固定化細(xì)胞技術(shù)

1、固定化細(xì)胞技術(shù)固定化細(xì)胞技術(shù)目 錄固定化細(xì)胞技術(shù)概述一固定化細(xì)胞載體二固定化細(xì)胞的制備方法三固定化細(xì)胞的反應(yīng)特性四一、固定化細(xì)胞技術(shù)概述 固定化細(xì)胞是指固定在水不溶性載體上，在一定的空間范圍進(jìn)行生命活動的細(xì)胞。它是用于獲得細(xì)胞的酶和代謝產(chǎn)物的一種方法，起源于20世紀(jì)70年代，是在固定化酶的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)。由于固定化細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長、繁殖和新陳代謝，所以又稱固定化活細(xì)胞或固定化增至細(xì)胞。通過各種方法將細(xì)胞和水不溶性載體結(jié)合，制備固定化細(xì)胞的過程成為細(xì)胞固定化。 固定化細(xì)胞技術(shù)（簡稱IMC），也稱固定化微生物技術(shù)，是指通過化學(xué)或物理手段，將微生物細(xì)胞固定在載體上使之成為不懸浮于水但仍保

2、留其固有的生物催化活性，在適宜條件下能被重復(fù)連續(xù)使用的生物工程技術(shù)。最初主要用于工業(yè)微生物發(fā)酵中。70年代后期，由于水污染問題日益嚴(yán)重，迫切需要開發(fā)高效廢水處理技術(shù)。于是人們開始考慮將固定化細(xì)胞技術(shù)引入廢水處理領(lǐng)域。該技術(shù)可將篩選出的優(yōu)勢菌種或微生物加以固定，從而構(gòu)成一個(gè)高效的廢水處理系統(tǒng)。固定化細(xì)胞技術(shù)與傳統(tǒng)環(huán)境治理方法相比，具有以下優(yōu)勢： (1)微生物細(xì)胞的固定可以使容器內(nèi)的微生物活性和濃度得以有效保持，有利于提高污染物的去除效率和處理負(fù)荷；(2)采取固定化微生物細(xì)胞技術(shù)的手段，可以減少污泥產(chǎn)量，降低后續(xù)污泥處理的負(fù)擔(dān)；(3)微生物細(xì)胞固定化所形成的顆粒態(tài)有助于沉淀過程中的泥水分離；(4)

3、將可以降解一些難以降解具有有機(jī)物特質(zhì)的微生物細(xì)胞固定化，可以有效處理特殊行業(yè)廢水；(5)載體對微生物起到保護(hù)作用，使固定化的微生物細(xì)胞對有毒物的承載能力強(qiáng)，穩(wěn)定性較好；(6)微生物細(xì)胞被固定后，單位容器內(nèi)的生物量能夠維持在高濃度，從而提高降解效率，減少微生物處理所需容積。二、固定化細(xì)胞載體常用載體無機(jī)載體：有機(jī)載體：如多孔玻璃、氧化鋁、活性炭、石英砂、硅膠、硅藻土、多孔陶瓷、高嶺土、沸石等。多糖類：蛋白質(zhì)類：水凝膠：空心纖維：酚醛樹脂類和微生物丸等（研究重點(diǎn)）如纖維素、交聯(lián)葡萄糖、DEAE-纖維素、幾丁質(zhì)、鹿角菜膠和瓊脂等。如膠原-纖維蛋白、膠朊和明膠等。如聚丙烯酰胺。如醋酸纖維素、聚氯乙烯和

4、聚丙烯腈共聚物等。復(fù)合載體：由有機(jī)和無機(jī)載體材料結(jié)合而成，有利于兩者性能優(yōu)勢互補(bǔ)，它具備了有機(jī)高分子良好的生物相容性和無機(jī)材料較高的穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度等優(yōu)點(diǎn)。如海藻酸鈉/SiO2復(fù)合水凝膠。 開發(fā)篩選理想的固定化細(xì)胞載體是固定化細(xì)胞技術(shù)能否投入使用的關(guān)鍵。優(yōu)良載體應(yīng)具有以下特性：（1）載體應(yīng)具備一定的容量，可以偶聯(lián)足夠的生物分子；（2）載體表面應(yīng)具有化學(xué)活性基團(tuán)，這些基團(tuán)可以直接或經(jīng)過較為溫和的化學(xué)方法活化后與生物分子偶聯(lián)；（3）載體的作用僅是使生物分子固定化，對生物分子而言載體應(yīng)是惰性的；（4）載體應(yīng)具有良好的生物相容性，適中的粒度及孔徑結(jié)構(gòu)；（5）載體應(yīng)是廉價(jià)易得的。 實(shí)際上，很少有一種載體

5、材料能滿足上述所有條件。一般是根據(jù)固定化對象和固定化方法去選擇較為合適的載體材料。 目前，所采用的載體主要有以下幾種：瓊脂、明膠、海藻酸鈣（簡稱SA）、聚乙烯醇（簡稱PVA）和丙烯酰胺（簡稱ACRM），其性能比較如表11。1 王新王新,李培軍李培軍,鞏宗強(qiáng)鞏宗強(qiáng),張海榮張海榮.固定化細(xì)胞技術(shù)的研究與進(jìn)展固定化細(xì)胞技術(shù)的研究與進(jìn)展J.農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù),2001,20(2):120-122.三、固定化細(xì)胞的制備方法 固定化細(xì)胞的制備方法是多種多樣的，原則上講，任何一種能夠限制細(xì)胞自由流動的技術(shù)都可以用于制備固定化細(xì)胞。 理想的固定化細(xì)胞的制備方法，應(yīng)該具有如下特點(diǎn)：（1）能夠控制固定化細(xì)胞

6、顆粒的大小和孔隙度；（2）固定化所使用的材料價(jià)廉易得，固定化成本盡量低；（3）固定化方法簡便、易行，固定化條件盡可能溫和，少損傷細(xì)胞；（4）固定化系統(tǒng)具有穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在所使用的pH和溫度下，不容易被破壞；（5）在反應(yīng)器內(nèi)長時(shí)間運(yùn)轉(zhuǎn)過程中，固定化系統(tǒng)具有良好的機(jī)械穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性；（6）用于制備固定化細(xì)胞的載體對細(xì)胞來說是惰性的，不損傷細(xì)胞；（7）固定化系統(tǒng)使底物、產(chǎn)物和其他代謝產(chǎn)物能夠自由擴(kuò)散，因?yàn)楫a(chǎn)物和其他代謝產(chǎn)物常常能抑制細(xì)胞的酶反應(yīng)，更需要能夠盡快擴(kuò)散，以消除抑制作用；（8）單位體積的固定化系統(tǒng)擁有盡可能多的細(xì)胞，以更好地起到生物催化作用。 國內(nèi)外沒有關(guān)于固定化細(xì)胞方法的統(tǒng)一分類標(biāo)

7、準(zhǔn)，但總體上可分為吸附法、包埋法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法四大類。1、吸附法 吸附法是利用微生物和載體之間形成靜電、粘附力和表面張力等作用將微生物細(xì)胞吸附，使細(xì)胞固定在載體表面和內(nèi)部形成生物膜的方法。吸附法又分為物理吸附法和離子吸附法2種。吸附法操作簡單、載體可以反復(fù)利用、對細(xì)胞活性影響小，但固定的微生物細(xì)胞數(shù)量有限且易脫落。 2、包埋法 包埋法的原理是將微生物細(xì)胞截留在水不溶性的凝膠聚合物孔隙的網(wǎng)絡(luò)空間中或埋于半透膜聚合物的超濾膜內(nèi)，通過聚合作用、離子網(wǎng)絡(luò)形成、沉淀作用，以及通過改變?nèi)軇?、溫度、pH 值來阻止細(xì)胞的泄漏，同時(shí)能讓底物滲入和產(chǎn)物擴(kuò)散出來。 目前應(yīng)用最為廣泛的是凝膠包埋法固定大腸桿菌細(xì)

8、胞。與液體發(fā)酵相比，包埋的大腸桿菌生產(chǎn)周期短、產(chǎn)物分離方便、能耗低、設(shè)備投資少且大大改善操作條件。包埋法仍存在一些不足，如包埋材料對細(xì)胞的毒性作用、材料本身阻礙大分子底物和氧的擴(kuò)散、使用過程中的雜菌污染等，這些還需要進(jìn)行更深入的研究。3、共價(jià)結(jié)合法 共價(jià)結(jié)合法是利用微生物細(xì)胞表面的官能團(tuán) ( 如氨基、羧基、巰基、羥基和咪唑基等) 和載體材料上的反應(yīng)基團(tuán)形成化學(xué)共價(jià)鍵相連，從而起到固定化細(xì)胞的作用。此法制備的固定化細(xì)胞結(jié)合牢固，但是反應(yīng)條件苛刻、不易控制。4、交聯(lián)法 交聯(lián)法是利用微生物細(xì)胞與帶2個(gè)以上多功能團(tuán)的非水溶性試劑發(fā)生反應(yīng)形成共價(jià)鍵，使其彼此交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化細(xì)胞。此法得到的固定化細(xì)

9、胞較穩(wěn)定，但可能使細(xì)胞活性大大降低，因而其應(yīng)用受到了一定的限制。各種細(xì)胞固定化方法的特征比較：四、固定化細(xì)胞的反應(yīng)特性 微生物經(jīng)固定化后，許多反應(yīng)特性都發(fā)生了變化，其中主要包括微生物活性的變化，微生物穩(wěn)定性的變化，氧和底物傳質(zhì)速率的變化。 微生物從本質(zhì)上講也是一種含有多種官能團(tuán)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，經(jīng)固定化后，其官能團(tuán)與載體之間發(fā)生了共價(jià)鍵或范德華力等形式的作用，使主鏈結(jié)構(gòu)得到加固，因此從總體上講，經(jīng)固定化后的微生物不易流失。而對微生物自身而言，加固后的主鏈結(jié)構(gòu)性質(zhì)較穩(wěn)定，不易被破壞，能耐pH值變化，有機(jī)物濃度變化、生物毒性物質(zhì)等的沖擊，不易失活，從而也就增加了固定化微生物的穩(wěn)定性。另一方面，微生物固定化后，因其官能團(tuán)穩(wěn)定性的增加，也使其生物活性有所減弱，不過由于采用固定化技術(shù)后使得微生物在一定空間區(qū)域內(nèi)具有很高的密度，因此單個(gè)微生物活性降低的缺點(diǎn)還是可以彌補(bǔ)的。 微生物固定化后，氧和底物的傳質(zhì)速率也發(fā)生了變化，尤其是采用多孔載體時(shí)，由于載體的作用，使得反應(yīng)系統(tǒng)中主體的底物濃度及氧濃度與微生物所處區(qū)域的底物及氧濃度發(fā)生差異，從而引起固定化后傳質(zhì)效果的變化。通常，固定化后氧傳質(zhì)收到的阻礙更為明顯，因此在好氧條件下，由于氧傳質(zhì)的限制，