有23條）而被刪除，因此目前的樣本總數(shù)為49個 1.2 去除 barcode 序列，引物序列及 tags過濾通過COPE軟件（Connecting Overlapped Pair-End，V1.2.3.3），利用重疊關系將雙末端測序得到的成對reads組裝成一條序列。利用內(nèi)部編寫程序去除兩端barcode 序列，引物序列。 Paired End Reads通過reads之間的overlap （19個堿基）關系拼接成Tags

3、；然后去掉barcode序列，引物序列。為了得到高質量的Tags，將拼接的Tags按照長度過濾，去嵌合體等的處理。(這里等的意思就是按照拼接條件過濾:1, 堿基的ASCII value值低于33的過濾掉。2.overlap取19個堿基，這19個堿基相互匹配率低于98%的過濾掉。3.去掉引物序列的時候，允許一個錯配，錯配多于一個的過濾掉。) 表1-2 tags的詳細信息Sample IDRaw Tag NumFinal Tag numHC11756017,319HC296729,604HC31805317,826HC41218112,107HC51155811,477HC81148811,404

4、HC91635416,095HC102158421,270HC1179897926HC121156111,449HC132490924,660HC142297922,736HC152074720,549HC161485714,728HC172117121,002HC181070010,605HC191135911,247CA81620316,040CA101092510,560CA1182547,690CA1294799,053CA1479477,584CA1682218,093CA171066610,479CA181078710,651CA51634416,154CA960475,861CA

5、131029010,1652 高級信息分析2.1 OUT及其豐度分析2.1.1 OUT統(tǒng)計 拼接的Tags經(jīng)過優(yōu)化后，在0.97相似度下利用qiime（v1.8.0）軟件將其聚類為用于物種分類的OTU(Operational Taxonomic Units)，統(tǒng)計各個樣品每個OTU中的豐度信息，OTU的豐度初步說明了樣品的物種豐富程度。49個樣品共產(chǎn)生3029個OTU，其中Singletons OTU（即豐度為1的OTU）個數(shù)為0，Non singletons OTU個數(shù)為3029。表4.樣品OUT統(tǒng)計SampleNameOTUsTagsHC154117,319HC22699,604HC353

6、017,826HC421512,107HC520611,477HC821411,404HC945516,095HC1060021,270HC1226211,449HC1329424,660CA1045310,560CA117107,690CA126509,053CA145197,584CA162408,093CA1733010,479CA1828910,651CA533616,154CA93475,861HC111427,926CA1326910,165表5 OTU 統(tǒng)計IndexOTU numNo. of OTUs3029Assigned to families1,708 Assigned

7、to genera1,172 Assigned to species314No. of OTUs per sample368±147Min no. of OTUs per sample127Max no. of OTUs per sample7192.1.2 OTU分布的韋恩圖如下：在0.97的相似度下，得到了每個樣品的OTU個數(shù)，利用R（v3.1.1）畫圖軟件繪出Venn圖可以展示多樣品共有和各自特有OTU數(shù)目，直觀展示樣品間OTU的重疊情況。結合OTU所代表的物種，可以找出不同環(huán)境中的核心微生物。圖2-1 OTU venn 分析。不同顏色圖形代表不同樣品或者不同組別，不同顏色圖形

8、之間交疊部分數(shù)字為兩個樣品或兩個組別之間共有的OTU個數(shù)。同理，多個顏色圖形之間交疊部分數(shù)字為多個樣品或組別之間共有OTU個數(shù)。Venn圖容許2-5個樣品或組別。2.1.3 OUT水平的PCA圖如下：R（v3.1.1）畫圖軟件PCA 分析(Principal Component Analysis)，即主成分分析，是一種分析和簡化數(shù)據(jù)集的技術。主成分分析經(jīng)常用于減少數(shù)據(jù)集的維數(shù)，同時保持數(shù)據(jù)集中的對方差貢獻最大的特征。這是通過保留低階主成分，忽略高階主成分做到的。這樣低階成分往往能夠保留住數(shù)據(jù)的最重要方面。通過分析不同樣品OTU（97%相似性）組成可以反映樣品的差異和距離，PCA運用方差分解，將

9、多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標圖上，坐標軸取能夠最大反映方差值兩個特征值。如果兩個樣品距離越近，則表示這兩個樣品的組成越相似。不同處理或不同環(huán)境間的樣品可能表現(xiàn)出分散和聚集的分布情況，從而可以判斷相同條件的樣品組成是否具有相似性。圖2-2 基于OTU豐度的PCA分析。橫坐標表示第一主成分，括號中的百分比則表示第一主成分對樣品差異的貢獻值；縱坐標表示第二主成分，括號中的百分比表示第二主成分對樣品差異的貢獻值。圖中點分別表示各個樣品。不同顏色代表樣品屬于不同的分組。2 .2 Core microbiome分析圖表都是通過qiime（v1.8.0）軟件得到的共有OTU數(shù)與樣本數(shù)的關系：圖2-3 覆蓋所

10、有樣本的微生物組。橫坐標表示樣品占的比率，縱坐標表示包含OUT的數(shù)目。 這些樣本的core microbiome（即覆蓋所有樣本的微生物組）共包含17個OTUs，其物種分類信息如下表2-1。表2-1 覆蓋所有樣本的OTUsOTUTaxonomy levelTaxonomy nameGenusStreptococcusGenusCapnocytophagaSpeciesdisparGenusCampylobacterGenusFusobacteriumGenusStreptococcusGenusStreptococcusGenusPeptostreptococcusGenusGranulica

11、tellaGenusCampylobacterGenusNeisseriaGenusFusobacterium2008GenusNeisseria21908GenusNeisseriaGenusCampylobacterFamilyGemellaceae1212GenusGranulicatella2.3 生物多樣性分析2.3.1 單個樣品復雜性分析通過計算Shannon index, Chao1 index, Phylogenetic diversity (PD, whole tree) 和observed number of species共四個指數(shù)來進行生物多樣性分析。通過qiime（v

12、1.8.0）軟件計算樣品的Alpha多樣性值并用R（v3.1.1）軟件做出相應的稀釋曲線，盒型圖。稀釋曲線是利用已測得16S rDNA序列中已知的各種OTU的相對比例，來計算抽取n個（n小于測得Reads序列總數(shù)）Tags時各Alpha指數(shù)的期望值，然后根據(jù)一組n值（一般為一組小于總序列數(shù)的等差數(shù)列）與其相對應的Alpha指數(shù)的期望值繪制曲線。如樣品有提供分組信息，且每組樣品個數(shù)不小于3，將對組間的Alpha多樣性指數(shù)進行差異分析。差異分析的檢驗方法為秩和檢驗，如果組數(shù)為2，采用兩樣品比較的Wilcoxon Rank-Sum Test（R中的wilcox.test）；如果組數(shù)大于2，采用多樣品

13、比較的Kruskal-Wallis Test（R中的kruskal.test）。最后利用Alpha多樣性指數(shù)繪制盒形圖。差異分析與作圖均通過R軟件（v3.1.1）進行。 基于 OTU 的結果，我們計算了樣品的 Alpha 多樣性（表2-2）。Alpha 多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析。chao1多樣性估算指數(shù)是根據(jù)所測得的 tags 數(shù)和 OTU 的數(shù)量以及相對比例來預測樣品中微生物的種類（OTU 的數(shù)量），是基于已知結果所得相對值。Shannon 指數(shù)是一個綜合 OTU 豐度和 OTU 均勻度兩方面因素的一個多樣性指數(shù)，Shannon 及observed number of speci

14、es、 Phylogenetic diversity (PD, whole tree) 指數(shù)越大，則表示該樣品中的物種越豐富。表2-2 樣品的 Alpha 多樣性#Alphamean(CA)mean(HC)mean(LK)Pvalue(KW)p-vaule(CA-HC)p-vaule(CA-LK)p-vaule(HC-LK)chao1488.357.422.0.0.0.0.observed_species243.161.199.0.0.0.0.PD_whole_tree16.13.15.0.0.0.0.shannon3.2.3.0.0.0.0.Rarefaction分析（樣本不分組）：圖2-4

15、 單個樣品內(nèi)的Alpha 多樣性Rarefaction分析（樣本分組）：圖2-5 每組樣品內(nèi)的Alpha 多樣性。圖中紅色,黃色,藍色線分別表示CA, HC, LK組的rarefaction分析結果圖2-6為組Alpha多樣性盒形圖，更直觀顯示組間Alpha多樣性差異。盒形圖可以顯示5個統(tǒng)計量（最小值，第一個四分位數(shù)，中位數(shù)，第三個中位數(shù)和最大值，及由下到上的5條線），異常值以“º”標出。 Alpha多樣性的比較，以Shannon index為例可以看出多樣性CA>LK>HC，其中CA/HC有明顯差異(P=0.008, Students t test)，而CA/LK, H

16、C/LK差異不顯著2.3.2 樣品間復雜度比較分析Beta多樣性（Beta diversity）分析是用來比較一對樣品在物種多樣性方面存在的差異大小。本分析中通過QIIME（v1.8.0）軟件，采用迭代算法，分別在加權物種分類豐度信息和不加權物種分類豐度信息的情況下，隨機抽取各樣品中75% Reads單獨進行差異計算，迭代100次之后綜合統(tǒng)計得到最終的統(tǒng)計分析結果表及PCoA展示圖。Beta多樣性熱圖使用R（v3.1.1）軟件中的NMF包的aheatmap進行作圖。 UniFrac是通過利用系統(tǒng)進化的信息來比較樣品間的物種群落差異。其計算結果可以作為一種衡量beta diversity的指數(shù)，

17、它考慮了物種間的進化距離，該指數(shù)越大表示樣品間的差異越大。報告中給出的UniFrac結果分為加權UniFrac（weighted UniFrac）與非加權UniFirac（unweighted UniFrac）2種，其中weighted UniFrac考慮了序列的豐度，unweighted UniFrac不考慮序列豐度。 從下面盒形圖看，CA組內(nèi)的物種豐度最大。Weighted Unifrac 圖2-7 Beta多樣性的盒形圖Unweighted UnifracUnifrac距離的主坐標分析(PCoA)如下：Weighted UnifracUnweighted Unifrac圖2-8 Beta

18、多樣性的主坐標分析(PCoA)圖。 如果兩個樣品距離越近，則表示這兩個樣品的組成越相似。不同處理或不同環(huán)境間的樣品可能表現(xiàn)出分散和聚集的分布情況，從而可以判斷相同條件的樣品組成是否具有相似性。圖2-9 UniFrac距離分布heatmap。通過對UniFrac結果的聚類，具有相似beta多樣性的樣品聚類在一起，反應了樣品間的相似性。2.3.3 物種組成分析本分析中分組后各水平的分類比較柱形圖是用QIIME（v1.8.0）軟件得到的，單個樣品的群落分布柱形圖和盒型圖是根據(jù)QIIME（v1.8.0）軟件計算的結果用R（v3.1.1）軟件畫的。 樣品的群落分布圖，直觀的反應各樣品的群落組成。從門水平

19、的群落分布圖中可以看出，在這批樣品中，占主要地位的門有 Firmicutes，Proteobacteria。2.3.3.1 門(phylum)水平比較 圖2-10 分組后門水平的分類比較。從左至右分別為CA,HC,LK的物種組成。 圖2-11樣品的門水平群落分布圖2.3.3.2 綱(class)水平比較圖2-12 分組后綱水平的分類比較。從左至右分別為CA,HC,LK的物種組成。 圖2-13樣品的綱水平群落分布圖2.3.3.3 屬(genus)水平比較 圖2-14樣品的屬水平群落分布圖含量最高的25個屬的物種組成如下： 可以看出，這些樣本中含量最高的屬為Streptococcus, Neiss

20、eria, Neisseriaceae (family), Campylobacter, Bacillus, Gemellaceae, TM7-32.3.4 多組樣本的比較分析下面的表格都是通過QIIME（v1.8.0）軟件計算出的，熱圖是用R（v3.1.1）軟件畫的。2.3.4.1.1 OTU水平的比較分析下表是在不同組樣本間有顯著差異的OTUs（P<0.05, Kruskal-Wallis test），共35個OTUP valueCA_meanHC_meanLK_meanLineage0.0.0.0.s_Streptococcus_infantis0.1.334E-059.02E-0

21、53.309E-05s_Streptococcus_infantisCU.OTU36090.0.4.302E-057.37E-05s_Streptococcus_infantisCU.OTU39510.0.0.0.s_Streptococcus_infantis0.4.506E-052.515E-050.s_Selenomonas_noxia0.0.2.728E-053.53E-05s_Prevotella_tannerae0.0.0.0.s_Haemophiluspara_influenzae0.4.681E-057.871E-050.s_Capnocytophaga_ochraceaCU.

22、OTU15120.0.5.314E-054.729E-05s_Campylobacter_rectusCU.OTU42480.3.144E-053.67E-050.s_Actinobacillus_porcinusCU.OTU46690.0.00.o_LactobacillalesCU.OTU28840.0.0.0.o_Gemellales0.0.0.0.g_Streptococcus0.1.213E-057.16E-050.g_Streptococcus0.0.2.432E-054.272E-05g_Streptococcus0.0.0.0.g_Prevotella0.0.2.607E-05

23、5.232E-05g_Leptotrichia0.08.912E-050.g_Cardiobacterium0.0.0.0.g_Capnocytophaga0.0.7.529E-050.g_Capnocytophaga0.0.00.g_BacillusOTU190.0.0.0.g_Abiotrophia0.0.0.0.f_StreptococcaceaeCU.OTU44370.6.529E-055.103E-060.f_StreptococcaceaeOTU20.4.005E-059.346E-060.f_PasteurellaceaeCU.OTU38810.0.6.821E-050.f_Ne

24、isseriaceaeCU.OTU20270.0.8.193E-050.f_Neisseriaceae0.0.0.0.01988f_GemellaceaeCU.OTU1600.0.8.61E-063.201E-05f_Clostridiaceae0.0.0.0.f_Clostridiaceae6.38E-056.461E-058.711E-050.f_Carnobacteriaceae0.0.0.0.f_Carnobacteriaceae0.0.0.0.f_CarnobacteriaceaeOTU100.0.00.c_BacilliCU.OTU310.0.2.232E-053.781E-05 p_Firmicutes2.3.4.2 屬水平的比較分析首先，PCA分析能夠看出3組樣本之間有一定程度的差異：其次，通過Kruskal-Wallis test分析可以找出在不同組間有明顯差異(P<0.05)的屬如下（共19個