放射示蹤及自顯影

1、放射性核素標記化合物放射性核素標記化合物定義：定義：放射性核素標記化合物（放射性核素標記化合物（radionuclide labelled compound）指在化合物分子中引入可起示蹤作用的放射性核指在化合物分子中引入可起示蹤作用的放射性核素，并保持原有化合物的理化和生物學性質不變。素，并保持原有化合物的理化和生物學性質不變。 1、放射性濃度、放射性濃度(radioactive concentration)：指單位體積的溶液：指單位體積的溶液中所含有的放射性活度。以中所含有的放射性活度。以Bq/L或或Bq/ml等表示。等表示。 2、放射化學純度、放射化學純度(radiochemical pu

2、rity)：指所指定（規(guī)定化學：指所指定（規(guī)定化學形式）的放射性標記化合物的放射性活度占該樣品的總放射性活形式）的放射性標記化合物的放射性活度占該樣品的總放射性活度的百分比。要求放化純度要達到度的百分比。要求放化純度要達到95%以上。以上。 放化純度放化純度(%)=(標記物的放射性活度標記物的放射性活度)/(樣品總的放射性活樣品總的放射性活度度)100%。 4、放射性核素純度：是指特定的放射性核素的放射性活度占總、放射性核素純度：是指特定的放射性核素的放射性活度占總放射性活度的百分比。放射性活度的百分比。 放射性核純度放射性核純度(%)=(特定放射性核素的活度特定放射性核素的活度)/(樣品的總

3、放射性樣品的總放射性活度活度)100% 一般要求放射性核素純度要達到一般要求放射性核素純度要達到99%以上。以上。 5、化學純度、化學純度(chemical purity)：指某一化學形式存在的物質量：指某一化學形式存在的物質量在該樣品的總重量中所占的百分比。在該樣品的總重量中所占的百分比。同位素標記與非同位素標記同位素標記與非同位素標記 1、同位素標記、同位素標記(isotopic labeling)：指化合物中的某一穩(wěn)定核素：指化合物中的某一穩(wěn)定核素被其放射性同位素置換。比如用被其放射性同位素置換。比如用3H取代化合物分子中的取代化合物分子中的1H。 2、非同位素標記、非同位素標記(non

4、-isotopic labeling)：采用并非原化合物所：采用并非原化合物所含元素的放射性核素進行標記而稱之。如蛋白質用含元素的放射性核素進行標記而稱之。如蛋白質用131I或或125I標標記，所得標記物與原來化合物不完全相同。記，所得標記物與原來化合物不完全相同。定位標記與非定位標記定位標記與非定位標記 1、定位標記定位標記(specific labeling)：指標記原子標記在化合物的指：指標記原子標記在化合物的指定位置上，以符號定位置上，以符號“S”表示。例如表示。例如1(S)- 14C-醋酸，表示醋酸，表示14C標記在標記在醋酸羧基碳上，即醋酸羧基碳上，即CH3 14COOH。 2、非

5、定位標記非定位標記(non-specific labeling)：指標記原子可標記在化：指標記原子可標記在化合物分子的任意部位上。它又可分為均勻標記和全標記。合物分子的任意部位上。它又可分為均勻標記和全標記。 均勻均勻標記標記(uniform labeling)是指放射性原子均勻地分布于分子中，以是指放射性原子均勻地分布于分子中，以“U”表示。表示。全標記全標記(general labeling)是指放射性核素的原子隨機地無嚴格定位是指放射性核素的原子隨機地無嚴格定位地分布于被標記化合物分子結構上，以地分布于被標記化合物分子結構上，以“G”表示，又稱普通標記。表示，又稱普通標記。如氚標記化合物

6、，標記分子中的所有氫原子都可被取代，但機率如氚標記化合物，標記分子中的所有氫原子都可被取代，但機率各不相同。如各不相同。如G-3H-膽固醇。膽固醇。雙標記及多標記雙標記及多標記(double labeling and multiple labeling) 指在化合物分子的不同部位，引入二種或二種以上元素的同位素原子(如3H、14C)或引入一種元素的兩種或兩種以上同位素原子。雙標記及多標記在同一機體或離體組織中可以同時觀察兩個指標。 放射性核素的選擇放射性核素的選擇 1、適宜的、適宜的T1/2；根據實驗目的和實驗設計選用合適的物理半衰期；根據實驗目的和實驗設計選用合適的物理半衰期 2、射線種類：

7、一般都選、射線種類：一般都選射線，其次是射線，其次是射線，射線，極少用；極少用； 3、合適的能量：體內示蹤宜選用中等能量、合適的能量：體內示蹤宜選用中等能量射線，體外示蹤無特射線，體外示蹤無特別要求；別要求； 4、穩(wěn)定性要好，不脫標，不發(fā)生嚴重的輻射自分解；、穩(wěn)定性要好，不脫標，不發(fā)生嚴重的輻射自分解； 5、其它：要求標記容易，價格可以接受，對產生射線的防護容易、其它：要求標記容易，價格可以接受，對產生射線的防護容易 放射性核素標記化合物的制備放射性核素標記化合物的制備1、同位素交換法同位素交換法：將需要標記的化合物：將需要標記的化合物AX和放射性化合物和放射性化合物BX*在在一定的條件下混合

8、，一定的條件下混合，X與與X*之間發(fā)生交換反應生成標記化合物之間發(fā)生交換反應生成標記化合物AX*，反應式如下：反應式如下： AX+BX*AX*+BX 如如125I-鄰碘馬尿酸鈉鄰碘馬尿酸鈉2、化學合成法化學合成法：以簡單的放射化合物作原料，通過一定的化學反：以簡單的放射化合物作原料，通過一定的化學反應后，把放射性原子結合在指定的位置上，得到所需要的，帶放射應后，把放射性原子結合在指定的位置上，得到所需要的，帶放射性的化合物。該法是放射標記化合物制備的主要方法。性的化合物。該法是放射標記化合物制備的主要方法。 3、生物合成法生物合成法：是將簡單的放射性化合物在體內或體外置于生物：是將簡單的放射性

9、化合物在體內或體外置于生物(動植物或微生物動植物或微生物)生長的環(huán)境中，利用生物體在代謝過程中對它的生長的環(huán)境中，利用生物體在代謝過程中對它的吸收利用而制得某些標記化合物。它又分為全生物合成與酶促合成吸收利用而制得某些標記化合物。它又分為全生物合成與酶促合成兩種方法。兩種方法。 (1)全生物合成全生物合成：常采用細菌、綠藻、酵母等低等生物來進行，這：常采用細菌、綠藻、酵母等低等生物來進行，這些低等生物很容易在實驗室內培育，且代謝活潑，繁殖迅速，因而些低等生物很容易在實驗室內培育，且代謝活潑，繁殖迅速，因而制備效率高，成本很低。制備效率高，成本很低。 (2)酶促合成酶促合成：可使用純酶，酶制劑或

10、含有酶的組織促進合成反應，：可使用純酶，酶制劑或含有酶的組織促進合成反應，也可以看作是應用也可以看作是應用 4、絡（螯）合物生成法：根據金屬離子生成絡合物原理，將放射、絡（螯）合物生成法：根據金屬離子生成絡合物原理，將放射性金屬離子和特定功能化合物進行絡合反應，標記快速、定量、簡性金屬離子和特定功能化合物進行絡合反應，標記快速、定量、簡便。便。14C（5730年）標記化合物合成：年）標記化合物合成：化學合成化學合成 、全生物合成、酶促、全生物合成、酶促合成合成3H（12.35年）標記化合物合成：年）標記化合物合成：同位素交換法（氚氣暴射交換、同位素交換法（氚氣暴射交換、催化交換）催化交換）化學

11、合成（催化加氫、鹵素置換、氚化金屬還原法）、酶促合成化學合成（催化加氫、鹵素置換、氚化金屬還原法）、酶促合成131I和和125I標記化合物的制備標記化合物的制備 ：125I是廣泛用于體外放射分析試劑的標記制備，它的特點是，是廣泛用于體外放射分析試劑的標記制備，它的特點是，T1/2為為60天，天，核豐度高核豐度高(95%)，能發(fā)射能發(fā)射28 kev和和35 kev能量能量的的射線射線(能量不高能量不高)，穩(wěn)定好。穩(wěn)定好。碘標記方法：碘標記方法： (一一) 125I標記蛋白和多肽標記蛋白和多肽1、氯胺氯胺-T法法：氯胺：氯胺T(N-氯代對甲苯磺酰胺鈉鹽氯代對甲苯磺酰胺鈉鹽)是一種氧化劑是一種氧化劑

12、使放射性使放射性Na I溶液中的溶液中的I-氧化成氧化成 I2，然后取代酪氨酸殘基芳香環(huán)上，然后取代酪氨酸殘基芳香環(huán)上的氫。的氫。2 、乳過氧化物酶法乳過氧化物酶法：過氧化物酶催化過氧化氫生成氧氣，氧化：過氧化物酶催化過氧化氫生成氧氣，氧化I-成成 (I2)，然后取代酪氨酸殘基芳香環(huán)上的氫。，然后取代酪氨酸殘基芳香環(huán)上的氫。3、固相氧化法固相氧化法：將氧化物（：將氧化物（Iodogen）或過氧化物酶制成固體顆粒）或過氧化物酶制成固體顆粒或交聯在固體支持物上進行液或交聯在固體支持物上進行液-固氧化反應。固氧化反應。4、聯接標記聯接標記： 將將125I標記在活潑試劑（含酰基化合物）上，后通標記在活

13、潑試劑（含?；衔铮┥希笸ㄟ^（?；c蛋白或多肽的游離氨基）縮合反應制成。過（?；c蛋白或多肽的游離氨基）縮合反應制成。 （二）（二）同位素交換法同位素交換法 含碘有機化合物與無機放射性碘化物發(fā)生同含碘有機化合物與無機放射性碘化物發(fā)生同位素交換反應而制成位素交換反應而制成 。AI+NaI*AI*+NaI 131I-MIBG間碘芐胍間碘芐胍32P、33P、35S標記化合物制備：標記化合物制備：化學合成化學合成 、生物合成、酶促合成、生物合成、酶促合成、同位素交換法同位素交換法32P-核苷酸合成：核苷酸合成： - 32P-ATP或或- 32P-ATP ATP + 3-磷酸甘油磷酸甘油 3-磷酸甘

14、油激酶磷酸甘油激酶 1，3-二磷酸甘油酸二磷酸甘油酸+ ADP Mg2+H332PO4- 32P-ATP 強堿陰離子交換柱強堿陰離子交換柱 活性炭吸附活性炭吸附純化純化- 32P-ATP核酸和反義寡核苷酸標記核酸和反義寡核苷酸標記核酸的核酸的125I標記：標記： DNA單鏈單鏈DNA +Na 125ITlCl3125I2125I-DNA 反義寡核苷酸反義寡核苷酸125I標記（標記（ 125I ASON，antisense oligonucleotide）1、ASON與酪與酪 胺連接：胺連接： 將含酪將含酪 胺的核苷酸單體通過合成儀連接在胺的核苷酸單體通過合成儀連接在ASON的的5端堿基，再將端

15、堿基，再將125I連到酪連到酪 胺的苯環(huán)上。（用胺的苯環(huán)上。（用氯胺氯胺-T氧化氧化Na 125I獲得獲得125I2）2、碘間接標記、碘間接標記ASON ： 制備制備5端硫代端硫代ASON與含碘嘧啶環(huán)結合，與含碘嘧啶環(huán)結合，穩(wěn)定性碘原子被穩(wěn)定性碘原子被125I取代而制成。取代而制成。3、3H- ASON 同位素交換法進行非定位標記同位素交換法進行非定位標記4、 32P- ASON： 在寡核苷酸在寡核苷酸5端通過端通過T4多核苷酸激酶催化連接多核苷酸激酶催化連接- 32P-ATP而制得。而制得。放射性標記化合物的純化與鑒定放射性標記化合物的純化與鑒定 標記率標記率： 指放射性核素被標記到待標記化

16、合物上的量占放射性投指放射性核素被標記到待標記化合物上的量占放射性投入量的百分比，即：入量的百分比，即： 標記率標記率(%)=標記物的放射性標記物的放射性/投入的總放射性投入的總放射性100%。標記物的分離純化標記物的分離純化：色譜法，又叫：色譜法，又叫層析法層析法，范圍很廣，主要有紙層，范圍很廣，主要有紙層析、薄板層析、柱層析等，另外還有析、薄板層析、柱層析等，另外還有透析法、電泳法透析法、電泳法。其中柱層析。其中柱層析法中的凝膠過濾法是一種高效、溫和的純化方法，在蛋白和肽類的法中的凝膠過濾法是一種高效、溫和的純化方法，在蛋白和肽類的標記化合物的純化中得到廣泛的應用。標記化合物的純化中得到廣

17、泛的應用。標記物的鑒定標記物的鑒定 (一一) 放射化學純度：包括放射性紙層析法、放射性高效液相層析放射化學純度：包括放射性紙層析法、放射性高效液相層析法、放射性凝膠電泳法等。法、放射性凝膠電泳法等。 (二二) 放射性濃度：取放射性濃度：取1ml產品，測其放射性活度，即為放射性濃產品，測其放射性活度，即為放射性濃度，單位為度，單位為Bq/ml。 (三三) 放射性比活度測定：放射性比活度放射性比活度測定：放射性比活度=放射性濃度放射性濃度/化學純度化學純度（Bq/mmol） (四四) 生物活性、免疫活性測定生物活性、免疫活性測定 放射性標記化合物的輻射自分解放射性標記化合物的輻射自分解 輻射自分解

18、輻射自分解(autoradiolysis) ：由于標記化合物分子所含放射性：由于標記化合物分子所含放射性核素電離輻射的作用，致使標記化合物本身的結構被破壞而喪核素電離輻射的作用，致使標記化合物本身的結構被破壞而喪失原有特性的現象。輻射自分解還會產生放射化學雜質或化學失原有特性的現象。輻射自分解還會產生放射化學雜質或化學雜質。雜質。輻射自分解的方式輻射自分解的方式1、初級內分解初級內分解(primary internal decomposition)：指標記核素本身：指標記核素本身的衰變，引起帶有該核素的標記物分子結構發(fā)生變化，目前還不能的衰變，引起帶有該核素的標記物分子結構發(fā)生變化，目前還不能

19、人為加以控制。例如，人為加以控制。例如，3 H每年有每年有5%變成變成3He，14C每年有每年有0.01%變變成成14N，這樣化合物的性質就發(fā)生了改變。，這樣化合物的性質就發(fā)生了改變。2、初級外分解初級外分解(primary external decomposition):標記核素所發(fā)出的標記核素所發(fā)出的射線直接作用于標記化合物分子，造成電離、激發(fā)或化學鍵斷裂。射線直接作用于標記化合物分子，造成電離、激發(fā)或化學鍵斷裂。比放射性愈高，標記分子愈集中，這種作用愈明顯。比放射性愈高，標記分子愈集中，這種作用愈明顯。 3、次級分解次級分解(secondary decomposition)：射線首先作用

20、于標記化：射線首先作用于標記化合物臨近的分子合物臨近的分子(如水分子如水分子)，使其產生激活物質或稱自由基，這些，使其產生激活物質或稱自由基，這些自由基化學性質活潑，可以作用于標記化合物分子，產生斷鍵、氧自由基化學性質活潑，可以作用于標記化合物分子，產生斷鍵、氧化及分解作用?；胺纸庾饔谩Ｓ绊戄椛渥苑纸獾囊蛩赜绊戄椛渥苑纸獾囊蛩?、與標記化合物吸收射線能量的效率有關：不同種類的射線，電、與標記化合物吸收射線能量的效率有關：不同種類的射線，電離密度不同，電離密度越大，吸收射線能量的效率越高。離密度不同，電離密度越大，吸收射線能量的效率越高。2、與標記化合物的比活度有關：標記化合物的比活度愈高，化

21、合、與標記化合物的比活度有關：標記化合物的比活度愈高，化合物分子集中，相互間愈易受到自身射線的照射而使輻射自分解加重。物分子集中，相互間愈易受到自身射線的照射而使輻射自分解加重。3、與標記化合物的純度有關：雜質的存在，特別是那些容易被電、與標記化合物的純度有關：雜質的存在，特別是那些容易被電離輻射所激發(fā)、分解、產生自由基的雜質，可加速輻射自分解，且離輻射所激發(fā)、分解、產生自由基的雜質，可加速輻射自分解，且隨著時間的延長而逐漸加快。隨著時間的延長而逐漸加快?？刂戚椛渥苑纸獾姆椒刂戚椛渥苑纸獾姆椒?1、降低標記化合物的比活度：輻射自分解的速度與比活度成正比，、降低標記化合物的比活度：輻射自分解的

22、速度與比活度成正比，貯存時應根據實際工作需要，將標記化合物用同種化合物貯存時應根據實際工作需要，將標記化合物用同種化合物(即載體即載體)稀釋到所需的比活度。稀釋到所需的比活度。2、選擇適當的溶劑：選擇溶劑的要求是：、選擇適當的溶劑：選擇溶劑的要求是：具有優(yōu)良的耐輻射性；具有優(yōu)良的耐輻射性；要能夠溶解標記物；要能夠溶解標記物；所加溶劑為避免引入雜質要經蒸餾法純化。所加溶劑為避免引入雜質要經蒸餾法純化。 3、加入自由基清除劑：常用少量、加入自由基清除劑：常用少量(1%3%)乙醇。乙醇。4、降低貯存溫度：溫度降低，自由基與標記分子相作用的反應速、降低貯存溫度：溫度降低，自由基與標記分子相作用的反應速

23、度也降低，從而輻射自分解也降低。度也降低，從而輻射自分解也降低。 氚在標記化合物分子內的穩(wěn)定性：氚在標記化合物分子內的穩(wěn)定性：3H標記化合物在實驗核醫(yī)學中應用較多，但標記化合物在實驗核醫(yī)學中應用較多，但3H標記化合物在貯存標記化合物在貯存和使用中，不及和使用中，不及14C標記化合物穩(wěn)定，除易發(fā)生輻射自分解而形成標記化合物穩(wěn)定，除易發(fā)生輻射自分解而形成放化雜質外，還可與周圍溶劑發(fā)生交換反應而脫放化雜質外，還可與周圍溶劑發(fā)生交換反應而脫3H，脫，脫3H的程度的程度與標記化合物中與標記化合物中3H原子的位置有關。一般來說，在巰基原子的位置有關。一般來說，在巰基(-SH)、胺、胺基基(-NH2)、羧基

24、、羧基(-COOH)、亞胺基、亞胺基(=NH)上標記的上標記的3H原子是不穩(wěn)原子是不穩(wěn)定的定的。放射核素示蹤技術放射核素示蹤技術放射核素示蹤技術（放射核素示蹤技術（radionuclide tracing techniques）:利用放射性核素及其標記化合物利用放射性核素及其標記化合物作為示蹤劑，應用射線探測方法來檢測它的行作為示蹤劑，應用射線探測方法來檢測它的行蹤，以研究示蹤劑在生物體系或外界環(huán)境中運蹤，以研究示蹤劑在生物體系或外界環(huán)境中運動規(guī)律的核技術動規(guī)律的核技術基本原理：基本原理：一、一、同一性同一性 放射性核素及其標記化合物和相放射性核素及其標記化合物和相應的非標記化合物具有相同的化

25、學及生物學性應的非標記化合物具有相同的化學及生物學性質，在體內化學及生理代謝變化過程相同；質，在體內化學及生理代謝變化過程相同；二、二、可測性可測性 放射性核素能發(fā)出各種不同的射線，放射性核素能發(fā)出各種不同的射線，可被放射性探測儀器所測定或被感光材料所記可被放射性探測儀器所測定或被感光材料所記錄。而穩(wěn)定性核素標記物則不然。錄。而穩(wěn)定性核素標記物則不然。主要特點主要特點 1.靈敏度高靈敏度高：最精確的化學分析只能測：最精確的化學分析只能測10-12 g水水平，而放射性示蹤技術可測出平，而放射性示蹤技術可測出10-1410-18 g水平，水平，因而對研究體內或體外實驗系統(tǒng)內的微量物質具因而對研究體

26、內或體外實驗系統(tǒng)內的微量物質具有特別價值。有特別價值。 2.檢測方法簡單多樣檢測方法簡單多樣。對待測物不必進行純化或。對待測物不必進行純化或分離，對發(fā)射分離，對發(fā)射射線示蹤劑，可從體表測量。射線示蹤劑，可從體表測量。3.合乎生理條件合乎生理條件：許多被研究的物質是系統(tǒng)內原有：許多被研究的物質是系統(tǒng)內原有的成分，并且通常處于動態(tài)平衡狀態(tài)，其含量及的成分，并且通常處于動態(tài)平衡狀態(tài)，其含量及分布維持穩(wěn)定狀態(tài)。用放射性核素及其標記化合分布維持穩(wěn)定狀態(tài)。用放射性核素及其標記化合物所用示蹤量足以用核探測儀器測出，但是其化物所用示蹤量足以用核探測儀器測出，但是其化學量可以是很少的，引入后幾乎不會改變體內原學

27、量可以是很少的，引入后幾乎不會改變體內原有物質的含量，所以基本上不會改變體內或體外有物質的含量，所以基本上不會改變體內或體外系統(tǒng)的正常生理平衡，實驗結果接近正常生理狀系統(tǒng)的正常生理平衡，實驗結果接近正常生理狀態(tài)物質的變化，準確可靠。態(tài)物質的變化，準確可靠。4.能定位和定性，在生物醫(yī)學中應用廣泛能定位和定性，在生物醫(yī)學中應用廣泛。比如利。比如利用用RAG可檢測示蹤劑在組織、細胞內的分布情可檢測示蹤劑在組織、細胞內的分布情況等。用磷屏掃描儀可定性定量檢測示蹤劑況等。用磷屏掃描儀可定性定量檢測示蹤劑 。廣泛用于細胞生物學、分子生物學、免疫學、遺廣泛用于細胞生物學、分子生物學、免疫學、遺傳學和基因工程

28、研究。傳學和基因工程研究。放射性核素示蹤技術的基本環(huán)節(jié)放射性核素示蹤技術的基本環(huán)節(jié)一、一、放射性制劑的選擇放射性制劑的選擇1、核素標記位置核素標記位置的選擇的選擇 科研選用核素標記化合物科研選用核素標記化合物的標記位置要能滿足研究目的需要。若觀察分子上的標記位置要能滿足研究目的需要。若觀察分子上某基團或原子去向，應選擇定位標記，必要時用雙某基團或原子去向，應選擇定位標記，必要時用雙標記，避免將示蹤原子標記在可交換位置，且在實標記，避免將示蹤原子標記在可交換位置，且在實驗過程中核素不能脫標。驗過程中核素不能脫標。2、選擇合適、選擇合適射線射線 進行進行體內示蹤、功能測定或顯體內示蹤、功能測定或顯

29、像檢查像檢查時選擇僅發(fā)射時選擇僅發(fā)射射線的核素；微觀放射自顯射線的核素；微觀放射自顯影研究影研究生物代謝生物代謝宜選擇發(fā)射宜選擇發(fā)射射線的核素射線的核素3H14C35S3、核素純度和化學純度核素純度和化學純度 進行示蹤研究時，做靶的物質不純，進行示蹤研究時，做靶的物質不純，則產物中就可攙雜另一種放射性核素，以此示蹤將得不到正確實則產物中就可攙雜另一種放射性核素，以此示蹤將得不到正確實驗結果。驗結果。4、選擇合適半衰期核素選擇合適半衰期核素 根據實驗需要選擇具合適半衰期的根據實驗需要選擇具合適半衰期的核素。對動物代謝實驗，可選擇半衰期較長的核素核素。對動物代謝實驗，可選擇半衰期較長的核素3H、1

30、4C標記標記的示蹤劑，體外放射分析，則多選用的示蹤劑，體外放射分析，則多選用125I。5、放射性活度和發(fā)射射線能量放射性活度和發(fā)射射線能量的選擇的選擇 同種射線粒子，能量同種射線粒子，能量越高，穿透和電離能力越強，輻射生物效應就越明顯。這就要求越高，穿透和電離能力越強，輻射生物效應就越明顯。這就要求在滿足示蹤量的前提下盡量降低活度以減少機體吸收劑量，防止在滿足示蹤量的前提下盡量降低活度以減少機體吸收劑量，防止有害的輻射效應，同時比活度過高也會導致輻射自分解。另外，有害的輻射效應，同時比活度過高也會導致輻射自分解。另外，功能測定或顯像檢查功能測定或顯像檢查時選擇僅發(fā)射時選擇僅發(fā)射射線的核素，細胞

31、射線的核素，細胞水平分子生物示蹤研究時，宜選擇發(fā)射低能水平分子生物示蹤研究時，宜選擇發(fā)射低能射線的核射線的核素素3H、14C二、二、示蹤劑用量示蹤劑用量 包括示蹤劑的放射性活度和化學量。示蹤劑化學量極少，一包括示蹤劑的放射性活度和化學量。示蹤劑化學量極少，一般不會影響示蹤結果，所以主要考慮活度，包括：實驗中被稀釋般不會影響示蹤結果，所以主要考慮活度，包括：實驗中被稀釋程度；示蹤實驗周期；示蹤劑利用率；在體內的分布和排出；輻程度；示蹤實驗周期；示蹤劑利用率；在體內的分布和排出；輻射生物效應；安全劑量；測量儀器的靈敏度。綜合上述因素，可射生物效應；安全劑量；測量儀器的靈敏度。綜合上述因素，可參考下

32、列公式：參考下列公式： ACK/DB A: 示蹤劑放射性活度示蹤劑放射性活度(dpm/ml) B: 本底計數率、本底計數率、 C: 示蹤劑容積示蹤劑容積(ml) K: 測量儀器的靈敏度、探測效率測量儀器的靈敏度、探測效率 D：實驗中稀釋倍數：實驗中稀釋倍數 一般而言，小動物實驗用量一般而言，小動物實驗用量0.2-0.5Ci,多在多在10 Ci以下以下;離體實驗離體實驗用量小于用量小于1或幾或幾Ci。放射性生物樣品的制備放射性生物樣品的制備根據所測根據所測組織、臟器及核素種類、活度組織、臟器及核素種類、活度采用不同樣品制備方式。采用不同樣品制備方式。（一）注意事項（一）注意事項 為避免放射性污染

33、和輻射防護，應注意：為避免放射性污染和輻射防護，應注意：1、防止放射性生物樣品沾染工作人員體表或經消化道、呼吸道、防止放射性生物樣品沾染工作人員體表或經消化道、呼吸道進入人體。進入人體。2、防止工作場所放射性污染（地面、操作臺、墻壁）、防止工作場所放射性污染（地面、操作臺、墻壁）3、采樣應有代表性和均勻性、采樣應有代表性和均勻性4、稱重時防止樣品污染干燥箱、天平等、稱重時防止樣品污染干燥箱、天平等5、向動物體內引入活度較高示蹤劑時注意外照射防護、向動物體內引入活度較高示蹤劑時注意外照射防護（二）（二）樣品制備樣品制備1、燃燒法燃燒法 密閉容器內放生物樣品，充氧后樣品燃燒，樣品中密閉容器內放生物

34、樣品，充氧后樣品燃燒，樣品中14C 3H轉變?yōu)檗D變?yōu)?4CO2 ， 3H2O ，用苯乙胺或乙醇胺，用苯乙胺或乙醇胺 吸收吸收14CO2 ，用無水乙醚吸收用無水乙醚吸收3H2O。然后液體閃爍儀測量。然后液體閃爍儀測量。2、消化法消化法 在酸或堿性溶液中，大分子樣品水解為易溶小分子物在酸或堿性溶液中，大分子樣品水解為易溶小分子物質，加入閃爍劑進行液體閃爍測量。質，加入閃爍劑進行液體閃爍測量。3、示蹤劑制備示蹤劑制備,用用灰化法灰化法-使樣品中有機物氧化使樣品中有機物氧化,可細分為可細分為:濕灰化法濕灰化法 加氧化劑使樣品中有機物氧完全化加氧化劑使樣品中有機物氧完全化干灰化法干灰化法 用電爐高溫灰化

35、用電爐高溫灰化,揮發(fā)性的示蹤樣品不適合揮發(fā)性的示蹤樣品不適合.1) 擬濕灰化法擬濕灰化法 用濃硝酸或氫氧化鈉使示蹤劑樣品完全溶解用濃硝酸或氫氧化鈉使示蹤劑樣品完全溶解,對對脂肪含量大的樣品以有機溶劑溶解脂肪含量大的樣品以有機溶劑溶解,得到均勻溶液得到均勻溶液. (三三)臨床核醫(yī)學顯像臨床核醫(yī)學顯像 根據需要選用根據需要選用照相機、照相機、SPECT PET進行組織臟器顯像。進行組織臟器顯像。（四）（四）結果分析：結果分析：根據實驗目的、示蹤劑類型、數據處理方式分析結果。根據實驗目的、示蹤劑類型、數據處理方式分析結果。對體外放射分析結果，要遵循放免質量控制指標，結合正常值對體外放射分析結果，要遵

36、循放免質量控制指標，結合正常值分析；分析；對功能測定和顯像檢測結果，結合臨床表現、病理變化和圖象對功能測定和顯像檢測結果，結合臨床表現、病理變化和圖象特征進行綜合分析。特征進行綜合分析。示蹤實驗中的同位素效應示蹤實驗中的同位素效應(一一)同位素效應同位素效應：物質轉化時，如分子中某一原：物質轉化時，如分子中某一原子被它的同位素所取代，雖然反應性質不變，有子被它的同位素所取代，雖然反應性質不變，有時卻會發(fā)生反應速度的改變，稱為同位素效應時卻會發(fā)生反應速度的改變，稱為同位素效應(isotope effect)。 (二二)同位素效應同位素效應的類型的類型1.初級同位素效應初級同位素效應：反應直接涉及

37、同位素所在的鍵時，同：反應直接涉及同位素所在的鍵時，同位素效應比較嚴重，稱初級同位素效應位素效應比較嚴重，稱初級同位素效應(primary isotope effect)。 2.次級同位素效應次級同位素效應：同位素效應發(fā)生在鄰近的化學鍵稱繼：同位素效應發(fā)生在鄰近的化學鍵稱繼發(fā)同位素效應或次級同位素效應發(fā)同位素效應或次級同位素效應(second isotope effect)。3.溶劑同位素效應溶劑同位素效應：溶劑中某種原子被同位素取代后影響：溶劑中某種原子被同位素取代后影響溶質的反應速度稱之。溶質的反應速度稱之。4.生物體系的同位素效應生物體系的同位素效應：示蹤劑引入生物體后，由于同：示蹤劑引

38、入生物體后，由于同位素效應的存在會影響有關的各種生化反應，這種情況稱位素效應的存在會影響有關的各種生化反應，這種情況稱為生物體系的同位素效應。為生物體系的同位素效應?；绢愋汀⒎椒白⒁馐马椈绢愋?、方法及注意事項 (一一)類型：根據實驗的目的不同，可分以下幾種類型：類型：根據實驗的目的不同，可分以下幾種類型：1.整體示蹤實驗整體示蹤實驗：指將標記物引入完整的機體，從體外：指將標記物引入完整的機體，從體外或取標本觀察標記物的去向，以了解機體在生理、病理或取標本觀察標記物的去向，以了解機體在生理、病理過程中物質的分布及運動轉化規(guī)律，主要用于研究物質過程中物質的分布及運動轉化規(guī)律，主要用于研究物質

39、在體內的吸收，分布、代謝和排泄等運動規(guī)律以及研究在體內的吸收，分布、代謝和排泄等運動規(guī)律以及研究機體組織器官的功能和形態(tài)變化。機體組織器官的功能和形態(tài)變化。2.離體示蹤實驗離體示蹤實驗：指從整體中分離出來的組織或細胞等：指從整體中分離出來的組織或細胞等簡單系統(tǒng)進行的實驗。多用于某些特定物質如蛋白質、簡單系統(tǒng)進行的實驗。多用于某些特定物質如蛋白質、核酸等的轉化規(guī)律以及某些精細結構的功能研究。核酸等的轉化規(guī)律以及某些精細結構的功能研究。3.雙標記示蹤實驗雙標記示蹤實驗：其原理就是將兩個研究對象包括兩：其原理就是將兩個研究對象包括兩種分子或是一種分子的兩種形態(tài)或是一種分子的兩個種分子或是一種分子的兩

40、種形態(tài)或是一種分子的兩個部分，分別帶上示蹤原子，通過采用相應的測量方法，部分，分別帶上示蹤原子，通過采用相應的測量方法，分析兩種標記原子的量，觀察它們經過運動轉化前后分析兩種標記原子的量，觀察它們經過運動轉化前后比值的變化，判斷該兩種觀察對象是否具有相同的運比值的變化，判斷該兩種觀察對象是否具有相同的運轉規(guī)律。轉規(guī)律。1. 實驗類型的選擇實驗類型的選擇(補充補充)：其選擇的原則有：其選擇的原則有： 研究整體吸收、分布、轉運、排泄等問題，只能選擇整體示蹤研究整體吸收、分布、轉運、排泄等問題，只能選擇整體示蹤實驗。實驗。 物質在精細結構中的運動規(guī)律，可首先考慮離體示蹤實驗，最物質在精細結構中的運動

41、規(guī)律，可首先考慮離體示蹤實驗，最好有整體實驗加以驗證。好有整體實驗加以驗證。 物質轉化的研究以離體實驗為宜，必要時也應加以整體示蹤實物質轉化的研究以離體實驗為宜，必要時也應加以整體示蹤實驗。驗。 直接觀察細胞內的物質轉化，而且該物質的標記物又無法直接直接觀察細胞內的物質轉化，而且該物質的標記物又無法直接引入細胞時，可以選擇脈沖標記法，也可以用加入示蹤物的前身標引入細胞時，可以選擇脈沖標記法，也可以用加入示蹤物的前身標記物法，該前身標記物進入細胞，在細胞內發(fā)生記物法，該前身標記物進入細胞，在細胞內發(fā)生“示蹤物前身示蹤物前身示示蹤物蹤物代謝產物代謝產物”的轉變，獲得的轉變，獲得“示蹤物示蹤物代謝產

42、物代謝產物”的信息。的信息。 對某些研究，用離體實驗方法易導致錯誤結論，或離體實驗本對某些研究，用離體實驗方法易導致錯誤結論，或離體實驗本身的短時性不能給出應有結果時，應采用整體實驗。身的短時性不能給出應有結果時，應采用整體實驗。實驗階段實驗階段 (1)示蹤劑量的估算：示蹤劑量的估算不能用簡單的公式示蹤劑量的估算：示蹤劑量的估算不能用簡單的公式來估算，應該綜合考慮。來估算，應該綜合考慮。 稀釋作用：放射性核素標記化合物進入機體后，一般稀釋作用：放射性核素標記化合物進入機體后，一般要求放射性活度在整個實驗過程中，經稀釋后所制得的放要求放射性活度在整個實驗過程中，經稀釋后所制得的放射性樣品不能低于

43、本底計數。射性樣品不能低于本底計數。 組織的濃聚作用：由于某些放射性核素有親某種組織組織的濃聚作用：由于某些放射性核素有親某種組織的特性，有的放射性核素進入機體后不是完全均勻被稀釋，的特性，有的放射性核素進入機體后不是完全均勻被稀釋，而可能選擇性地蓄積到某些器官、組織而濃聚。如而可能選擇性地蓄積到某些器官、組織而濃聚。如131I進進入體內后，有入體內后，有30%或更高可被甲狀腺攝取，給予劑量時就或更高可被甲狀腺攝取，給予劑量時就要考慮這個特異性。要考慮這個特異性。 實驗周期及安全劑量：根據試驗周期長短，實驗分析方實驗周期及安全劑量：根據試驗周期長短，實驗分析方法，給予途徑等進行安全劑量估算。如

44、，示蹤劑引入機體，法，給予途徑等進行安全劑量估算。如，示蹤劑引入機體，要求基本不改變該物質在體內的濃度。藥物研究時其化學要求基本不改變該物質在體內的濃度。藥物研究時其化學量不應超過臨床劑量，動物實驗時在不中毒的前提下可適量不應超過臨床劑量，動物實驗時在不中毒的前提下可適當增大劑量。體外示蹤實驗可用比活度較低的標記物。當增大劑量。體外示蹤實驗可用比活度較低的標記物。 對于非均勻分布的標記物還應根據實驗情況對于非均勻分布的標記物還應根據實驗情況(實驗周期實驗周期長短、標記物的生物半衰期，標記物在擬觀察的臟器中分長短、標記物的生物半衰期，標記物在擬觀察的臟器中分布的百分數，能取得的樣品量，測量上最低

45、需多少布的百分數，能取得的樣品量，測量上最低需多少dpm等等)作一系列估算。作一系列估算。(2)示蹤劑引入途徑：根據實驗類型和目的，對整體動物示蹤劑引入途徑：根據實驗類型和目的，對整體動物實驗可采用靜脈、腹腔、皮下及肌肉注射，或口服、灌實驗可采用靜脈、腹腔、皮下及肌肉注射，或口服、灌胃等。胃等。(3)放射性樣品的制備：樣品的制備就為測量，測量的形放射性樣品的制備：樣品的制備就為測量，測量的形式主要有三類：式主要有三類：取取標本標本在體外測放射性；在體外測放射性；制成不同水平的制成不同水平的切片切片作作放射自顯影放射自顯影；從體外測從體外測整體內的放射性。因此樣品制備就要適應不整體內的放射性。因

46、此樣品制備就要適應不同測量類型同測量類型。 (4)數據處理：放射性示蹤實驗結果可根據不同目的選用數據處理：放射性示蹤實驗結果可根據不同目的選用不同參數表示，含義也各不相同，概括為以下幾種。不同參數表示，含義也各不相同，概括為以下幾種。 整個臟器的整個臟器的總放射性活度總放射性活度：主要用于研究：主要用于研究物質分布物質分布的的實驗以實驗以反映各臟器的相對分布量反映各臟器的相對分布量。對于不同個體的同一臟。對于不同個體的同一臟器來說，該參數與各個體接受的劑量成正比，故各個體的器來說，該參數與各個體接受的劑量成正比，故各個體的劑量不同時應換算成所給劑量的劑量不同時應換算成所給劑量的%，或對劑量進行

47、校正。，或對劑量進行校正。 放射性含量放射性含量：dpm/mg組織或組織或ml體液、體液、dpm/mg蛋白蛋白或或DNA等。用以等。用以反映不同組織濃集某種物質的能力反映不同組織濃集某種物質的能力。對。對不同個體來說，該參數與單位體重接受的劑量成正比，故不同個體來說，該參數與單位體重接受的劑量成正比，故要求各個體接受的劑量按單位體重計算是相等的，否則應要求各個體接受的劑量按單位體重計算是相等的，否則應作相應的校正。作相應的校正。比活度比活度：dpm/mmol或或mg化合物。主要用于研究內化合物。主要用于研究內源性物質的動態(tài)分布或代謝。它受三個因素的影響，源性物質的動態(tài)分布或代謝。它受三個因素的

48、影響，即與引入的放射性活度成正比；與組織中非標記物含即與引入的放射性活度成正比；與組織中非標記物含量成反比；與示蹤物被清除的速度成反比。量成反比；與示蹤物被清除的速度成反比。相對比活度相對比活度：兩個解剖部位中同一化合物比活度的：兩個解剖部位中同一化合物比活度的比值或兩種化合物比活度的比值。用于反映組織中某比值或兩種化合物比活度的比值。用于反映組織中某物質的來源及組織與血液交換的速率，可排除血液中物質的來源及組織與血液交換的速率，可排除血液中比活度不恒定的影響。比活度不恒定的影響。放射性核素稀釋法放射性核素稀釋法 放射性核素稀釋法放射性核素稀釋法(radionuclide dilution t

49、echnique)即用即用適當的放射性核素標記化合物作為示蹤劑，利用化學上適當的放射性核素標記化合物作為示蹤劑，利用化學上的稀釋原理對微量物質作定量分析，或測定液體容量的的稀釋原理對微量物質作定量分析，或測定液體容量的方法。方法。基本原理基本原理 依據物質在稀釋前后質量不變的原理，依據物質在稀釋前后質量不變的原理，放射性物質在被稀釋前后，其放射性活度也不會改變。放射性物質在被稀釋前后，其放射性活度也不會改變。但是，由于被稀釋，它的單位質量或體積內的放射性活但是，由于被稀釋，它的單位質量或體積內的放射性活度度(即比活度或放射性濃度即比活度或放射性濃度)降低了。降低了。設質量為設質量為m1的標記物

50、的比活度為的標記物的比活度為s1與質量為與質量為m2的同一種化的同一種化學形態(tài)的非示記物均勻混合，則標記物被非標記分子所稀學形態(tài)的非示記物均勻混合，則標記物被非標記分子所稀釋，混合物的比活度為釋，混合物的比活度為s2，混合前后的總放射性應相等。，混合前后的總放射性應相等。即：即： s2(m1+m2)=s1m1(61) 如果如果m1和和m2中有一個量為已知，只需測定混勻后樣品中有一個量為已知，只需測定混勻后樣品(取任意量取任意量)的比活度，就可算出另一量。的比活度，就可算出另一量?；痉椒ɑ痉椒?(一一)核素正稀釋法核素正稀釋法(direct nuclide dilution)：用已知量：用已

51、知量的標記物測定未知量的非標記物的稀釋法稱為核素正稀的標記物測定未知量的非標記物的稀釋法稱為核素正稀釋法。方法要點是：將一定量已知比放射性的標記化合釋法。方法要點是：將一定量已知比放射性的標記化合物與其非標記化合物的分子均勻混合，直接測定該混合物與其非標記化合物的分子均勻混合，直接測定該混合樣品的比放射性，亦可進行提純后測定該樣品的比放射樣品的比放射性，亦可進行提純后測定該樣品的比放射性。根據比放射性的降低來計算非標記化合物的含量。性。根據比放射性的降低來計算非標記化合物的含量。設：設：m1標記化合物的量；標記化合物的量；A標記化合物的放射性；標記化合物的放射性；S1標標記化合物的比活度；記化

52、合物的比活度；S2稀釋后混合液的比活度；稀釋后混合液的比活度；mx樣品中待測化合物的量樣品中待測化合物的量根據公式根據公式 S2(m1+m2)=S1m1得：得： mx=m(S1/S2-1)某樣品內含有微量磷酸鈉某樣品內含有微量磷酸鈉(Na3PO4)，加，加32P標記的磷酸鈉標記的磷酸鈉(Na332PO4)0.05 mg，其放射性計數為，其放射性計數為1950 cpm，混勻后，混勻后分離得純品磷酸鈉分離得純品磷酸鈉0.1 mg，放射性計數為，放射性計數為600 cpm，求樣，求樣品中磷酸鈉的含量。品中磷酸鈉的含量。解 ： 已 知解 ： 已 知 A = 1 9 5 0 c p m , m1= 0

53、. 0 5 m g , S1=1950/0.05=39000(cpm/mg)S2=600/0.1=6000 cpm/mg,代入式代入式62得：得：mx=0.05(390006000-1)=0.275 mg(二二)核素反稀釋法核素反稀釋法(inverse nuclide dilution)：用已知量的：用已知量的非標記物測定樣品中標記物含量的方法稱之為核素反稀釋非標記物測定樣品中標記物含量的方法稱之為核素反稀釋法。方法要點是：在體內示蹤實驗時，設標記物的化學量法。方法要點是：在體內示蹤實驗時，設標記物的化學量為為mx，已知標記物的比活度為，已知標記物的比活度為S1，加入非標記物的化學，加入非標記

54、物的化學量為量為m，均勻后分離出純品，均勻后分離出純品(標記物標記物+非標記物非標記物)的比活度為的比活度為S2，根據稀釋法的基本公式，根據稀釋法的基本公式(62)，得：，得：mx=m S2/S1-S2 (63)這就是反稀釋法基本公式。這就是反稀釋法基本公式。凡是標記物在樣品中的化學量少，并混有放射性雜質，凡是標記物在樣品中的化學量少，并混有放射性雜質，欲求其含量，只要知道該標記物的比活度，都可用反稀釋欲求其含量，只要知道該標記物的比活度，都可用反稀釋法進行定量。法進行定量。用用14CO2通過植物光合作用生成放射性蛋白質，取其中通過植物光合作用生成放射性蛋白質，取其中少量蛋白質經水解后分離出部

55、分谷氨酸測得比活度為少量蛋白質經水解后分離出部分谷氨酸測得比活度為254 dpm/mg，欲求谷氨酸的含量，取，欲求谷氨酸的含量，取126 mg放射性蛋放射性蛋白樣品，水解后加入非標記谷氨酸白樣品，水解后加入非標記谷氨酸10.7 mg，混勻后分，混勻后分出少部分谷氨酸測比活度為出少部分谷氨酸測比活度為382 dpm/mg。求標記谷氨。求標記谷氨酸的量及蛋白中標記谷氨酸的重量百分比酸的量及蛋白中標記谷氨酸的重量百分比?解：已知解：已知m=10.7 mg S1=508 dpm/mg S2=382 dpm/mg，代入公式代入公式(63)得得mx=10.7382/508-382=32.44 (mg)標記

56、谷氨酸的量，則標記谷氨酸的重量百分比標記谷氨酸的量，則標記谷氨酸的重量百分比為：為：32.44126=25.7%。（二）放射性核素稀釋法的應用放射性核素稀釋法的應用 1、測定生理性物質的體內代謝庫、測定生理性物質的體內代謝庫 體內各種生理性物質體內各種生理性物質都有各自的分布范圍，每個分布范圍稱為一個代謝庫。利都有各自的分布范圍，每個分布范圍稱為一個代謝庫。利用同位素稀釋法來測定活體各代謝庫的大小幾乎是絕大多用同位素稀釋法來測定活體各代謝庫的大小幾乎是絕大多數物質整體代謝庫的唯一有效方法。例如靜脈注射少量高數物質整體代謝庫的唯一有效方法。例如靜脈注射少量高比活度的比活度的3 H-膽酸，待其在包

57、括血漿在內的代謝庫混勻后膽酸，待其在包括血漿在內的代謝庫混勻后取樣測比活度，按稀釋法原理即可算出體內包括血漿在內取樣測比活度，按稀釋法原理即可算出體內包括血漿在內的膽酸代謝庫的大小。的膽酸代謝庫的大小。2、整體內各種體液成分的量、整體內各種體液成分的量 整體內有些體液成分的量整體內有些體液成分的量也相對恒定，它們不一定是一種特定物質，因此習慣上不也相對恒定，它們不一定是一種特定物質，因此習慣上不稱為代謝庫，但是它們的變化有理論意義和臨床實踐意義。稱為代謝庫，但是它們的變化有理論意義和臨床實踐意義。測量它們總量的唯一辦法也是同位素稀釋法。下表是常用測量它們總量的唯一辦法也是同位素稀釋法。下表是常

58、用的幾種體液成分測量法。的幾種體液成分測量法。建立建立核素稀釋法的條件核素稀釋法的條件(注意事項注意事項) 1.標記物或非標記物與待測物質在化學性質上要相同。標記物或非標記物與待測物質在化學性質上要相同。 2.實驗過程中，標記原子在化合物上要穩(wěn)定，否則測定實驗過程中，標記原子在化合物上要穩(wěn)定，否則測定的比活度不準確。的比活度不準確。 3.標記物的放射化學純度要高。標記物的放射化學純度要高。 4.必須確保標記物與非標記物充分混勻，特別是體內稀必須確保標記物與非標記物充分混勻，特別是體內稀釋實驗時，由于有吸收、擴散等因素，完全混勻的時間，釋實驗時，由于有吸收、擴散等因素，完全混勻的時間，一般需經實

59、驗確定。一般需經實驗確定。 5.對混勻后的樣品，要有可靠的分離、純化方法。因為對混勻后的樣品，要有可靠的分離、純化方法。因為混勻后，樣品的比活度恒定，所以樣品的丟失不影響結果混勻后，樣品的比活度恒定，所以樣品的丟失不影響結果的準確性，可采用各種理化的方法進行純化，以確保分離的準確性，可采用各種理化的方法進行純化，以確保分離的樣品純凈，測得可靠、準確的比活度。的樣品純凈，測得可靠、準確的比活度。 物質轉化的示蹤研究物質轉化的示蹤研究 研究物質轉化：要揭示機體內重要生命物質的前身物、中間物、及研究物質轉化：要揭示機體內重要生命物質的前身物、中間物、及產物的關系，以完成某種轉化的必要條件。這是目前最

60、常用最理想產物的關系，以完成某種轉化的必要條件。這是目前最常用最理想的方法，可在整體、離體條件下進行，不但能夠對前身物、中間物，的方法，可在整體、離體條件下進行，不但能夠對前身物、中間物，產物作用定性分析，還可用來研究前身物轉化為產物的速度，轉化產物作用定性分析，還可用來研究前身物轉化為產物的速度，轉化的條件，轉化的機制及各種因素對轉化的影響等。的條件，轉化的機制及各種因素對轉化的影響等。 一、一、摻入實驗摻入實驗(incorporation experiment) (一一)基本原理：要研究生物體系中化合物基本原理：要研究生物體系中化合物A和和B是不是前身物和產是不是前身物和產物的關系，可將物