甲胎蛋白檢測實驗

1、臨五1507 吳冠樺甲胎蛋白檢測實驗 20162016年年1212月月2828日日Part 1Part 2Part 3目錄實驗步驟實驗目的實驗原理結果與分析Part 4實際應用Part 51.判斷該方法檢測甲胎蛋白的難易程度。2.實驗該方法是否便于作為臨床檢測甲胎蛋白使用。實驗目的實驗原理原理 與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳被檢測物是蛋白質“探針”是抗體“顯色”用標記的二抗。 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(Acr)、N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)和催化劑(AP)、加速劑(TEMED聚合成的三維網孔結構(凝膠）。據有無濃

2、縮效應可將電泳分為兩類： (1)連續(xù)系統(tǒng)：緩沖液pH值、凝膠濃度相同，帶電粒子靠電荷及分子篩效應區(qū)分。 (2)不連續(xù)系統(tǒng)：緩沖離子成分、 pH值、凝膠濃度不同，帶電粒子在電場中由電效應、 分子篩效應、濃縮效應區(qū)分。 SDS-PAGE的原理是：依靠SDS帶有大量負電荷來掩蓋蛋白質表面的凈電荷：同時由于在電泳溶液中加入了SDS和巰基乙醇，因此它還可以改變蛋白質構象：原理原理 以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。技術流程實驗步驟(一)蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠電泳1.制膠 （1

3、）將配制好的分離膠液倒入兩塊玻璃板之間的凝膠室中，待膠液加至距短玻璃板 頂端約1.5cm處時停止灌膠，然后在膠液表面上小心加入厚約0.5cm的水層 （2）待凝膠和水之間出現(xiàn)清晰界面時，說明分離膠已聚合 ，大約30min完成聚合。傾去分離膠上層的水，將配制好的濃縮膠液加到分離膠上，至接近短玻璃板的頂端 ，插上樣品梳，放置待其聚合。30丙烯酰胺貯備液：29.2g 丙烯酰胺，0.8g 甲叉雙丙烯酰胺，加重蒸水至100ml。濃縮膠緩沖液：0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8。分離膠緩沖液：3mol/L Tris-HCl，pH8.9。10過硫酸銨：臨用前用蒸餾水配制。10SDS10TEMED封

4、閉液及抗體稀釋液：5脫脂奶粉-TBS，每組配10ml。底物溶液：2.5mg二氨基聯(lián)苯胺（DAB）+ 10mlTBS +10l H2O2，臨用前配制。電極緩沖液：甘氨酸 11.28g, SDS 0.4g, Tris 2.4g, 加水至800ml，pH8.3。樣品緩沖液：0.1mol/L Tris-HCl緩沖液，pH6.8，20甘油，4SDS，10巰基乙醇，0.005溴酚蘭。TBS（Tris-HCl,NaCl）緩沖液：20mmol/L Tris-HCl,500mmol/L NaCl，pH7.5，每組配150ml。TBST：取100mlTBS，加250l 20Tween-20。材料及常用試劑(二)蛋

5、白質從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉移至固相支持體 1.放置NC膜和膠條：.切割與膠尺寸相符的硝酸纖維素膜，用甲醇浸泡15s,水2min,再浸入轉移緩沖液中。.準備2張濾紙和海綿一起浸泡在轉移緩沖液中。打開轉移轉移槽的膠板，依次放入：a.一張浸濕的海綿 b. 一張浸濕的濾紙c. 用轉移緩沖液沖洗過的膠，并小心地趕走濾紙和膠之間的氣泡d. 硝酸纖維素膜，在膜的右下角剪一小角，以標明電泳方向e. 一張浸濕的濾紙f. 一張浸濕的海綿。 2.配制電極緩沖液：甘氨酸 14.1g，SDS 0.5g，Tris 3g，加水至1000ml，pH8.3。每組配1000ml。 3.制 樣：5l人血清，加45l水，再加50l

6、加樣緩沖液。沸水浴加熱8分鐘，10000rpm離心2分鐘,取上清液作為樣品。另按說明書制備好蛋白質分子量標準樣品。 4.加 樣： （1）加入電極緩沖液，拔出膠的樣品梳； （2）選3個樣品槽，用微量進樣器加樣，中間槽加入5l分子量標準蛋白樣品，兩旁槽各加入10l人血清樣品。 5.電泳 穩(wěn)壓120V/200V電泳，當溴酚藍前沿到達距底部0.5cm左右時，停止電泳。(二)蛋白質從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉移至固相支持體 按膠側為負極，膜側為正極的方向放入轉移電泳槽中，加轉移緩沖液至滿。插好轉移電泳裝置的電極，打開電泳儀開關調至穩(wěn)壓130V，電轉1h，轉移結束后打開膠板取出硝酸纖維素薄膜。(三)對固定于硝

7、酸纖維素濾膜上的甲胎蛋白進行染色1.封閉：加封閉液1ml，37搖床上搖動1h. （1）與第一抗體結合 棄封閉液，加入適當稀釋的1ml第一抗體溶液，封口后37搖床上輕輕搖動2h。取出膜，用TBST洗膜3次，每次5min。再封入一新的塑料薄膜袋內。 （2）與酶標第二抗體結合 加入適當稀釋的1ml辣根過氧化物酶標記，37搖床上輕輕搖動1h。取出膜，用TBST洗3次，每次5min，最后用TBS溶液洗1次，以去除Tween-20。2. 加底物溶液顯色 將膜浸入10ml底物溶液中，至顯色清楚后，用水清洗，以除去多余的底物。轉入水中保存。 辣根過氧化物酶最敏感的底物是3,3-二氨基聯(lián)苯胺，它在過氧化物酶所在

8、部位轉變成棕色沉淀。在鈷或鎳離子存在下進行反應可以加深沉淀的顏色并提高反應的靈敏度。但是，使用辣根過氧化物酶不可能完全排除背景顏色，因此須十分小心地觀察生色反應，一旦特異性染色蛋白帶清晰可見，就應盡快終止生色反應。（四）化學發(fā)光、顯影、定影（四）化學發(fā)光、顯影、定影1.1.將超敏型將超敏型ECLECL試劑倒在保鮮膜上；試劑倒在保鮮膜上；1 min1 min后，將膜蛋白面朝下后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；與此混合液充分接觸；1 min1 min后，將膜移至另一保鮮膜上，去后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入盡殘液，包好，放入X-X-光片夾中。光片夾中。 2. 2. 在暗室中，將

9、在暗室中，將1 1份顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅份顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出燈下取出X X光片，用切紙刀剪裁適當大?。ū饶さ拈L和寬均光片，用切紙刀剪裁適當大?。ū饶さ拈L和寬均需大需大1 cm1 cm）；）；打開打開X-X-光片夾，把光片夾，把X X光片放在膜上，一旦放上，光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關上便不能移動，關上X-X-光片夾，開始計時；根據信號的強弱適當光片夾，開始計時；根據信號的強弱適當調整曝光時間，一般為調整曝光時間，一般為1 min1 min或或5 min5 min，也可選擇不同時間多次也可選擇不同時間多次壓片，以達最佳效果；曝光完成后，打開壓片，以達最佳效果；曝光完成后，打開X-X-光片夾，取出光片夾，取出X-X-光光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時間一般為影。顯影時間一般為1 12 min2 min（20202525），），溫度過低時（低溫度過低時（低于于1616）需適當延長顯影時間；顯影結束后，馬上把）需適當延長顯影時間；顯影結束后，馬上把X-X-光片浸光片浸入定影液中，定影時間一般為入定影液中，定影時間一般為5 51