醫(yī)學免疫學實驗免疫標記技術

1、醫(yī)學免疫學實驗免疫標記技術第一頁，共17頁。免疫標記技術免疫標記技術 概念概念：用：用熒光素、酶、同位素熒光素、酶、同位素等等標記標記抗體抗體或或抗原抗原用以用以測定測定相應抗原相應抗原或或抗體抗體的技術稱為的技術稱為免疫標記技術免疫標記技術。 特點特點：敏感、特異、快速，敏感、特異、快速， 定性、定量、定位定性、定量、定位。第二頁，共17頁。免疫印跡免疫印跡技術技術(western blot)(western blot)斑點金技術斑點金技術放射免疫技術放射免疫技術酶免疫酶免疫技術技術（ELISA）免疫熒光技術免疫熒光技術常用免疫標記技術：常用免疫標記技術：第三頁，共17頁。直接直接免疫熒光免

2、疫熒光熒光素熒光素直接標記直接標記抗體抗體, 檢測檢測抗原抗原。AgFluorochromeLabeled AbTissue Section常用的常用的熒光素熒光素主要有：主要有：異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素(FITC)：黃綠色藻紅蛋白藻紅蛋白(PE)：桔紅色羅丹明（羅丹明（RB200)：紅色免疫熒光免疫熒光技術：技術：直接直接免疫熒光，免疫熒光，間接間接免疫熒光免疫熒光第四頁，共17頁。間接免疫間接免疫熒光熒光,一抗一抗與標本中與標本中抗原抗原結合，再用結合，再用熒光素標記熒光素標記的的二抗二抗進行檢進行檢測。測。AgFluorochromeLabeled Anti-IgTissue Sec

3、tionUnlabeledAb高效、更靈敏高效、更靈敏2. 經濟、通用性強經濟、通用性強一抗一抗：二抗二抗：以兔源一抗為例 兔兔源源一抗一抗 木瓜/胃蛋白酶 抗體抗體Fc段段（為抗原抗原） 人蛋白：1，2，3 兔/鼠： 抗體抗體1，2，3 羊羊（驢）驢）（二抗）（二抗）免疫動物免疫動物產生抗體產生抗體多抗多抗/單抗單抗兔兔源源/鼠鼠源源抗人抗人抗原抗原種特異性：種特異性：一個一個羊源二抗羊源二抗可識別可識別所有所有兔源一抗兔源一抗，即，即一一個個二抗二抗分子分子可識別可識別一種動物一種動物源的所有一抗。源的所有一抗。 羊抗兔/鼠；驢抗兔/鼠免疫免疫羊羊產生抗體產生抗體恒定區(qū)可變區(qū)第五頁，共17

4、頁。 人工制備抗體的類型 多克隆抗體多克隆抗體抗原免疫動物后得到的動物血清（抗血清抗血清），含有針對不同不同抗原決定簇抗原決定簇的多種抗體分子多種抗體分子。Ag6抗原決定簇抗原決定簇第六頁，共17頁。單克隆抗體單克隆抗體（mAb) Khler 和 Milstein 1975年建立的技術，通過雜交瘤技術獲得的針對單一抗原決定簇的高特異性抗體高特異性抗體。7第七頁，共17頁。8抗原加工提呈，抗原肽抗原加工提呈，抗原肽第八頁，共17頁。免疫熒光技術免疫熒光技術抗C3二抗二抗補體結合位點補體結合位點見前所述第九頁，共17頁。定位定位：對對某蛋白質某蛋白質在細胞的在細胞的定位定位、定量定量（細胞（細胞質

5、質中表達）中表達）熒光染料第十頁，共17頁。共定位共定位：對對某某二個二個蛋白質蛋白質在細胞內的在細胞內的定位定位、定量定量第十一頁，共17頁。免疫熒光可免疫熒光可“定位定位” 、“定性定性” ，借助，借助圖像軟件圖像軟件可進行可進行模模擬擬“定量定量”分析分析；第十二頁，共17頁。酶標記技術免疫組織化學免疫組織化學：“定位定位” “定性定性”、“模擬定量模擬定量”；免疫印跡（免疫印跡（Western blotting）：“定性定性”、“模擬定量模擬定量”；酶聯免疫吸附試驗酶聯免疫吸附試驗（ELISA） ：“定量定量”辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶堿性磷酸酶鄰苯二胺(OPD)四甲基聯苯胺(TMB

6、)+ H2O2有色物質第十三頁，共17頁。直接法direct ELISA檢測抗原抗原： 酶酶直接標記直接標記一抗一抗辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶(HRP)TMB/OPD + H2O2有色物質抗原抗原一抗一抗鄰苯二胺(OPD)四甲基聯苯胺(TMB)酶聯免疫吸附試驗Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA)第十四頁，共17頁。雙雙抗體夾心法抗體夾心法Sandwich ELISA檢測抗原： 有兩個一抗。固相載體：固相載體：聚苯乙烯聚苯乙烯微量反應板微量反應板辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶(HRP)第十五頁，共17頁。間接法indirect ELISA病人血清病

7、人血清固相載體：固相載體：聚苯乙烯聚苯乙烯微量反應板微量反應板（工業(yè)化生產）已知抗原：乙肝表面表面抗原(HBsAg)，二抗二抗： 抗人IgM 或 IgG Fc段抗體如：檢測乙肝表面抗體乙肝表面抗體(HBsAb)加病人血清病人血清辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶(HRP)包被包被洗滌洗滌洗滌洗滌(可省可省)洗滌洗滌(不可省不可省)有色物質有色物質二抗過量二抗過量時，加入時，加入病人血清病人血清后，要不后，要不要洗滌？要洗滌？鄰苯二胺(OPD)四甲基聯苯胺(TMB)TMB/OPD + H2O2預包被板預包被板第十六頁，共17頁。空白空白 陰性陰性 陽性陽性 待測待測1 待測待測2間接ELISA法檢測血

8、清抗-HBsAb 1.加加血清血清及及對照對照(一抗一抗)第第1孔，孔，空白空白對照，加對照，加洗滌液洗滌液1滴滴第第2孔，孔，陰性陰性對照，加對照，加陰性對照血清陰性對照血清1滴滴 第第3孔，孔，陽性陽性對照，加對照，加陽性對照血清陽性對照血清1滴滴 第第4孔，孔，待檢待檢血清血清1，加，加待檢血清待檢血清1滴滴 第第5孔，孔，待檢待檢血清血清2，加，加待檢血清待檢血清1滴滴 (不洗，因為二抗過量不洗，因為二抗過量)2.加加酶結合物酶結合物 (酶結合酶結合二抗二抗)加入加入酶結合物酶結合物1滴滴（空白孔不加），混勻，（空白孔不加），混勻，37 C ，20-30min3. 洗板洗板:棄去孔內液體，注滿棄去孔內液體，注滿洗滌液洗滌液，靜置，靜置5sec甩干，重復甩干，重復3次次。4.