反膠團(tuán)萃取與雙水相萃取

1、LOGO制藥分離工程主講：程純?nèi)宓谖逭碌谖逭?反膠團(tuán)萃取與雙水相萃取反膠團(tuán)萃取與雙水相萃取反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)萃取雙水相萃取雙水相萃取21反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)萃取技術(shù)發(fā)展背景：隨著生物工程的發(fā)展，傳統(tǒng)的溶劑萃取方法難以應(yīng)用于一些生物活性物質(zhì)（如蛋白質(zhì)）的提取和分離。急需研究和開發(fā)易于工業(yè)化的、高效的生化物質(zhì)分離方法。反膠團(tuán)萃?。╮eversed micellar extraction)P72頁英文單詞錯(cuò)誤。反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)萃取1977年，瑞士學(xué)者Luisi等人首次提出用反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)，但并未引起人們的廣泛注意。20世紀(jì)80年代，生物學(xué)家們才開始認(rèn)識到反膠團(tuán)萃取的重要性。反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)萃取膠團(tuán)（mi

2、celles): 將表面活性劑溶于水中，當(dāng)其濃度超過臨界膠團(tuán)濃度時(shí)，表面活性劑就會(huì)在水溶液中聚集在一起形成聚集體，稱為膠團(tuán)。水溶液中膠團(tuán)的非極性基團(tuán)在內(nèi)，而極性基團(tuán)在外。反膠團(tuán)（reversed micelles): 將表面活性劑溶于有機(jī)溶劑中，當(dāng)其濃度超過臨界膠團(tuán)濃度時(shí)，表面活性劑就會(huì)在有機(jī)溶液中聚集在一起形成聚集體，稱為反膠團(tuán)。有機(jī)溶液中膠團(tuán)的非極性基團(tuán)在外，而極性基團(tuán)在內(nèi)。反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)萃取在反膠團(tuán)中，極性基團(tuán)排列在內(nèi)，形成一個(gè)極性核，溶解水后，就形成“水池”，起保護(hù)作用，使蛋白質(zhì)不失活。反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)萃取常用的表面活性劑：陰離子表面活性劑：丁二酸-2-乙基己基酯磺酸鈉陽離子表面活性

3、劑：溴化十六烷基三甲胺，溴化十二烷基二甲胺，氯化三辛基甲胺反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)萃取丁二酸-2-乙基己基酯磺酸鈉丁二酸-2-乙基己基酯磺酸鈉（AOT),最常用，原因：易于獲得具有雙鏈，極性基團(tuán)小，形成反膠團(tuán)時(shí)，不需要加入助表面活性劑形成的反膠團(tuán)半徑較大，有利于大分子蛋白的進(jìn)入反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)的形狀和大小反膠團(tuán)的形狀和大小反膠團(tuán)的形狀多為球形或近似球形，有時(shí)也呈柱狀結(jié)構(gòu)。半徑：一般10-100nm, 取決于鹽的種類和濃度、溶劑、表面活性劑的種類和濃度以及溫度。W0=水/表面活性劑反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)萃取水池的性質(zhì)：水池的性質(zhì)：水池提供親水微環(huán)境，可溶解氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等。當(dāng)含水率較低時(shí)，“水池

4、”內(nèi)水的理化性質(zhì)相差懸殊。W0小于6-8時(shí)， 池中水的表觀黏度上升50倍，疏水性也極高。由于有較高的電荷濃度，“水池”中水的pH值不同于主體的pH。反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)的過程：反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)的過程：蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠團(tuán)溶液是一種協(xié)同過程。表面活性劑同臨近蛋白質(zhì)發(fā)生靜電作用而變形-在兩相界面形成反膠團(tuán)-擴(kuò)散到有機(jī)相中。-改變pH,離子種類、強(qiáng)度等，可使蛋白質(zhì)由有機(jī)相重新返回水相，實(shí)現(xiàn)反萃取過程。反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)溶入反膠團(tuán)的推動(dòng)力：蛋白質(zhì)溶入反膠團(tuán)的推動(dòng)力：1.靜電作用力（最直接的因素是pH值,與等電點(diǎn)PI）。2.空間位阻效應(yīng)（水池的大小和形狀）。反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)萃取影響反

5、膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)的主要因素： 與反膠團(tuán)有關(guān)的因素：表面活性劑種類、濃度， 有機(jī)溶劑種類，助表面活性劑及其濃度 與水相有關(guān)的因素：pH值，離子的種類，離子的強(qiáng)度 與目標(biāo)蛋白質(zhì)有關(guān)因素：蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、大小、濃度、表面電荷分布1.與環(huán)境有關(guān)的因素：系統(tǒng)的溫度、壓力雙水相萃取雙水相萃取雙水相系統(tǒng)：雙水相系統(tǒng)：因兩種水溶性聚合物的水溶液，或一種水因兩種水溶性聚合物的水溶液，或一種水溶性聚合物水溶液與鹽溶液混合時(shí)的不相容性而形成有溶性聚合物水溶液與鹽溶液混合時(shí)的不相容性而形成有明顯界面的兩相系統(tǒng)明顯界面的兩相系統(tǒng)特點(diǎn)：兩相均含有大量的水（高達(dá)80%以上）， 界面張力小，一般只有0.5-10-4mN/m，

6、萃取環(huán)境和條件溫和， 生物相容性好，有時(shí)有穩(wěn)定作用； 分配系數(shù)可控：聚合物修飾、相系統(tǒng)組成、 操作條件容易放大，幾百倍。雙水相萃取雙水相萃取1896年荷蘭微生物學(xué)家Berjerinck發(fā)現(xiàn)瓊脂水溶液與可溶性淀粉或明膠水溶液混合時(shí)形成雙水相現(xiàn)象。1956年瑞典lund大學(xué)的Albertsson教授及其同事開始對雙水相系統(tǒng)進(jìn)行比較系統(tǒng)研究。測定了許多雙水相系統(tǒng)的相圖，考察了蛋白質(zhì)、核酸、病毒、細(xì)胞及細(xì)胞顆粒在雙水相中的分配行為，為雙水相萃取系統(tǒng)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。只局限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的測定和理論研究。雙水相萃取雙水相萃取Kula教授研究小組對雙水相的應(yīng)用、工藝流程、操作參數(shù)、工程設(shè)備、成本分析等進(jìn)行了大

7、量研究，在應(yīng)用上獲得成功。1978年首先將雙水相萃取技術(shù)用于酶的大規(guī)模分離純化，建成了一套工業(yè)裝置，達(dá)到20kg/h的處理能力，分離純化了幾十種酶，也應(yīng)用于基因工程產(chǎn)品的分離。雙水相萃取可分離多肽、蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒、細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞組織，以及重金屬離子等，近年來，還應(yīng)用于一些小分子，如抗生素、氨基酸和植物的有效成分等的分離純化。作為反應(yīng)系統(tǒng)用于酶反應(yīng)，生物轉(zhuǎn)化，發(fā)酵的產(chǎn)物生產(chǎn)與分離的集成。雙水相萃取雙水相萃取1.雙水相系統(tǒng)含較高濃度的水溶性聚合物和鹽，會(huì)帶到產(chǎn)物中，去除需要輔助處理方法。2.成本較高。即使水溶性聚合物和鹽盡管回收再用。3.選擇性較低，分離純化倍數(shù)低，一般只適用于粗分離。

8、雙水相萃取雙水相萃取 聚丙二醇(PPG)聚乙二醇(PEG)聚乙烯醇(PVA)葡聚糖(Dex)聚蔗糖(Ficoll)羥丙基葡聚糖A聚乙二醇(PEG)聚乙烯醇(PVA)葡聚糖(Dex)聚乙烯吡咯烷酮B硫酸葡聚糖酸鈉羧甲基葡聚糖酸鈉聚丙烯乙二醇甲基纖維素C羧甲基葡聚糖酸鈉羧甲基纖維素鈉鹽D聚乙二醇硫酸鉀，硫酸銨，硫酸鈉，硫酸鎂，磷酸鹽酒石酸鈉琥珀酸鈉，檸檬酸納E聚乙二醇葡聚糖乙二醇單丁酯丙醇 A, 兩者均為非離子性聚合物, B, 一種非離子性聚合物，另一種為帶電荷的聚電解質(zhì) C, 兩者均為聚電解質(zhì), D, 一種聚合物，另一種為鹽。 E, 一種聚合物，另一種為有機(jī)小分子雙水相萃取雙水相萃取1.能夠獲得

9、高的產(chǎn)物回收和生物活性回收，高的分離純化倍數(shù)；2.系統(tǒng)的物理化學(xué)性質(zhì)有利于大規(guī)模的應(yīng)用，有良好的工藝性能，系統(tǒng)黏度低，相分離快，達(dá)到相平衡時(shí)間短，工藝參數(shù)容易控制，工藝條件可調(diào)性范圍大；3.系統(tǒng)經(jīng)濟(jì)，成本低，無毒，適合大規(guī)模應(yīng)用。雙水相萃取雙水相萃取 一種物質(zhì)在兩相系統(tǒng)中的分配行為可用分配系數(shù)來描述，分配系數(shù)K為該物質(zhì)在上相和下相中的濃度之比。 此處cT和cB分別為上相和下相中的目的物質(zhì)濃度。當(dāng)目的物質(zhì)主要分配在上相時(shí)，分配系數(shù)K值大于1，并隨在上相中濃度的增加而增加；反之，目的物質(zhì)主要分配在下相時(shí)，分配系數(shù)K值會(huì)小于1，并隨在下相濃度的增加而減小。控制能夠影響物質(zhì)分配系數(shù)K的因素，包括環(huán)境因

10、素，相系統(tǒng)性質(zhì)和組成就可以改變物質(zhì)的分配系數(shù)。BTccK 雙水相萃取雙水相萃取 普通雙水相萃取是指主要依靠空間位阻分配和界面電位分配的雙水相萃取，如利用聚合物/聚合物系統(tǒng)和聚合物/鹽系統(tǒng)的萃取，它們發(fā)展最早，也是研究最多和應(yīng)用最多的雙水相系統(tǒng)，也是其它分配萃取系統(tǒng)的基礎(chǔ)。為了改進(jìn)萃取效率和分離效果，利用控制相系統(tǒng)的pH或在相系統(tǒng)中加入鹽或有機(jī)溶劑的方法提高目的物的分配系數(shù)。普通的雙水相萃取系統(tǒng)的選擇性比較低，只適用于產(chǎn)物回收和初步分離。雙水相萃取雙水相萃取 表面自由能的影響表面自由能的影響 分子或顆粒在溶液中的分配，總是選擇到能量最低的哪分子或顆粒在溶液中的分配，總是選擇到能量最低的哪個(gè)相。個(gè)

11、相。雙水相萃取雙水相萃取 液體的表面張力大小與液體性質(zhì)，如溶劑和溶質(zhì)的性液體的表面張力大小與液體性質(zhì)，如溶劑和溶質(zhì)的性質(zhì)、濃度、黏度、另一相性質(zhì)、溫度、壓力等有密切質(zhì)、濃度、黏度、另一相性質(zhì)、溫度、壓力等有密切關(guān)系，這些因素的變化均造成分配系數(shù)關(guān)系，這些因素的變化均造成分配系數(shù)K K的變化。的變化。雙水相萃取雙水相萃取在兩相系統(tǒng)中若有鹽存在，會(huì)對大分子在兩相中的分配在兩相系統(tǒng)中若有鹽存在，會(huì)對大分子在兩相中的分配產(chǎn)生較大的影響，通常稱為產(chǎn)生較大的影響，通常稱為鹽效應(yīng)。鹽效應(yīng)。 01234567800.10.20.3磷酸鉀（M ）K值 普魯蘭酶，9%PEG4000/1.25%DexT500 ,p

12、H7.8 富馬酸脫氫酶，9%PEG4000/2%DexT500, pH7.5 甲醛脫氫酶，9%PEG4000/2%DexT500, pH7.5 1,4-葡萄糖磷酸化酶，7.2%PEG4000/6.7%DexT500, pH7.5雙水相萃取雙水相萃取 -2.4-1.8-1.2-0.600.61.21.80200040006000PEG分子量logK 氯化鉀和PEG分子量對甲酸脫氫酶的分配系數(shù)的影響 2.5M KCl 無 KCl 系統(tǒng)：15%PEG/15%磷酸鉀（pH7.8）雙水相萃取雙水相萃取 相系統(tǒng)的相系統(tǒng)的pH不僅直接影響相系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)，也同樣不僅直接影響相系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)，也同樣影響系統(tǒng)中

13、鹽，即影響它們解離度和離子的電荷性質(zhì)及影響系統(tǒng)中鹽，即影響它們解離度和離子的電荷性質(zhì)及數(shù)量，以及各種離子的比例，如數(shù)量，以及各種離子的比例，如H2PO4-和和HPO42-，HSO4-和和SO42-，NH3和和NH4+。進(jìn)而影響界面電位。進(jìn)而影響界面電位U2-U1，對蛋白質(zhì)的分配系數(shù)產(chǎn)生強(qiáng)烈的影響。通常對蛋白質(zhì)的分配系數(shù)產(chǎn)生強(qiáng)烈的影響。通常pH的微小的微小變化就會(huì)引起蛋白質(zhì)分配系數(shù)發(fā)生變化就會(huì)引起蛋白質(zhì)分配系數(shù)發(fā)生23數(shù)量級的變化。數(shù)量級的變化。雙水相萃取雙水相萃取00.20.40.60.866.577.588.59pHKpH 對磷酸化酶的分配系數(shù)的影響相系統(tǒng)：7.2%PEG4000/6.7%D

14、ex T500,200mM 緩沖液 PO43- Tris 在 PEG/Dex 系統(tǒng)中，當(dāng)使用 Tris 緩沖液時(shí)，在 pH7-8.5 范圍內(nèi)，不會(huì)使緩沖離子的電荷發(fā)生改變，對酶的分配系數(shù)影響不大；而在使用磷酸鹽緩沖液時(shí)，改變 pH 對緩沖離子的電荷數(shù)及其不同離子的比例影響很大，而時(shí)酶分配系數(shù)的發(fā)生明顯改變。雙水相萃取雙水相萃取溫度主要影響兩相系統(tǒng)的形成，隨著溫度的降低，分溫度主要影響兩相系統(tǒng)的形成，隨著溫度的降低，分相的臨界聚合物濃度減小，所以在臨界點(diǎn)附近，溫度相的臨界聚合物濃度減小，所以在臨界點(diǎn)附近，溫度對酶的分配系數(shù)影響較大，而在遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)時(shí)，影響對酶的分配系數(shù)影響較大，而在遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)時(shí)，

15、影響較小；在相組成一定時(shí)，溫度的降低會(huì)使相圖的結(jié)點(diǎn)較??；在相組成一定時(shí)，溫度的降低會(huì)使相圖的結(jié)點(diǎn)線增長，兩相差異增大，可引起分配系數(shù)的下降。線增長，兩相差異增大，可引起分配系數(shù)的下降。使用使用PEG/(NHPEG/(NH4 4) )2 2SOSO4 4相系統(tǒng)從細(xì)菌中萃取熒光素酶時(shí)，相系統(tǒng)從細(xì)菌中萃取熒光素酶時(shí)，溫度對分配系數(shù)的影響不明顯。溫度對分配系數(shù)的影響不明顯。雙水相萃取雙水相萃取通常酶的穩(wěn)定性會(huì)隨溫度的增高而減低，但在雙水相系統(tǒng)中，由于所使用的聚合物含有多羥基，對酶有保護(hù)作用，即使在室溫下，酶的失活也不明顯。因此酶的雙水相萃取可以在室溫下進(jìn)行，這可以節(jié)省因冷卻造成的大量能摹。雙水相萃取雙水相萃取雙水相萃取技術(shù)主要應(yīng)用于粗酶提取與回收，也可用于