（精心整理）雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量

1、實驗二十 蛋白質(zhì)含量測定雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量一、實驗目的學習和掌握用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。二、實驗原理在堿性溶液中，雙縮脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)與二價銅離子作用形成紫紅色的絡(luò)合物，這一反應稱雙縮脲反應。凡分子中含二個或二個以上酰胺基(CO-NH2)，或與此相似的基團如CH2-NH2，CS-NH2，C(NH)NH2的任何化合物，無論這類基團直接相連還是通過一個碳或氮原子間接相連，均可發(fā)生上述反應。蛋白質(zhì)分子含有眾多肽鍵(CO-NH)，可發(fā)生雙縮脲反應，且呈色強度在一定濃度范圍內(nèi)與肽鍵數(shù)量即與蛋白質(zhì)含量成正比，可用比色法測定蛋白含量。測定范圍為110mg蛋白質(zhì)。干擾這

2、一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。 此法的優(yōu)點是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。 三、實驗試劑和器材試劑1雙縮脲試劑： 取CuSO4·5H20(c.P.)1.5g和酒石酸鉀鈉(c.P.)6.0g以少量蒸餾水溶解，再加2.5molL NaOH溶液300ml，KI 1.0g，然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。長期放置后若有暗紅色沉淀出現(xiàn)，即不能使用。 2標準蛋白質(zhì)溶液： 用標準的結(jié)晶牛血清清蛋白（BSA）或標準酪蛋白，配制成10g/L的標準蛋白溶液，可用B

3、SA濃度1g/L的A280為0.66來校正其純度。如有需要，標準蛋白質(zhì)還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標準蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。 器材 1試管：15×150mm 試管7只； 21ml，5ml移液管；3坐標紙 ；4721分光光度計。 四、實驗操作取試管7支，編號，按下表操作： 試劑(ml)管號空白管12345測定管蛋白標準液（10g/L）-0.10.20.30.40.5生理鹽水0.50.40.30.20.1-0.4待測樣品-0.1雙縮脲試劑3.03.03.03.0

4、3.03.03.0相當?shù)鞍踪|(zhì)（g/L）01020304050- 混勻，37水浴20分鐘，冷卻至室溫，在分光光度計波長540nm處，用空白管調(diào)零，讀取各管吸光度值。15為標準曲線管，測得吸光度后，以吸光度為縱坐標，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標繪制標準曲線。以測定管的吸光度，在標準曲線上求得蛋白質(zhì)濃度。注意事項 1雙縮脲試劑中，加入酒石酸鉀鈉，Cu2+形成穩(wěn)定的絡(luò)合銅離子，以防止CuSO4·5H20不穩(wěn)定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸鉀鈉與CuSO4·5H20之比不低于31，加入KI作為抗氧化試劑。 2雙縮脲試劑要封閉貯存，防止吸收空氣中的二氧化碳。 3本法各種蛋白質(zhì)的顯色程度基本相同，重復性好，幾乎不受溫度影響，唯一缺點是靈敏度較低。 4黃疸血清、嚴重溶血對本法有明顯干擾。 思考題 1雙縮脲