免疫標(biāo)記技術(shù)

1、免疫標(biāo)記技術(shù)第一頁，共36頁。 第一節(jié)第一節(jié) 免疫標(biāo)記技術(shù)的基本概念免疫標(biāo)記技術(shù)的基本概念一、免疫標(biāo)記與標(biāo)記免疫的概念二、常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)第二頁，共36頁。 免疫標(biāo)記與免疫標(biāo)記與標(biāo)記免疫標(biāo)記免疫免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)：標(biāo)記物與免疫活性物質(zhì)的聯(lián)接技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)：以標(biāo)記免疫物質(zhì)檢測相應(yīng)靶物質(zhì)的技術(shù)第三頁，共36頁。免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù) =示蹤物標(biāo)記示蹤物標(biāo)記第四頁，共36頁。常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)類別 標(biāo)記物 用途熒光素 FITC、RB200、TRITC 免疫組化 鑭系元素螯合物 免疫分析測定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析測定 125I、1

2、31I酶 HRP、AP 免疫組化 免疫分析測定化學(xué)發(fā)光物 Luminol、lucigenin 免疫分析測定金屬顆粒 膠體金、鐵蛋白 免疫組化 免疫分析測定 第五頁，共36頁。 第第二二節(jié)節(jié) 標(biāo)記免疫技術(shù)的分類標(biāo)記免疫技術(shù)的分類一、按指示標(biāo)記物質(zhì)劃分的類型二、按測定方式劃分的類型三、按測定用途劃分的類型第六頁，共36頁。1、酶免疫技術(shù)2、熒光免疫技術(shù)3、放射免疫技術(shù)4、金免疫技術(shù)按指示標(biāo)記物質(zhì)劃分的類型按指示標(biāo)記物質(zhì)劃分的類型第七頁，共36頁。1、均相型（homogenous）2、非均相型（heterogeneous）按測定方式劃分的類型按測定方式劃分的類型第八頁，共36頁。均相型（均相型（ho

3、mogenous）非均相型（非均相型（heterogeneous）第九頁，共36頁。1、免疫測定技術(shù)2、免疫組化技術(shù)按測定用途劃分的類型按測定用途劃分的類型第十頁，共36頁。 第第三三節(jié)節(jié) 酶標(biāo)記技術(shù)酶標(biāo)記技術(shù)一、常用標(biāo)記方法二、標(biāo)記免疫物的分離與鑒定第十一頁，共36頁。常用標(biāo)記方法常用標(biāo)記方法1、常用酶 辣根過氧化物酶（HRP） 堿性磷酸酶（AP）2、標(biāo)記方法 戊二醛交聯(lián)法 過碘酸鹽氧化法第十二頁，共36頁。戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法 (一步法）一步法）抗體-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶抗體-NH2 =CH-（

4、CH2）3-CH = NH2-抗體酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶第十三頁，共36頁。戊二醛交聯(lián)法（二步法）戊二醛交聯(lián)法（二步法）COH-（CH2）3-COH + NH2-酶抗體-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶第十四頁，共36頁。過碘酸鹽氧化法過碘酸鹽氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+ NH2抗體OOONN抗體抗體H2ON抗體NaBH4Schiff堿酶-五炭糖環(huán)第十五頁，共36頁。標(biāo)記免疫物的分離與鑒定標(biāo)記免疫物的分離與鑒定1、分離 目的：去除游離酶 方法：鹽析、柱層析2、鑒定

5、 抗體活性 酶活性 標(biāo)記物純度第十六頁，共36頁。 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)enzyme linked immunosorbent assay （ ELISA ）第十七頁，共36頁。ELISAELISA基本的實(shí)驗(yàn)過程基本的實(shí)驗(yàn)過程第十八頁，共36頁。ELISA技術(shù)的原理與方法技術(shù)的原理與方法間接法 夾心法 競爭法第十九頁，共36頁。間接法間接法第二十頁，共36頁。夾心法夾心法第二十一頁，共36頁。競爭法競爭法第二十二頁，共36頁。 第第四四節(jié)節(jié) 熒光標(biāo)記技術(shù)熒光標(biāo)記技術(shù)一、常用標(biāo)記方法二、標(biāo)記免疫物的分離與純化第二十三頁，共36頁。常用標(biāo)記方法常用標(biāo)記方法1、熒光素的概念2、生物標(biāo)記熒

6、光素的要求3、常用熒光素標(biāo)記原理與方法 第二十四頁，共36頁。生物標(biāo)記熒光素的要求生物標(biāo)記熒光素的要求1、具有與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的能力2、熒光效率高3、能與背景物質(zhì)形成鮮明對(duì)比4、不影響蛋白質(zhì)的生物、免疫活性5、標(biāo)記方法安全、簡便6、標(biāo)記物穩(wěn)定，易保存第二十五頁，共36頁。熒光抗體技術(shù)的原理與方法熒光抗體技術(shù)的原理與方法直接法間接法補(bǔ)體法雙標(biāo)記法 第二十六頁，共36頁。直接法間接法補(bǔ)體法雙標(biāo)記法第二十七頁，共36頁。標(biāo)記免疫物的分離與鑒定標(biāo)記免疫物的分離與鑒定1、分離 目的：去除游離熒光素 方法：柱層析2、鑒定 抗體活性 標(biāo)記物結(jié)合度 F/P比值的應(yīng)用意義第二十八頁，共36頁。 第第五五節(jié)節(jié) 放

7、射性核素標(biāo)記技術(shù)放射性核素標(biāo)記技術(shù)一、常用標(biāo)記方法二、標(biāo)記免疫物的分離與純化第二十九頁，共36頁。直接法（氯胺直接法（氯胺T T法）法）OH-NHCHONH-CH2OH-NHCHONH-CH2Na125I 4。C125I氯胺T第三十頁，共36頁。間接法（連接法）間接法（連接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2+ Na125I氯胺T125INSHPP第三十一頁，共36頁。結(jié)合相游離相放射免疫分析法的原理與方法放射免疫分析法的原理與方法第三十二頁，共36頁。常用標(biāo)記方法常用標(biāo)記方法1、常用放射性

8、核素2、125I 的標(biāo)記方法 直接法（氯胺T法） 間接法（連接法）第三十三頁，共36頁。標(biāo)記免疫物的分離與鑒定標(biāo)記免疫物的分離與鑒定1、分離 目的：去除游離放射性核素 方法：柱層析2、鑒定 游離放射性核素含量 免疫活性 比放射性（mCi/mg）應(yīng)用意義第三十四頁，共36頁。第六節(jié)第六節(jié) 膠體金標(biāo)記免疫技術(shù)膠體金標(biāo)記免疫技術(shù) (金標(biāo)法金標(biāo)法) 膠體金是由氯化金與還原劑反應(yīng)形成的一種膠體顆粒，具有吸附蛋白質(zhì)的特性(可以標(biāo)記Ag或Ab)； 膠體金顆粒具有呈色性，中等大小的膠體金顆粒呈現(xiàn)酒紅色。 膠體金標(biāo)記免疫技術(shù)是將金顆粒光學(xué)檢測的靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合。第三十五頁，共36頁。膠體金免疫法與膠體金免疫法與RIA、EL