代謝控制分析

1、第章代謝控制分析第一頁，共55頁。 Enzyme kineticsEnzyme kinetics Metabolic Control AnalysisMetabolic Control Analysis第二頁，共55頁。6.1 酶動力學(xué)酶動力學(xué)單底物的酶催化反應(yīng)動力學(xué)模型單底物的酶催化反應(yīng)動力學(xué)模型: : 由由V. V. C .R. Henri C .R. Henri 于于19021902年及年及L. L. Michaelis Michaelis 和和M. L. Menten M. L. Menten 于于19131913年建立的。簡單的酶催化反年建立的。簡單的酶催化反應(yīng)動力學(xué)通常是指應(yīng)動力學(xué)

2、通常是指Michaelis-MentenMichaelis-Menten動力學(xué)或飽和動力學(xué)。動力學(xué)或飽和動力學(xué)。 11kk2k E+SESE+P 兩個假定：兩個假定：1.1.形成形成ESES復(fù)合物的反應(yīng)速度很快復(fù)合物的反應(yīng)速度很快. . 2. 2.第二步的逆反應(yīng)速率可忽略。此假設(shè)僅在反應(yīng)初期第二步的逆反應(yīng)速率可忽略。此假設(shè)僅在反應(yīng)初期產(chǎn)物的累積量很少時才能成立。（產(chǎn)物的累積量很少時才能成立。（快速平衡假設(shè)快速平衡假設(shè)） 19251925年年Briggs Briggs 及及HaldaneHaldane在快速平衡假設(shè)基礎(chǔ)上做了改進(jìn)：在快速平衡假設(shè)基礎(chǔ)上做了改進(jìn)：擬穩(wěn)擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)態(tài)假設(shè), ,此假設(shè)在反

3、應(yīng)初期不成立，經(jīng)過短暫過渡期后（此假設(shè)在反應(yīng)初期不成立，經(jīng)過短暫過渡期后（ms)ms)成立成立（P193, note6.1P193, note6.1） 。 第三頁，共55頁。（1）米氏方程的推導(dǎo)）米氏方程的推導(dǎo) 快速平衡假設(shè)快速平衡假設(shè) 擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)2k E+SESE+P 11kk 2PESdvkdt 02PESSSSmmmdVvkdtKK 11E SESmkKk 112ESE SESESdkkkdt 0E = E- ES 121E SESmkkKk 111010E SESEES SESESES =+ SmkkkkK 10120ES0EES SESES =0ESES =Smddtkkk

4、K 02PESSSSmmmdVvkdtKKK Km m: : 即即ESES的解離常數(shù)的解離常數(shù), ,單位濃度下復(fù)合物解離速度與形成速度之比單位濃度下復(fù)合物解離速度與形成速度之比K Km m: : 單位濃度下復(fù)合物總解離速度與形成速度之比單位濃度下復(fù)合物總解離速度與形成速度之比Kcat=Vm/E0=k2 Kcat/Km 第四頁，共55頁。 SSmmVvKSKm時 ， SSmmVvVS = Km時 ，12mvV第五頁，共55頁。 SSmmVvK 111SmmmKvVV參數(shù)的確定：雙倒數(shù)作圖法參數(shù)的確定：雙倒數(shù)作圖法第六頁，共55頁。1212kkkkESESEP1201212()k skpesekk

5、k skp121222001212()()k k sk kprk eskp eesekkk skpES0ddt 0E = E- ES121FmkkKk122RmkkKkmax20max10FRVk EVk Emaxmax / /1 / /FFRRmmFRmmVSKVPKrSKPK產(chǎn)物濃度很低時，即米氏方程產(chǎn)物濃度很低時，即米氏方程第七頁，共55頁。maxmax1 111 miKIvvKSv12-1E+SESE+P+IEIkkkiK E IEIiK ,appiI1mmmKKKKI=0I0競爭性抑制的最終作用結(jié)果競爭性抑制的最終作用結(jié)果是使是使 ，因此，因此降低了反應(yīng)速度。最大反應(yīng)降低了反應(yīng)速度。

6、最大反應(yīng)速度不變。競爭性抑制可通速度不變。競爭性抑制可通過提高底物濃度來克服。過提高底物濃度來克服。 ,appmmKK(2) Competitive inhibition enzyme kineticsmax,maxappvv iSI1SmmVvKK 121E SESmkkKk第八頁，共55頁。(3)Non-competitive inhibition enzyme kineticsmaxmax111 1 miKIvvSvK非競爭性抑制劑不是底物類似物。抑制劑與酶結(jié)非競爭性抑制劑不是底物類似物。抑制劑與酶結(jié)合的位點不是酶的活性位點，這種結(jié)合降低了酶合的位點不是酶的活性位點，這種結(jié)合降低了酶的有

7、效濃度。高底物濃度不能克服非競爭性抑制。的有效濃度。高底物濃度不能克服非競爭性抑制。必須加入其它試劑去阻止抑制劑與酶的結(jié)合。必須加入其它試劑去阻止抑制劑與酶的結(jié)合。 2 E+SESE+PIIEI+SESImmkKKiK ,appmmKKmax,maxmax1 1appivvvIK E IES I=EIESIiK I=0I0 iSI1(S )mmVvKK 121E SESmkkKk第九頁，共55頁。(4) Uncompetitive inhibition enzyme kinetics反競爭性抑制劑只與反競爭性抑制劑只與ESES復(fù)合物結(jié)合，而復(fù)合物結(jié)合，而且它與酶無親和作用。且它與酶無親和作用。

8、 VmVm值的降低要比值的降低要比KmKm值的降低更具顯著作用，其最終結(jié)果值的降低更具顯著作用，其最終結(jié)果是使反應(yīng)速率降低。是使反應(yīng)速率降低。 max,maxmax1 1appivvvIK ES I=ESIiKI=0I02E+SESE+PIESImKkiK m axm ax1111 miKIv vS vK ,appi1I1mmmKKKK iSI1SmmVvKK 121E SESmkkKk第十頁，共55頁。(5) Substrate inhibition enzyme kinetics212E+SESE+PSESmKkSK 如果底物自身有抑制作用：一種反競爭如果底物自身有抑制作用：一種反競爭抑制

9、，抑制，1/v1/v是是1/s1/s的雙曲函數(shù)，該雙曲函的雙曲函數(shù)，該雙曲函數(shù)具有一垂直和一傾斜漸近線數(shù)具有一垂直和一傾斜漸近線 12S ESESSK 12SSSSmmVvKK在低底物濃度時，在低底物濃度時，SS2 2/K/KSISI11，觀察不到抑制作用。反應(yīng)速率為，觀察不到抑制作用。反應(yīng)速率為 1SmmVvK 在高底物濃度時，在高底物濃度時，KKm m/S1/S1n1。第十五頁，共55頁。maxmaxmaxmax1lnlnlnnnnnnnnnrsrrsKKrsKrsrsrnsnKrr slpoe=nlnsmaxlnrrrln K參數(shù)n和K的確定:P205:例6.2 噻唑籃（MTT)法測定胞

10、內(nèi)NADH濃度 兩種底物MTT0X及乙醇過量，反應(yīng)中可以認(rèn)為濃度不變 ADH快速將NAD+還原為NADH，反應(yīng)體系中NADH濃度穩(wěn)定不變 dMTTred/dt=kMTT0XNADH 做標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖6.7），測定MTTred生成速度后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定對應(yīng)的NADH 第十六頁，共55頁。 HK, PFK-1, and pyruvate kinase (PYK) are the rate-limiting steps because: They are the slowest enzymes in the pathway by at least one order of magnitude (the

11、y have the lowest Vmax values). They are allosteric enzymesIn consequence, to vary the glycolytic flux, one of these enzymes has to be modified.GAPDHPGKENOPGAM6.2 6.2 代謝控制分析代謝控制分析第十七頁，共55頁。EMPEMP途徑通量控制分散，需要多個酶一起擴(kuò)增途徑通量控制分散，需要多個酶一起擴(kuò)增控制分析需要解決的問題：修飾哪些酶？酶活改變多少？控制分析需要解決的問題：修飾哪些酶？酶活改變多少？第十八頁，共55頁。（1） 基本概念與

12、定理基本概念與定理通量通量J J 反應(yīng)速率反應(yīng)速率r r 穩(wěn)態(tài)時，一條途徑的穩(wěn)態(tài)時，一條途徑的J J等于這條途徑中任何一步反應(yīng)的等于這條途徑中任何一步反應(yīng)的r r 線性途徑中最好的情況是：某步反應(yīng)速率線性途徑中最好的情況是：某步反應(yīng)速率r r提高提高a%, a%, 達(dá)到新的穩(wěn)態(tài)后，這達(dá)到新的穩(wěn)態(tài)后，這條途徑的其它所有反應(yīng)速率條途徑的其它所有反應(yīng)速率r r均提高均提高a%a%，從而流經(jīng)該反應(yīng)的通量也提高，從而流經(jīng)該反應(yīng)的通量也提高a%a% 最差的情況是：某步反應(yīng)速率最差的情況是：某步反應(yīng)速率r r提高提高a%, a%, 達(dá)到新的穩(wěn)態(tài)時，其它所有反應(yīng)速率達(dá)到新的穩(wěn)態(tài)時，其它所有反應(yīng)速率均不變化，該

13、步反應(yīng)速率恢復(fù)到原水平，流經(jīng)該反應(yīng)的通量不能提高。均不變化，該步反應(yīng)速率恢復(fù)到原水平，流經(jīng)該反應(yīng)的通量不能提高。 更一般的情況是：某步反應(yīng)速率更一般的情況是：某步反應(yīng)速率r r提高提高a%, a%, 達(dá)到新的穩(wěn)態(tài)時，其它所達(dá)到新的穩(wěn)態(tài)時，其它所有反應(yīng)速率均提高了有反應(yīng)速率均提高了b%b%，該步反應(yīng)速率從提高，該步反應(yīng)速率從提高a%a%降至提高降至提高b%b%，流經(jīng)該反應(yīng)，流經(jīng)該反應(yīng)的通量提高的通量提高b% b% 。121rrSSP 111k srsK2 1212k srsK11211111211222 12 12122121121(1)k sfk srrsKsKk ssfk sfK sfKss

14、KsKsKfssKf s新穩(wěn)態(tài)：110.52ss一般性原則：一般性原則：第十九頁，共55頁。 如何對這種影響程度實行量化？如何對這種影響程度實行量化？ 通量控制系數(shù)（通量控制系數(shù)（FCCs)FCCs) 由代謝途徑中一個由代謝途徑中一個酶活酶活的的無窮小變化無窮小變化所引起的所引起的通量通量的相對變化的相對變化與該與該酶活的相對變化酶活的相對變化之比。之比。通量控制系數(shù)（通量控制系數(shù)（Flux control coefficients)/(6.33)/JiiiiiEJ JJCEEJEChannelling effect Channelling refers to mechanisms in wh

15、ich the product of one enzyme is transferred directly to an enzyme that uses it as substrate without necessarily passing through the free solution. Only independent catalysts:Only independent catalysts:酶活酶活= =酶濃度酶濃度Many enzyme-catalysed reaction rates are linear in terms of the enzyme concentration

16、(at least in a certain range of enzyme concentrations), control coefficients can be written using enzyme concentrations 12%0%1;00%;JJaCCaaa第二十頁，共55頁。通量控制系數(shù)的加和定理通量控制系數(shù)的加和定理summation theorem 在在線性途徑線性途徑中酶促反應(yīng)的通量控制系數(shù)的和為中酶促反應(yīng)的通量控制系數(shù)的和為1 1 ：1(6.34)1IJiiC121ISSSSP;1,iidEaiIEdJaJ1212121212.JJJiiiiJJJidJdEdJd

17、JdEdEdJCCCJJJJEEEaCaCaCaThe summations are over all the steps of the system. This may include not only the steps of the pathway of interest but also of other pathways (as long as there are links between them). In principle for a whole cell, the summation would have to be over all metabolic steps of

18、that cell. Giersch, C. (1988) Control analysis of metabolic networks. 1. Homogeneous functions and the summation theorems for control coefficients. Eur. J. Biochem. 174, 509-513.9第二十一頁，共55頁。濃度控制系數(shù)濃度控制系數(shù)Concentration-control Coefficients 同樣地，途徑中某個酶活的變化也會影響到胞內(nèi)代同樣地，途徑中某個酶活的變化也會影響到胞內(nèi)代謝物的濃度，這種影響程度用濃度控制系數(shù)

19、來量化：謝物的濃度，這種影響程度用濃度控制系數(shù)來量化：/;1,1,1(6.35)/jjjiijiijisssECiIjIEEsE121ISSSSPI I個反應(yīng)，個反應(yīng)，I-1I-1個胞內(nèi)代謝物個胞內(nèi)代謝物這些系數(shù)說明了當(dāng)?shù)谶@些系數(shù)說明了當(dāng)?shù)趇 i個酶活性無窮小變化所引起的第個酶活性無窮小變化所引起的第j j個中個中間代謝物濃度的相對變化與酶活相對變化之比。間代謝物濃度的相對變化與酶活相對變化之比。 第二十二頁，共55頁。濃度控制系數(shù)濃度控制系數(shù)Concentration-control Coefficients101,1(6.36)IijiCjI濃度控制系數(shù)的加和定理濃度控制系數(shù)的加和定理所有

20、酶按同樣的程度所有酶按同樣的程度a a改變時（見注釋改變時（見注釋6.36.3），中間產(chǎn)物濃度保持不），中間產(chǎn)物濃度保持不變：變： 這表明對每個中間產(chǎn)物，至少有一個酶施加負(fù)控制，即當(dāng)該酶的濃度增這表明對每個中間產(chǎn)物，至少有一個酶施加負(fù)控制，即當(dāng)該酶的濃度增加時代謝物濃度卻下降了加時代謝物濃度卻下降了 12121211200jjiIjjjjijjijijijjidssdsdsdsdsdededeCCCaCsseee As a consequence of the summation theorems, one concludes that the control coefficients are

21、 global properties and that in metabolic systems, control is a systemic property, dependent on all of its elements (steps). 第二十三頁，共55頁。 同樣地，代謝物濃度的變化對途徑中的某些反應(yīng)速率也有同樣地，代謝物濃度的變化對途徑中的某些反應(yīng)速率也有影響，這種影響程度用彈性系數(shù)來描述：影響，這種影響程度用彈性系數(shù)來描述： 代謝物代謝物j j對于第對于第i i個酶的彈性系數(shù)可定義為：個酶的彈性系數(shù)可定義為： 彈性系數(shù)彈性系數(shù) Elasticity cofficients/;1

22、,1,1(6.37)/jiiijijjijsr rriIjIssrs和第第i i個反應(yīng)速率對于第個反應(yīng)速率對于第j j個代謝物濃度的彈性：在假定其它系統(tǒng)個代謝物濃度的彈性：在假定其它系統(tǒng)變量保持不變的條件下，由代謝物濃度的無窮小變化所引起的變量保持不變的條件下，由代謝物濃度的無窮小變化所引起的反應(yīng)速率相對變化與代謝物濃度相對變化之比反應(yīng)速率相對變化與代謝物濃度相對變化之比負(fù)的彈性系數(shù)表明當(dāng)?shù)谪?fù)的彈性系數(shù)表明當(dāng)?shù)趈 j個中間產(chǎn)物濃度增加時第個中間產(chǎn)物濃度增加時第i i個反應(yīng)速率降低，反之亦然。個反應(yīng)速率降低，反之亦然。如果第如果第j j個中間產(chǎn)物不影響第個中間產(chǎn)物不影響第i i個酶反應(yīng)的反應(yīng)速率

23、（此反應(yīng)的速率可能與個酶反應(yīng)的反應(yīng)速率（此反應(yīng)的速率可能與s sj j的的濃度無關(guān)或酶被飽和），那么濃度無關(guān)或酶被飽和），那么 0jiUnlike control coefficients, elasticity coefficients are not systemic properties but rather measure how isolated enzymes are sensitive to changes in parameters. （反應(yīng)速率只和底物、產(chǎn)物、調(diào)節(jié)物這三類代謝物（反應(yīng)速率只和底物、產(chǎn)物、調(diào)節(jié)物這三類代謝物有關(guān)）有關(guān)）第二十四頁，共55頁。 A particul

24、arly useful and important feature of MCA is that it can relate the kinetic properties of the individual reactions (local properties) with (global) properties of the whole intact pathway. This is done through the connectivity theorems that relate the control coefficients and the elasticity coefficien

25、ts of steps with common intermediate metabolites Kacser, H. & Burns, J.A. (1973) The control of flux. Symp. Soc. Exp. Biol. 27, 65-104.Connectivity theorem第二十五頁，共55頁。通量控制的連接定理通量控制的連接定理Flux-control connectivity theorem10;1,1(6.38)IJijiiCjIP215 P215 證明證明具有具有低的通量控制系數(shù)低的通量控制系數(shù)的反應(yīng)具有的反應(yīng)具有高彈性系數(shù)高彈性系數(shù)反之，具

26、有反之，具有高的通量控制系數(shù)高的通量控制系數(shù)的反應(yīng)具有的反應(yīng)具有低彈性系數(shù)低彈性系數(shù)因為：具有高通量控制系數(shù)的反應(yīng)的速率變化將使其它所有反應(yīng)速率（具有低因為：具有高通量控制系數(shù)的反應(yīng)的速率變化將使其它所有反應(yīng)速率（具有低的通量控制系數(shù)）也發(fā)生較大的變化，而這種變化是由代謝濃度的變化傳遞的。的通量控制系數(shù)）也發(fā)生較大的變化，而這種變化是由代謝濃度的變化傳遞的。所以其它反應(yīng)對代謝物濃度變化一定比較敏感，即具有較高的彈性系數(shù)。所以其它反應(yīng)對代謝物濃度變化一定比較敏感，即具有較高的彈性系數(shù)。相反，具有低通量控制系數(shù)的反應(yīng)的速率變化也將引起代謝物濃度變化，但代謝物濃度變相反，具有低通量控制系數(shù)的反應(yīng)的速

27、率變化也將引起代謝物濃度變化，但代謝物濃度變化不能使其它反應(yīng)發(fā)生較大的變化化不能使其它反應(yīng)發(fā)生較大的變化121ISSSSP1112123131.0JJJJIICCCC1(1)12(1)23(1)3(1).0JJJJIIIIIICCCC1212223232.0JJJJIICCCC1j 2j I-1j 第二十六頁，共55頁。濃度控制的連接定理濃度控制的連接定理Concentration-control connectivity theorem111;1,1(6.39)0;,1,1(6.40)IijjiiIijkiiCjICj kIkj 和利用矩陣符號，可以將（利用矩陣符號，可以將（6.346.34

28、）、（）、（6.366.36）、（）、（6.386.38）、）、（6.396.39）、（）、（6.406.40）中所有的法則概括為：）中所有的法則概括為：1111,1111212212,11,11,21,1,1111100010(6.41)001JIJIIJIIIIIII ICCCCCCCCC121ISSSSPI I個反應(yīng)，個反應(yīng)，I-1I-1個胞內(nèi)代謝物個胞內(nèi)代謝物下標(biāo)下標(biāo)j j、k k表示代謝物，表示代謝物，i i表示反應(yīng)表示反應(yīng)加和加和連接連接通量通量 濃度濃度I-1個等式個等式（I-1）2-（I-1)個等式個等式（I-1I-1）I I個個 I I個個 I(I-1)I(I-1)個個代謝物

29、1代謝物2代謝物I-1代謝物1代謝物2代謝物I-1第二十七頁，共55頁。此時此時I I為單位陣（維數(shù)為單位陣（維數(shù)I II I）。對于非奇異陣）。對于非奇異陣E E，控制系數(shù)為：，控制系數(shù)為： *(6.42)ECI*1(6.43)CE例例6.3 6.3 由彈性系數(shù)求通量控制系數(shù)由彈性系數(shù)求通量控制系數(shù)(P216)(P216)11111111121111111211212(1)(1)(1)1(1)(2)eqeqeqeqKbsyKr sk sKsassys rKrsKsKbKKar scs ryc 111222;eqKksKKJxyJabcksksss第二十八頁，共55頁。由式由式6 64141得

30、：得：1111112212111001JJCCCC1111221110JJCC 12112111111211121112112111111010JJCC 1212121111JCbyacx由于知道動力學(xué)方程后求彈性系數(shù)比較容易，所以可以方由于知道動力學(xué)方程后求彈性系數(shù)比較容易，所以可以方便地通過彈性系數(shù)得到通量控制系數(shù)便地通過彈性系數(shù)得到通量控制系數(shù)121rrSSP 1222()()4)aaaaacyaxaxxbbbbb C1J是是x的減函數(shù)，的減函數(shù)， P217, Figure 6. 92 1212k srsK1111(1)eqk srssKK6.2810,1JxC則第二十九頁，共55頁。例

31、例6 64 4 代謝控制分析舉例代謝控制分析舉例123SSSSP4 4個反應(yīng)，個反應(yīng)，3 3個胞內(nèi)代謝物個胞內(nèi)代謝物11 111*1122 23212*2233 3323*3344 434*4(1)11(2)11(3)1(4)1inhibsrk essKKsrk esssKKKsrk essKKsrk epsKK第三十頁，共55頁。*11122212*33322223*3333443341111/(1/)00(1/)/00/(1/)0inhibs KKKsKaaEKsKs KKaass KKKp KKsaa*1111*21222*32333*43444(1/)(1/)(1/)(1/)asKsK

32、asKsKasKsKasKsK123SSSSP11110.140.960.390.270.90.5000.240.270.690.4800.20.700.070.081.230.1401.00.50.50.550.610.150.89ECFCCsr1r2r3r4S1 S2 S3第三十一頁，共55頁。 中間產(chǎn)物中間產(chǎn)物s s3 3濃度的增加將阻礙第二步反應(yīng)（濃度的增加將阻礙第二步反應(yīng)（s s1 1轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)化為s s2 2）因此增）因此增加處于反饋控制的酶加處于反饋控制的酶E E2 2的濃度的方法的濃度的方法并不是提高通量的最佳方法并不是提高通量的最佳方法 123SSSSP11110.140.96

33、0.390.270.90.5000.240.270.690.4800.20.700.070.081.230.1401.00.50.50.550.610.150.89ECFCCsr1r2r3r4S1 S2 S3從濃度控制系數(shù)可以看出：當(dāng)最后一個酶的活性提高時，最從濃度控制系數(shù)可以看出：當(dāng)最后一個酶的活性提高時，最后一個中間產(chǎn)物后一個中間產(chǎn)物s s3 3及第一個中間產(chǎn)物及第一個中間產(chǎn)物s s1 1的濃度迅速降低然而的濃度迅速降低然而同時第二個中間產(chǎn)物同時第二個中間產(chǎn)物s s2 2的濃度增加的濃度增加 在引入在引入FCCs的概念之前，一個調(diào)節(jié)酶經(jīng)常意味著一個限的概念之前，一個調(diào)節(jié)酶經(jīng)常意味著一個限速

34、步驟，但在引入速步驟，但在引入FCCs的概念后發(fā)現(xiàn)這并不是實情。的概念后發(fā)現(xiàn)這并不是實情。MCA理論表明限速步驟這一概念是毫無道理的，取而代之理論表明限速步驟這一概念是毫無道理的，取而代之的應(yīng)是的應(yīng)是FCCs值和限速程度！值和限速程度！ 第三十二頁，共55頁。123SSSSP如果反饋抑制能被解除，即如果反饋抑制能被解除，即 32320 0，則可計算出控制系，則可計算出控制系數(shù)矩陣：數(shù)矩陣： 0.270.820.750.520.470.521.340.940.130.151.050.270.130.151.041.73CS1 S2 S3r1r2r3 r4此時速率控制步驟現(xiàn)在為酶促反應(yīng)中的第二個酶

35、。因此它為潛此時速率控制步驟現(xiàn)在為酶促反應(yīng)中的第二個酶。因此它為潛在的速率控制酶，即：如果抑制被去除或大量減少時，第二個在的速率控制酶，即：如果抑制被去除或大量減少時，第二個反應(yīng)將控制總體通量反應(yīng)將控制總體通量 當(dāng)反饋抑制去除后，最后一行的所有三個濃度系數(shù)成為負(fù)值。增加最當(dāng)反饋抑制去除后，最后一行的所有三個濃度系數(shù)成為負(fù)值。增加最后一個酶的活性將降低所有中間產(chǎn)物的濃度。后一個酶的活性將降低所有中間產(chǎn)物的濃度。 上游代謝物（底上游代謝物（底物）為負(fù)值，下物）為負(fù)值，下游代謝物（產(chǎn)物）游代謝物（產(chǎn)物）為正值為正值第三十三頁，共55頁。假設(shè)構(gòu)建一個新菌株，該菌株擁有一與假設(shè)構(gòu)建一個新菌株，該菌株擁有

36、一與E E2 2相似的酶但是彈性系相似的酶但是彈性系數(shù)不同。第二步酶促反應(yīng)的彈性系數(shù)為：數(shù)不同。第二步酶促反應(yīng)的彈性系數(shù)為：s s3 3的反饋抑制減小并且的反饋抑制減小并且 變小。具有細(xì)微差別變小。具有細(xì)微差別E E2 2的生產(chǎn)菌的生產(chǎn)菌株代替了原始菌株，控制系數(shù)矩陣變?yōu)椋褐甏媪嗽季辏刂葡禂?shù)矩陣變?yōu)椋?222321.00.60.3 0.250.830.720.500.230.250.650.450.190.220.880.390.330.360.491.34C*22/KK采用新酶后最后一個酶的通量控制能力減少，每種酶的通量采用新酶后最后一個酶的通量控制能力減少，每種酶的通量控制系數(shù)都接

37、近平均值控制系數(shù)都接近平均值0.250.25。通量控制分散，因此沒有酶在。通量控制分散，因此沒有酶在酶促反應(yīng)的通量控制中占優(yōu)勢酶促反應(yīng)的通量控制中占優(yōu)勢 0.50.21.0第三十四頁，共55頁。上面的討論沒有包括操作條件對細(xì)胞特性的影響，需要注意的是通量上面的討論沒有包括操作條件對細(xì)胞特性的影響，需要注意的是通量控制系數(shù)可能隨著操作條件的變化發(fā)生巨大變化控制系數(shù)可能隨著操作條件的變化發(fā)生巨大變化當(dāng)對具有大的通量控制系數(shù)的反應(yīng)（酶）進(jìn)行操作后，通量控制當(dāng)對具有大的通量控制系數(shù)的反應(yīng)（酶）進(jìn)行操作后，通量控制系數(shù)的值大小變得差不多，但是這并不一定表明經(jīng)由途徑的通量系數(shù)的值大小變得差不多，但是這并不

38、一定表明經(jīng)由途徑的通量要比原始菌株的通量高很多。進(jìn)一步改進(jìn)需要繼續(xù)增加途徑中所要比原始菌株的通量高很多。進(jìn)一步改進(jìn)需要繼續(xù)增加途徑中所有酶的劑量有酶的劑量 當(dāng)知道當(dāng)知道s s、p p及動力學(xué)方程時，可通過計算得到所有胞內(nèi)代謝及動力學(xué)方程時，可通過計算得到所有胞內(nèi)代謝物濃度。并計算出彈性系數(shù)（物濃度。并計算出彈性系數(shù)（s si i的復(fù)雜函數(shù)），最后求出控制的復(fù)雜函數(shù)），最后求出控制系數(shù)矩陣系數(shù)矩陣C(C(包括通量控制和濃度控制系數(shù)）包括通量控制和濃度控制系數(shù)）在對酶進(jìn)行修飾前（動力學(xué)參數(shù)的改變）必須最優(yōu)化當(dāng)前反應(yīng)網(wǎng)在對酶進(jìn)行修飾前（動力學(xué)參數(shù)的改變）必須最優(yōu)化當(dāng)前反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)：通過模擬在不同絡(luò)：通過

39、模擬在不同s s及及p p值下的通量實現(xiàn)通量最大化。值下的通量實現(xiàn)通量最大化。胞內(nèi)代謝物濃度的變化較小的原則胞內(nèi)代謝物濃度的變化較小的原則第三十五頁，共55頁。（2） FCCs的確定方法的確定方法 直接法：直接法：通過對通量和酶活的測量來直接確定控制系數(shù)的通過對通量和酶活的測量來直接確定控制系數(shù)的值，活力的變化很小但并不是無窮小值，活力的變化很小但并不是無窮小 間接法間接法：確定彈性系數(shù)的值，隨后通過確定彈性系數(shù)的值，隨后通過 MCAMCA定理計算得定理計算得出控制系數(shù)出控制系數(shù) 瞬時代謝物濃度法瞬時代謝物濃度法 大偏差理論：大偏差理論：通過測量由酶活的大范圍波動所導(dǎo)致的通量變通過測量由酶活的

40、大范圍波動所導(dǎo)致的通量變化來計算化來計算FCCsFCCs的方法的方法 linlog kinetics method第三十六頁，共55頁。直接法 在某一酶活處的在某一酶活處的FCCFCC值值等于曲線中該酶活處等于曲線中該酶活處切線的斜率用相應(yīng)的切線的斜率用相應(yīng)的通量酶活比通量酶活比J/EJ/E歸一化歸一化 基因工程方法基因工程方法: :構(gòu)建大量的突變株，這些突變株中某個酶構(gòu)建大量的突變株，這些突變株中某個酶的表達(dá)量不同（或酶活不同），測定所有突變株在的表達(dá)量不同（或酶活不同），測定所有突變株在同一同一操作條件下操作條件下的通量的通量: :得到得到J-EJ-E關(guān)系圖關(guān)系圖 滴定法：滴定法：純化酶純

41、化酶提高酶活或?qū)Ｒ恍蕴岣呙富罨驅(qū)Ｒ恍砸种苿┮种苿┙档兔富?，檢測產(chǎn)降低酶活，檢測產(chǎn)物或底物變化得到通量物或底物變化得到通量/(6.33)/JiiiiiEJ JJCEEJE第三十七頁，共55頁。1.The perturbations should be very small - because the steady state moves when the perturbations are finite, there is an error associated with large perturbations (the larger they are, the bigger the error

42、. To minimize this error the perturbations should be small, something like 1% would be ideal. However, the effects of small perturbations are usually also small and so are very difficult to detect. More often perturbations of over 10% are used, even though they imply some error in the results. 2.Inh

43、ibitors must be specific - if we want to perturb the rate of one reaction by adding an inhibitor, this must only affect that reaction alone, not any of the others in the system. It is often difficult to fulfil this requirement.3.The rate of reaction must change linearly with the enzyme concentration

44、, if we want to use the enzyme concentration as the parameter to perturb. If the relation between rate and enzyme concentration is not linear, then the resulting control coefficients will not conform to the summation theorems. Several problems associated with these approaches: 第三十八頁，共55頁。 這種方法有兩個重要的

45、前提條件：這種方法有兩個重要的前提條件： 代謝系統(tǒng)中的所有反應(yīng)和有關(guān)的調(diào)節(jié)作用都被充分的描述代謝系統(tǒng)中的所有反應(yīng)和有關(guān)的調(diào)節(jié)作用都被充分的描述 系統(tǒng)處于穩(wěn)態(tài)，初始底物和最后產(chǎn)物的濃度是定值系統(tǒng)處于穩(wěn)態(tài)，初始底物和最后產(chǎn)物的濃度是定值 為了確保這些條件得到滿足，最好至少直接測定系統(tǒng)的一個控制系為了確保這些條件得到滿足，最好至少直接測定系統(tǒng)的一個控制系數(shù)來對結(jié)果進(jìn)行檢驗。數(shù)來對結(jié)果進(jìn)行檢驗。 測定彈性系數(shù)的方法：測定彈性系數(shù)的方法： a. a. 通過動力學(xué)模型計算彈性系數(shù)通過動力學(xué)模型計算彈性系數(shù) 胞內(nèi)酶動力學(xué)是否正確描述了胞內(nèi)酶的功能？胞內(nèi)酶動力學(xué)是否正確描述了胞內(nèi)酶的功能？ 大多數(shù)酶動力學(xué)的研

46、究是基于對初始反應(yīng)速度的測量，而此時反大多數(shù)酶動力學(xué)的研究是基于對初始反應(yīng)速度的測量，而此時反應(yīng)產(chǎn)物并不存在，顯然這并不代表胞內(nèi)的真實情況應(yīng)產(chǎn)物并不存在，顯然這并不代表胞內(nèi)的真實情況 胞內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性，包括很多可能是效應(yīng)物的代謝物，而體外實驗可能會遺胞內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性，包括很多可能是效應(yīng)物的代謝物，而體外實驗可能會遺漏某些重要效應(yīng)物。漏某些重要效應(yīng)物。 間接法第三十九頁，共55頁。b.b.雙調(diào)法雙調(diào)法此反應(yīng)的速度依賴于式中所示化合物的濃度，即此反應(yīng)的速度依賴于式中所示化合物的濃度，即r r= =f f( (c cA A, ,c cB B) )。 在在穩(wěn)態(tài)下穩(wěn)態(tài)下J= J= r r ，因此有：，因

47、此有： rAB /lnlnlnlnABABABAAABBBrrrrAABBAABBrrr rrr rrdJdcdcdcdcccccccccrdcdcJdcdc測定穩(wěn)態(tài)時兩個代謝物的濃度和通量，然后引入很小的一個擾測定穩(wěn)態(tài)時兩個代謝物的濃度和通量，然后引入很小的一個擾動，例如改變細(xì)胞外底物的濃度，來產(chǎn)生一組新的通量和代謝動，例如改變細(xì)胞外底物的濃度，來產(chǎn)生一組新的通量和代謝物濃度的測量值。通過用有窮差異來對上式的微分進(jìn)行近似化，物濃度的測量值。通過用有窮差異來對上式的微分進(jìn)行近似化，這個干擾實驗就產(chǎn)生了一個方程。這個干擾實驗就產(chǎn)生了一個方程。換一種干擾，例如改變產(chǎn)物濃度產(chǎn)生了第二個方程。兩個干換

48、一種干擾，例如改變產(chǎn)物濃度產(chǎn)生了第二個方程。兩個干擾實驗就可以求得兩個彈性系數(shù)。擾實驗就可以求得兩個彈性系數(shù)。兩組干擾產(chǎn)生的數(shù)據(jù)不能線兩組干擾產(chǎn)生的數(shù)據(jù)不能線性相關(guān)性相關(guān) ！干擾實驗的數(shù)目取決于函數(shù)！干擾實驗的數(shù)目取決于函數(shù)f !f !第四十頁，共55頁。 如果知道其中一個彈性系數(shù)，則另一個可通過單調(diào)節(jié)實如果知道其中一個彈性系數(shù)，則另一個可通過單調(diào)節(jié)實驗獲得驗獲得這種方法的優(yōu)點是可以應(yīng)用幾個同類型的但調(diào)節(jié)幅度不同這種方法的優(yōu)點是可以應(yīng)用幾個同類型的但調(diào)節(jié)幅度不同的調(diào)節(jié)，并且可用作圖法來確定方程中的微分部分的調(diào)節(jié)，并且可用作圖法來確定方程中的微分部分 c. 單調(diào)法單調(diào)法d. Top-down：自

49、上向下法：自上向下法PXSGroupGroup21在許多情況下，并不需要知道所有的在許多情況下，并不需要知道所有的FCCsFCCs值，最重要的是知道值，最重要的是知道那些（個）反應(yīng)具有最大的控制系數(shù)那些（個）反應(yīng)具有最大的控制系數(shù)v分割代謝途徑，通過雙調(diào)法實驗或單調(diào)法實驗確定組彈性系數(shù)，分割代謝途徑，通過雙調(diào)法實驗或單調(diào)法實驗確定組彈性系數(shù)，求出求出Group FCCsGroup FCCsv重新分割，直到找到對通量實行主要控制的反應(yīng)或反應(yīng)組重新分割，直到找到對通量實行主要控制的反應(yīng)或反應(yīng)組 反應(yīng)組之間只能通過反應(yīng)組之間只能通過X X發(fā)生相互作用！發(fā)生相互作用！第四十一頁，共55頁。 大偏差理論

50、大偏差理論Large deviations/JiiiiiEJ JJCEEJE注意到斜率注意到斜率J/E與原始點與原始點處的處的dJ/dE不同，因此用不同，因此用J/E來代替來代替dJ/dE計算通量計算通量控制系數(shù)就會導(dǎo)致錯誤的結(jié)控制系數(shù)就會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果果 neneeeXXXXXXn1321032101:12131:21:11111nnnnccKJee Ke Ke Ke:e:酶活酶活 K Ki i: :常數(shù)常數(shù)niinKK1: 1121iiiiEJE雙曲線關(guān)系式雙曲線關(guān)系式第四十二頁，共55頁。E/JiiiiiEJ JJCEEJE大偏差理論是一種強(qiáng)有力的分析工具，它將大偏差理論是一種強(qiáng)有力的分

51、析工具，它將MCAMCA的無窮小的限制擴(kuò)展的無窮小的限制擴(kuò)展到可測量的實驗領(lǐng)域。但是該強(qiáng)調(diào)的是到可測量的實驗領(lǐng)域。但是該強(qiáng)調(diào)的是: :前面公式的推導(dǎo)是通過一個前面公式的推導(dǎo)是通過一個經(jīng)過簡化的一級動力學(xué)的近似表達(dá)式來實現(xiàn)的。所以用這些公式來分經(jīng)過簡化的一級動力學(xué)的近似表達(dá)式來實現(xiàn)的。所以用這些公式來分析一個具有高度非線性特點的系統(tǒng)就可能導(dǎo)致不確定的結(jié)果析一個具有高度非線性特點的系統(tǒng)就可能導(dǎo)致不確定的結(jié)果 第四十三頁，共55頁。通量控制系數(shù)估算表達(dá)式的推導(dǎo)通量控制系數(shù)估算表達(dá)式的推導(dǎo)010020001002()/1/1iiiiJiiiiiiiEEiiiiEJ JEECEEEJEJE0211Jii

52、CE/rJiiriiiEJ JJCEEJE0riiErE 01102211rriiiiriiiiEr EJEr E0100022(1)(1)ririiiiiJJJEEEr EE 0211riiiriEr EJ JiirriJiCxEJEEJD2011第四十四頁，共55頁。例：鼠肝細(xì)胞中的色氨酸代謝例：鼠肝細(xì)胞中的色氨酸代謝 基態(tài)：無誘導(dǎo)物時擾動后狀態(tài)：有誘導(dǎo)物 通過激素誘導(dǎo)，色氨酸2，3-加雙氧酶的活性（vmax）從基本態(tài)的13.7升至101mol(g DW h)-1 ,通量由基本態(tài)的2.6升至7.8mol(g DW h)-1 代謝主要包括兩步：細(xì)胞吸收色氨酸和色氨酸2，3-加雙氧酶分解色氨酸

53、 77. 08 . 7101)7 .13101(6 . 28 . 7rrTDJTDJTDJEEJDC基態(tài)：1 0.770.23JtransportC 擾動后的誘導(dǎo)狀態(tài)：2.67.8 13.70.3113.7 101 2.6rJJTDTDTDrEJCDE J1 0.310.69JtransportC 大偏差法能同時確定擾動前、后兩個狀態(tài)的通量控制系數(shù)大偏差法能同時確定擾動前、后兩個狀態(tài)的通量控制系數(shù)第四十五頁，共55頁。大偏差理論的基礎(chǔ)大偏差理論的基礎(chǔ)maxmaxmaxmaxmax / /1 / /1 / /FRFmFRFFFRRmmmmFRFRmmmmVVKSPKKVVSKVPKrSKPKSK

54、PKmaxmaxmax 1 / /FRFFmmFRRFmmmVVKKrSPSKPKKV00 eeePPrCESeSKKeCEC REmax000,FeeFFmSmSVk EC ECK kK k為常數(shù)1 / /tanFRSmmkSKPKconst maxmax1RFmRFmVKKKVE為酶活，R為比例因子第四十六頁，共55頁。（a）ciKmi,； cjKmj, , ks 1（b b）當(dāng)所觀察的酶活變化并沒有引起底物對酶的飽和度的大幅變化時。）當(dāng)所觀察的酶活變化并沒有引起底物對酶的飽和度的大幅變化時。12012eeXXX 11101222121110221221021112211cJrecKcJr

55、ecKKK e ce cccKececcKKe Ke221 2221 1 201010021221112111e e ccK e e ce ce ccKK KJe Keee K112 / FmdisskESSKKEkk1 / /tanFRSmmkSKPKconst 第四十七頁，共55頁。neneeeXXXXXXn1321032101:12131:21:11111nnnnccKJee Ke Ke K 對于任一酶來說，當(dāng)其它酶活不變時對于任一酶來說，當(dāng)其它酶活不變時001:101:11:1:1:11:11:121:1()()1111RRieiinnniinnniiiiiiiieicccccKcKKKKEJCKCKECe KeCEeCE如果所有的其它酶活保持不變，上式可以產(chǎn)生一個象圖示那樣形狀的通如果所有的其它酶活保持不變，上式可以產(chǎn)生一個象圖示那樣形狀的通量量酶活關(guān)系曲線，這證實了簡化的動力學(xué)表達(dá)式符合基本的準(zhǔn)則酶活關(guān)系曲線，這證實了簡化的動力學(xué)表達(dá)式符合基本的準(zhǔn)則 第四十八頁，共55頁。瞬時代謝物濃度法瞬時代謝物濃度法這種方法的應(yīng)用有四個假定：這種方法的應(yīng)用有四個假定： 1.1.外部代謝物庫對代謝途徑的動力學(xué)沒有影響，或它們的濃度被外部代謝物庫對代謝途徑的動力學(xué)沒有影響，或它們的濃度被控制在一個穩(wěn)態(tài)水平。這也是一個控制在一個穩(wěn)態(tài)水平。這