第15章 免疫細胞標(biāo)志與功能檢測技術(shù)

1、第十五章第十五章 免疫細胞標(biāo)志和免疫細胞標(biāo)志和功能檢測技術(shù)功能檢測技術(shù)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院免疫教研室醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院免疫教研室齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫掌握：掌握：免疫細胞的分離免疫細胞的分離; ; 淋巴細胞功能檢測淋巴細胞功能檢測熟悉：熟悉：免疫細胞表面標(biāo)志和功能檢測的臨床免疫細胞表面標(biāo)志和功能檢測的臨床 應(yīng)用應(yīng)用; ;淋巴細胞表面標(biāo)志及亞群分類；淋巴細胞表面標(biāo)志及亞群分類；了解：了解：其他免疫細胞功能檢測技術(shù)；檢測的其他免疫細胞功能檢測技術(shù)；檢測的 臨床應(yīng)用。臨床應(yīng)用。齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫一、免疫細胞的分離一、免疫細胞的分離二、淋巴細胞標(biāo)志及亞群分類二、淋巴細胞標(biāo)志及亞群分類三、抗原提呈細胞的表面標(biāo)志三、抗原提

2、呈細胞的表面標(biāo)志四、淋巴細胞的功能檢測四、淋巴細胞的功能檢測五、其他免疫細胞功能檢測技術(shù)五、其他免疫細胞功能檢測技術(shù)六、免疫細胞表面標(biāo)志和功能檢測的臨床六、免疫細胞表面標(biāo)志和功能檢測的臨床應(yīng)用應(yīng)用齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫一、外周血單個核細胞分離一、外周血單個核細胞分離 二、淋巴細胞的分離二、淋巴細胞的分離 三、三、T T、B B細胞和細胞和T T細胞亞群的分細胞亞群的分離離四、不同分離方法的評價四、不同分離方法的評價 第一節(jié)第一節(jié) 免疫細胞的分離免疫細胞的分離掌握掌握齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫外周血單個核細胞外周血單個核細胞( (perpheral blood mononuclear ce

3、lls, PBMC) )：包括淋巴：包括淋巴細胞和單核細胞。細胞和單核細胞。一、外周血單個核細胞分離一、外周血單個核細胞分離掌握掌握齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫1.1.不同細胞不同細胞密度密度不同不同2.2.不同細胞表面生物學(xué)不同細胞表面生物學(xué)特性特性不同不同3.3.不同細胞表面不同細胞表面分化抗原分化抗原不同不同細胞分離基本原理細胞分離基本原理了解了解齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫紅細胞和粒細胞密度為紅細胞和粒細胞密度為1.092-1.092-1.093單個核細胞密度為單個核細胞密度為1.075-1.0901.075-1.090 選擇比重為選擇比重為1.075-1.090 1.075-1.090 介質(zhì)介質(zhì)分離分離

4、PBMCPBMC不同細胞密度不同不同細胞密度不同熟悉熟悉齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫對分離介質(zhì)的要求對分離介質(zhì)的要求1.1.對細胞無毒對細胞無毒2.2.基本等滲基本等滲3.3.不溶于血漿等分離物質(zhì)不溶于血漿等分離物質(zhì)4.4.有要求的比重有要求的比重2 2份份6%6%聚蔗糖聚蔗糖蒸餾水溶液蒸餾水溶液+1+1份份34%34%泛影葡胺泛影葡胺比重為比重為1.0771.0770.0020.002熟悉熟悉齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫聚蔗糖泛影葡胺聚蔗糖泛影葡胺-FicollFicoll分離液分離液原理：原理：單次單次差速密度梯度離心差速密度梯度離心的分離法的分離法組成：組成：2 2份份6%6%聚蔗糖蒸餾水溶液聚蔗糖蒸餾水溶

5、液+1+1份份34%34%泛影葡胺生理鹽水溶液。泛影葡胺生理鹽水溶液。比重：比重：1.0771.0770.0010.001( (最佳最佳) ) 掌握掌握齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫 1.0771.0770.0010.001的分層液可將細胞分離的分層液可將細胞分離紅細胞：紅細胞：1.0931.093粒細胞：粒細胞：1.0921.092單個核細胞單個核細胞1.0761.0761.0901.090 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫 密度梯度離心密度梯度離心(Ficoll)(Ficoll)離心離心細胞純度細胞純度95%95%；細胞收率；細胞收率80%80%；淋巴細胞；淋巴細胞90%-95% 90%-95%

6、齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫1.1.貼壁粘附法貼壁粘附法 2.2.吸附柱過濾法吸附柱過濾法: : 將將PBMCPBMC加入葡聚糖加入葡聚糖凝膠凝膠SephadexG-10SephadexG-10中，從柱上洗脫下中，從柱上洗脫下來的主要是來的主要是淋巴細胞。淋巴細胞。3.Percoll3.Percoll分離液法：分離液法：經(jīng)聚乙烯吡咯烷經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮（酮（PVP)PVP)處理的硅膠顆粒。處理的硅膠顆粒。目的目的-去除單核細胞去除單核細胞二二 、淋巴細胞分離、淋巴細胞分離掌握掌握齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫 死細胞、血小板死細胞、血小板 單核細胞單核細胞 淋巴細胞淋巴細胞 粒細胞粒細胞 紅細胞紅細胞 Percoll

7、Percoll：經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮（經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮（PVP)PVP)處理的硅膠顆粒處理的硅膠顆粒。齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫( (一一) )磁性微球分離法磁性微球分離法 ( (二二) )熒光激活細胞分離儀分離法熒光激活細胞分離儀分離法 三、三、T T、B B細胞和細胞和T T細胞亞群細胞亞群的分離的分離熟悉熟悉磁珠磁珠高分子高分子材料材料齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫磁珠大小可以選擇磁珠大小可以選擇齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫磁性微球分離法細胞分選過程磁性微球分離法細胞分選過程齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫大小免疫磁珠分離細胞的特點比較大小免疫磁珠分離細胞的特點比較 比較項目比較項目大磁珠大磁珠小磁

8、珠小磁珠對細胞的影響對細胞造成機械壓力，影響其生物學(xué)活性，不利于分離后培養(yǎng)。對細胞溫和，不影響分離細胞的后續(xù)培養(yǎng)。對流式細胞儀的影響對流式細胞儀的影響阻塞流式細胞儀的噴嘴，影響散射光?？芍苯由狭魇郊毎麅x檢測，不影響散射光。分離條件要求技術(shù)簡單，分離可在試管中完成。需要很強的磁場來分離細胞。 收率得率高。得率高。得率不高。得率不高。純度純度低。純度低。純度高。純度高。分離時間分離時間分離速度快。分離速度快。分離速度慢。分離速度慢。分離成本分離成本成本低成本低。需要很強的磁場來分離，需要很強的磁場來分離，需要一次性分離柱，不需要一次性分離柱，不能在普通試管能在普通試管齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫免疫磁珠細胞

9、分選裝置免疫磁珠細胞分選裝置齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫全自動細胞分選系統(tǒng)全自動細胞分選系統(tǒng) 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫 熒光激活細胞分離儀分離法熒光激活細胞分離儀分離法 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫流式細胞分析儀流式細胞分析儀齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫四、不同細胞分離方法的綜合評價四、不同細胞分離方法的綜合評價早期：早期：根據(jù)不同免疫細胞的物理屬性和根據(jù)不同免疫細胞的物理屬性和生物學(xué)屬性進行分離生物學(xué)屬性進行分離近期：近期：利用細胞表面標(biāo)志進行分離利用細胞表面標(biāo)志進行分離了解了解齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫1.1.分離外周血單個核細胞，單次差速密度梯度離分離外周血單個核細胞，單次差速密度梯度離 心法常心法常用分層液是（用分層液是（ ）A

10、 A 明膠明膠 B B 右旋糖酐右旋糖酐 C FicollC Ficoll分層液分層液 D PercollD Percoll分層液分層液 E E 葡聚糖葡聚糖2.Ficoll2.Ficoll液單次密度梯度離心后外周血細胞分布由上至下液單次密度梯度離心后外周血細胞分布由上至下依次為（依次為（ ）A A 單個核細胞、血小板和血漿、粒細胞、紅細胞單個核細胞、血小板和血漿、粒細胞、紅細胞B B 血小板和血漿、粒細胞、單個核細胞、紅細胞血小板和血漿、粒細胞、單個核細胞、紅細胞C C 血小板和血漿、單個核細胞、粒細胞、紅細胞血小板和血漿、單個核細胞、粒細胞、紅細胞D D 血小板和血漿、單個核細胞、紅細胞、

11、粒細胞血小板和血漿、單個核細胞、紅細胞、粒細胞E E 血小板和血漿、紅細胞、單個核細胞、粒細胞血小板和血漿、紅細胞、單個核細胞、粒細胞用玻璃纖用玻璃纖3.維或葡聚糖凝膠維或葡聚糖凝膠Sephadex-G10柱分離細胞時，從柱上柱分離細胞時，從柱上洗脫下的細胞主要是洗脫下的細胞主要是( )A粒細胞粒細胞 B淋巴細胞淋巴細胞 C單核細胞單核細胞 DT細細胞胞 EB細胞細胞 CCB齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫4.4.采用采用FicollFicoll密度梯度分離法分離得到的細胞主密度梯度分離法分離得到的細胞主要為（要為（ ）A A 單核細胞和粒細胞單核細胞和粒細胞 B B 單核細胞單核細胞C C 淋巴細胞淋巴細

12、胞 D D 淋巴細胞和單核細胞淋巴細胞和單核細胞E E 淋巴細胞和粒細胞淋巴細胞和粒細胞 5.Percoll分離液的主要成分是分離液的主要成分是( )A聚蔗糖聚蔗糖 B泛影葡胺泛影葡胺 C聚乙二醇聚乙二醇D聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮 E經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮處經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮處理的硅膠顆粒理的硅膠顆粒6.分離人外周血淋巴細胞分層液的最佳密度為分離人外周血淋巴細胞分層液的最佳密度為( )A.1.030 B.1.035 C.1.092 D.1.020 E.1.077 7.Ficoll淋巴細胞分離液的主要成分是淋巴細胞分離液的主要成分是( ) A聚蔗糖聚蔗糖 B泛影葡胺泛影葡胺 C聚乙二醇聚乙二醇D聚蔗

13、糖聚蔗糖+泛影葡胺泛影葡胺 E聚蔗糖聚蔗糖+聚乙二醇聚乙二醇DEED齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫第二節(jié)第二節(jié) 淋巴細胞標(biāo)志及淋巴細胞標(biāo)志及亞群分類亞群分類齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫細胞表面分化抗原細胞表面分化抗原(Cluster of differentiation CD)CD1a-CD350CD1a-CD350齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫( (一一)CD3)CD3+ +CD4CD4+ +CD8CD8- -輔助性輔助性T T細胞細胞 (Th)(Th) CD3 CD3+ +CD4CD4+ +CD30CD30- - Th1 Th1 CD3 CD3+ +CD4CD4+ +CD30CD30+ + Th2Th2( (二二)CD3+

14、CD4-CD8+)CD3+CD4-CD8+細胞毒性細胞毒性T T細胞細胞(CTL)(CTL)( (三三) )調(diào)節(jié)性調(diào)節(jié)性T T細胞細胞 CD4CD4+ +CD25CD25+ +Foxp3Foxp3+ + Tr1IL-10 Tr1IL-10 Th3TFG- Th3TFG-一、一、T T細胞表面標(biāo)志及亞群細胞表面標(biāo)志及亞群熟悉熟悉CD4CD4+ + Th Th細胞亞群分化的調(diào)節(jié)作用細胞亞群分化的調(diào)節(jié)作用齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫CDCD抗原抗原 CD2CD2CD3CD3CD4 CD4 CD8 CD8 CD25CD25CD28CD28CD40LCD40L特異性特異性 全部全部T T細胞和部分細胞和部分NKN

15、K細胞細胞( (E E受體受體) ) 成熟成熟T T細胞細胞 ( (特征性標(biāo)志特征性標(biāo)志) )輔助性輔助性T T細胞細胞 ( (HIVHIV受體受體) )細胞毒性細胞毒性T T細胞細胞活化活化T T細胞細胞( (IL-2RIL-2R) )T T細胞細胞活化活化T T細胞細胞 T T細胞表面主要細胞表面主要CDCD抗原及其特性抗原及其特性齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫mIg(鑒定鑒定B細胞的指標(biāo)細胞的指標(biāo))FcFc受體受體補體受體補體受體EBEB病毒受體病毒受體CDCD分子分子: :CD19CD19小鼠紅細胞受體小鼠紅細胞受體二、二、B B細胞表面標(biāo)志細胞表面標(biāo)志熟悉熟悉分類分類: :B1(CD19+CD5

16、+)B2(CD19+CD5-) 性性 質(zhì)質(zhì)B - 1B - 2產(chǎn)產(chǎn) 生生 時時 間間更更 新新 方方 式式自自 發(fā)發(fā) 性性Ig產(chǎn)產(chǎn) 生生特特 異異 性性分分 泌泌 的的Ig類類 別別體體 細細 胞胞 突突 變變 頻頻 率率對對T I抗抗 原原 的的 應(yīng)應(yīng) 答答對對T D抗抗 原原 的的 應(yīng)應(yīng) 答答胎胎 兒兒 期期自自 我我 更更 新新高高低低Ig M為為 主主低低/無無是是可可 能能出出 生生 后后骨骨 髓髓 產(chǎn)產(chǎn) 生生低低高高Ig G為為 主主高高可可 能能是是 性性 質(zhì)質(zhì)B - 1B - 2產(chǎn)產(chǎn) 生生 時時 間間更更 新新 方方 式式自自 發(fā)發(fā) 性性Ig產(chǎn)產(chǎn) 生生特特 異異 性性分分 泌泌

17、 的的Ig類類 別別體體 細細 胞胞 突突 變變 頻頻 率率對對T I抗抗 原原 的的 應(yīng)應(yīng) 答答對對T D抗抗 原原 的的 應(yīng)應(yīng) 答答胎胎 兒兒 期期自自 我我 更更 新新高高低低I g M為為 主主低低/無無是是可可 能能出出 生生 后后骨骨 髓髓 產(chǎn)產(chǎn) 生生低低高高I g G為為 主主高高可可 能能是是 性性 質(zhì)質(zhì)B -1B -2產(chǎn)產(chǎn) 生生 時時 間間更更 新新 方方 式式自自 發(fā)發(fā) 性性Ig產(chǎn)產(chǎn) 生生特特 異異 性性分分 泌泌 的的Ig類類 別別體體 細細 胞胞 突突 變變 頻頻 率率對對T I抗抗 原原 的的 應(yīng)應(yīng) 答答對對T D抗抗 原原 的的 應(yīng)應(yīng) 答答胎胎 兒兒 期期自自 我我

18、 更更 新新高高低低Ig M為為 主主低低/無無是是可可 能能出出 生生 后后骨骨 髓髓 產(chǎn)產(chǎn) 生生低低高高Ig G為為 主主高高可可 能能是是B-1細胞和B-2細胞的異同齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫CDCD抗原抗原 CD21CD21CD35CD35CD40CD40CD80/86CD80/86CD19/CD5CD19/CD5 特異性特異性 EBEB病毒受體病毒受體 活化活化B B細胞細胞 與與CD40LCD40L結(jié)合活化結(jié)合活化B B細胞細胞 與與T T細胞細胞CD28CD28結(jié)合，活化結(jié)合，活化T T細胞細胞 B1B1雙陽；雙陽；B2B2僅為僅為CD19+CD19+ B B細胞表面主要細胞表面主要CD

19、CD抗原及其特性抗原及其特性齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫CD3CD3- -CD56CD56+ +CD16CD16+ +三、三、NKNK細胞表面標(biāo)志細胞表面標(biāo)志（nature killer cell,NK)熟悉熟悉復(fù)復(fù) 習(xí)習(xí)1.對細胞液分離的要求？2.從PBMC中得到淋巴細胞的方法？3.成熟T細胞表面主要標(biāo)志？4.B細胞根據(jù)什么主要標(biāo)志分為何種亞群？齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫抗原提呈類細胞表面標(biāo)志抗原提呈類細胞表面標(biāo)志第三節(jié)第三節(jié) 抗原提呈細胞的表面標(biāo)志抗原提呈細胞的表面標(biāo)志CD1a,CD11c,CD83CD1a,CD11c,CD83齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫一、單核一、單核- -吞噬細胞系統(tǒng)吞噬細胞系統(tǒng)組織部位組織部位

20、 細胞名稱細胞名稱 骨髓骨髓 干細胞干細胞單核母細胞單核母細胞前單核細胞前單核細胞 骨髓和血液骨髓和血液 單核細胞單核細胞 各種組織各種組織 組織細胞（結(jié)締組織）組織細胞（結(jié)締組織）, ,枯否細胞（肝）枯否細胞（肝） （巨噬細胞）（巨噬細胞） 破骨細胞（骨）、小膠質(zhì)細胞（神經(jīng)破骨細胞（骨）、小膠質(zhì)細胞（神經(jīng) 組織）、組織）、表面標(biāo)志表面標(biāo)志: :CD14CD14熟悉熟悉齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫二、樹突狀細胞二、樹突狀細胞（dendritic cell)抗原提呈能力最強DC的共同特征包括：形態(tài)上呈樹突狀，胞質(zhì)內(nèi)存在特異性形態(tài)上呈樹突狀，胞質(zhì)內(nèi)存在特異性BirbeckBirbeck顆粒顆粒狀結(jié)構(gòu)狀結(jié)構(gòu)表

21、達表達CD1aCD1a、高水平、高水平MHC-MHC-類抗原和多種輔助分子類抗原和多種輔助分子吞噬功能較低吞噬功能較低可有效誘導(dǎo)巢居的靜息性幼稚可有效誘導(dǎo)巢居的靜息性幼稚T T細胞發(fā)生增殖細胞發(fā)生增殖熟悉熟悉齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫1.1.用抗人用抗人CD3CD3單克隆抗體檢測單克隆抗體檢測T T淋巴細胞，其結(jié)果淋巴細胞，其結(jié)果代表（代表（ ）A TA T淋巴細胞總數(shù)淋巴細胞總數(shù) B ThB Th細胞數(shù)細胞數(shù) C TsC Ts細胞數(shù)細胞數(shù)D CD4TD CD4T細胞數(shù)細胞數(shù) E CD8TE CD8T細胞數(shù)細胞數(shù)2.2.下列指標(biāo)可以評價下列指標(biāo)可以評價AIDSAIDS病人的細胞免疫功能的病人的細胞免疫

22、功能的是（是（ ）A CD2/CD3A CD2/CD3細胞比值細胞比值 B CD3/CD4B CD3/CD4細胞比值細胞比值C CD3/CD8C CD3/CD8細胞比值細胞比值 D CD4/CD8D CD4/CD8細胞比值細胞比值E CD2/CD4E CD2/CD4細胞比值細胞比值3.能與能與SRBC結(jié)合形成結(jié)合形成E花環(huán)的細胞主要是花環(huán)的細胞主要是( )AT細胞細胞 BB細胞細胞 C單核細胞單核細胞 D粒細胞粒細胞 E血小板血小板 ADA齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫4. B4. B細胞重要表面標(biāo)志不包括（細胞重要表面標(biāo)志不包括（ ）A A 膜免疫球蛋白（膜免疫球蛋白（SmIgSmIg） B EBB E

23、B病毒受體病毒受體 C EC E受體受體 D D 補體受體補體受體D D 小鼠紅細胞受體小鼠紅細胞受體5.5. NK細胞特有的表面抗原是細胞特有的表面抗原是( )A.CD2 B.CD16 C.無特異的表面抗原無特異的表面抗原 D.CD23 E.CD56 6.單核巨噬細胞系統(tǒng)細胞的表面標(biāo)志單核巨噬細胞系統(tǒng)細胞的表面標(biāo)志( ) ACD2 BCD16 CCD14 DCD16 ECD197.外周成熟的休止外周成熟的休止B細胞分如下亞群細胞分如下亞群( )A.CD4+細胞細胞 B.CD4-細胞細胞 C.CD8+細胞細胞 D. CD8-細胞細胞 E.B1細胞和細胞和B2細胞細胞CCCE齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫第

24、四節(jié)第四節(jié) 淋巴細胞功能檢測淋巴細胞功能檢測T T細胞（負(fù)責(zé)細胞免疫功能）細胞（負(fù)責(zé)細胞免疫功能）B B細胞（執(zhí)行體液免疫功能）細胞（執(zhí)行體液免疫功能）NKNK細胞（非特異性免疫作用）細胞（非特異性免疫作用） 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫一、一、T T細胞功能檢測細胞功能檢測( (一一)T)T細胞增殖試驗細胞增殖試驗( (二二) )抗原特異性抗原特異性T T細胞增值試驗細胞增值試驗( (三三)MHC-)MHC-肽四聚體技術(shù)肽四聚體技術(shù)( (四四)T)T細胞分泌功能測定細胞分泌功能測定( (五五)T)T細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗( (六六) )體內(nèi)試驗體內(nèi)試驗齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫1. 1. 原

25、理原理淋巴細淋巴細胞胞DNADNA合成合成分化分化母細胞母細胞刺激物刺激物細胞變大細胞變大細胞漿擴大細胞漿擴大空泡空泡核仁明顯核仁明顯核染色質(zhì)疏松核染色質(zhì)疏松（一）（一）T T淋巴細胞增殖試驗淋巴細胞增殖試驗 -T-T細胞轉(zhuǎn)化實驗細胞轉(zhuǎn)化實驗掌握掌握齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫T T細胞細胞外來物質(zhì)外來物質(zhì)細胞內(nèi)大分子物質(zhì)細胞內(nèi)大分子物質(zhì)的合成增加的合成增加T T細胞形態(tài)變化細胞形態(tài)變化絲裂原：非抗原性刺激物絲裂原：非抗原性刺激物 PHAPHA、ConAConA、PWMPWM抗原性刺激物：抗原性刺激物：PPD(purified protein derivative)同位素法同位素法形態(tài)法形態(tài)法齊齊哈爾醫(yī)

26、學(xué)院免疫標(biāo)本：標(biāo)本：外周血單個核細胞外周血單個核細胞37 72h37 72h+ +取培養(yǎng)細胞涂片染色鏡檢取培養(yǎng)細胞涂片染色鏡檢觀察細胞形態(tài)學(xué)改變觀察細胞形態(tài)學(xué)改變PHAPHA無無PHAPHA刺激物：刺激物：常用常用PHAPHA（1 1）形態(tài)學(xué)檢查法）形態(tài)學(xué)檢查法齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫淋巴細胞標(biāo)志及功能檢測 龔道科 2002.4齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫%100胞數(shù)轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的淋巴細轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)轉(zhuǎn)化率正常轉(zhuǎn)化率正常轉(zhuǎn)化率:60%-80%;:60%-80%; 小于小于50%50%為降低為降低齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫優(yōu)點：優(yōu)點：形態(tài)學(xué)方法形態(tài)學(xué)方法簡便易行簡便易行，適，適 于

27、基層實驗室應(yīng)用。于基層實驗室應(yīng)用。缺點：缺點：判斷結(jié)果易受主觀因素影判斷結(jié)果易受主觀因素影 響，響，重復(fù)性和準(zhǔn)確性差重復(fù)性和準(zhǔn)確性差。 方法學(xué)評價：齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫外周血單個核細胞外周血單個核細胞37 56h37 56h +收集培養(yǎng)細胞收集培養(yǎng)細胞液體閃爍器計數(shù)液體閃爍器計數(shù)cpmcpm加入加入3 3H-TdRH-TdRPHA無無PHA37 16h（2 2）3 3H-TdRH-TdR摻入法摻入法齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫優(yōu)點優(yōu)點：3H-TdR3H-TdR摻入法摻入法敏感性高敏感性高，客觀，客觀 強，重復(fù)性好。強，重復(fù)性好。缺點：缺點：但需一定設(shè)備條件，同時還存但需一定設(shè)備條件，同時還存 在放射性在放

28、射性核素污染核素污染問題。問題。SI=刺激指數(shù)刺激指數(shù)PHA刺激管刺激管cpm均值均值 對照管對照管cpm均值均值齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫(3)MTT (3)MTT 比色法比色法 MTTMTT（噻唑鹽）在活細胞內(nèi)被線粒體琥珀（噻唑鹽）在活細胞內(nèi)被線粒體琥珀酸脫氫酶還原成酸脫氫酶還原成藍黑色藍黑色( (甲臢）甲臢）物質(zhì)，與物質(zhì)，與細胞增殖細胞增殖呈正相關(guān)呈正相關(guān)。均值A(chǔ)對照孔均值A(chǔ)試驗孔570nm570mSI 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫方法學(xué)評價：方法學(xué)評價：優(yōu)點：優(yōu)點：操作簡便，無放射性污染操作簡便，無放射性污染缺點：缺點：敏感性敏感性不及不及放射性核素法放射性核素法 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫 感染性疾病，感染性

29、疾病，T T細胞會形成對病原微生物細胞會形成對病原微生物的免疫記憶，在體外分離到的免疫記憶，在體外分離到T T細胞后，培養(yǎng)增細胞后，培養(yǎng)增殖殖T T細胞的同時加入相應(yīng)病原的特異抗原進行細胞的同時加入相應(yīng)病原的特異抗原進行刺激，激活該細胞的記憶，有記憶的細胞會刺激，激活該細胞的記憶，有記憶的細胞會分泌分泌- -干擾素，通過檢測干擾素，通過檢測- -干擾素的量可以干擾素的量可以反映反映T T細胞情況。細胞情況。（二）抗原特異性（二）抗原特異性T T細胞增值試驗細胞增值試驗了解了解齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫 通過通過TCRTCR與與MHC-MHC-肽的特異性相互肽的特異性相互作用，來檢測抗原特異的作用，來檢

30、測抗原特異的T T細胞，了細胞，了解機體的免疫狀況。解機體的免疫狀況。（三）（三）MHC-MHC-肽四聚體技術(shù)肽四聚體技術(shù)了解了解齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫 免疫學(xué)、細胞生物學(xué)及分子生物免疫學(xué)、細胞生物學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)分別檢測細胞因子含量、生學(xué)技術(shù)分別檢測細胞因子含量、生物學(xué)活性或基因表達水平。物學(xué)活性或基因表達水平。（四）（四）T T細胞分泌功能測定細胞分泌功能測定了解了解齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫1.1.原理原理靶細胞抗原靶細胞抗原T T細胞細胞 觀察殺傷活力觀察殺傷活力致敏致敏CTLCTL靶細胞靶細胞（五）（五）T T細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗熟悉熟悉齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫形態(tài)學(xué)方法：形態(tài)學(xué)

31、方法：淋巴細胞淋巴細胞+ +腫瘤細胞腫瘤細胞 計數(shù)殘留腫計數(shù)殘留腫瘤細胞瘤細胞同位素法：同位素法：淋巴細胞（淋巴細胞（CTLCTL）+ +含含5151Cr Cr 的腫瘤細的腫瘤細胞胞 腫瘤細胞破壞腫瘤細胞破壞 5151Cr Cr 釋放釋放 計數(shù)計數(shù)儀測定儀測定5151CrCr放射活性放射活性意義：意義： 判斷腫瘤患者判斷腫瘤患者CTLCTL殺傷腫瘤細胞的能力殺傷腫瘤細胞的能力 2.2.方法方法齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫( (一一) )特異性抗原皮膚試驗特異性抗原皮膚試驗(OT)(OT)( (二二)PHA)PHA皮膚試驗皮膚試驗 ( (六六) ) 體內(nèi)試驗體內(nèi)試驗了解了解齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫溶血空斑試驗溶

32、血空斑試驗酶聯(lián)免疫斑點試驗酶聯(lián)免疫斑點試驗二、二、B B細胞功能檢測細胞功能檢測了解了解齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫SRBC取出脾細胞，取出脾細胞， 加入加入SRBCSRBC及補體及補體4天天37 0.7%37 0.7%瓊脂溶液瓊脂溶液3737 溶血溶血溶血空斑試驗溶血空斑試驗1.1.原理原理齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫一個溶血空斑表示一個抗體形成細胞。一個溶血空斑表示一個抗體形成細胞。溶血空斑的大小表示抗體形成的量。溶血空斑的大小表示抗體形成的量。齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫測定測定藥物藥物或或手術(shù)手術(shù)對體液免疫功能的影響對體液免疫功能的影響評價評價免疫治療免疫治療或或免疫重建免疫重建后機體體液免后機體體液免疫狀態(tài)疫狀態(tài)

33、 臨床應(yīng)用與評價臨床應(yīng)用與評價齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫染色計數(shù)染色計數(shù)離心取上清離心取上清測測LDHLDH形態(tài)學(xué)法形態(tài)學(xué)法酶釋放法酶釋放法放射性核放射性核 素釋放法素釋放法溶溶解解靶靶胞胞細細常用靶細胞常用靶細胞: :人人K562K562細胞株細胞株 鼠鼠YAC-1YAC-1 三、三、NKNK細胞活性測定細胞活性測定熟悉熟悉 測放射活性測放射活性齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫方法及原理：方法及原理：靶細胞靶細胞效應(yīng)細胞效應(yīng)細胞 靶細胞死亡靶細胞死亡可被臺可被臺 盼蘭染色盼蘭染色形態(tài)法形態(tài)法釋放胞內(nèi)酶釋放胞內(nèi)酶酶釋法酶釋法乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶 堿性磷酸酶堿性磷酸酶簡便易于操作簡便易于操作 受主觀因素響大受主觀因素

34、響大 無法計數(shù)輕微損傷的細胞無法計數(shù)輕微損傷的細胞經(jīng)濟、快速、簡便經(jīng)濟、快速、簡便敏感度低敏感度低 本底較高本底較高 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫 一、中性粒細胞功能檢測技術(shù)一、中性粒細胞功能檢測技術(shù) 二、巨噬細胞功能檢測技術(shù)二、巨噬細胞功能檢測技術(shù)第五節(jié)第五節(jié) 其他免疫細胞功能檢測技術(shù)其他免疫細胞功能檢測技術(shù)了解了解齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫 趨化趨化 吞噬吞噬 胞內(nèi)殺滅作用胞內(nèi)殺滅作用 吞噬細胞的功能吞噬細胞的功能熟悉熟悉齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫 趨化功能檢測趨化功能檢測 吞噬和殺菌功能測定吞噬和殺菌功能測定一、中性粒細胞功能的檢測一、中性粒細胞功能的檢測了解了解齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫1.原理中性粒細胞趨化因子：中性

35、粒細胞趨化因子：微生物細胞成分及其代謝產(chǎn)物微生物細胞成分及其代謝產(chǎn)物補體活性片段補體活性片段C5aC5a、C3aC3a( (一一) ) 細胞運動功能細胞運動功能趨化功能檢測趨化功能檢測齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫瓊脂糖平板法瓊脂糖平板法 濾膜滲透法（濾膜滲透法（Boyden Boyden 小室法）小室法）2.2.方法學(xué)方法學(xué)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫 1 1顯微鏡檢查法顯微鏡檢查法100(%)計數(shù)的白細胞數(shù)吞噬細菌的白細胞數(shù)吞噬率100(%)計數(shù)的白細胞數(shù)數(shù)胞內(nèi)含著染菌體的細胞殺菌率( (二二) )吞噬和殺菌功能測定吞噬和殺菌功能測定齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫100min0min9060301(%)）菌落數(shù)菌落數(shù)或、作

36、用（殺菌率3 3NBTNBT還原試驗還原試驗6-6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖 戊糖戊糖 NADNAD- -+H+H+ + NADH NADHNBTNBT（硝基藍四氮唑）（硝基藍四氮唑） 甲臜顆粒甲臜顆粒2. 2. 溶菌法溶菌法6-6-磷酸葡萄糖脫氫酶磷酸葡萄糖脫氫酶齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫( (一一) )炭粒廓清試驗炭粒廓清試驗( (二二) )吞噬功能檢測吞噬功能檢測( (三三) )巨噬細胞溶酶體酶的測定巨噬細胞溶酶體酶的測定( (四四) )細胞毒作用測定細胞毒作用測定( (五五) )巨噬細胞促凝血活性測定巨噬細胞促凝血活性測定二、巨噬細胞功能檢測二、巨噬細胞功能檢測了解了解齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫反映機體反

37、映機體免疫功能免疫功能狀態(tài)。狀態(tài)。腫瘤、免疫缺陷病等疾病的腫瘤、免疫缺陷病等疾病的診斷和疾診斷和疾 病預(yù)后監(jiān)測病預(yù)后監(jiān)測。組織組織器官移植器官移植后對受者細胞免疫學(xué)功后對受者細胞免疫學(xué)功 能監(jiān)測則有利于排斥反應(yīng)早期發(fā)現(xiàn)。能監(jiān)測則有利于排斥反應(yīng)早期發(fā)現(xiàn)。第六節(jié)第六節(jié) 免疫細胞表面標(biāo)志和功能檢測免疫細胞表面標(biāo)志和功能檢測的臨床應(yīng)用的臨床應(yīng)用齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫1.1.T T細胞增殖試驗的原理、刺激物及方細胞增殖試驗的原理、刺激物及方法？法？2.2.將細胞分離的方法有哪些？將細胞分離的方法有哪些？思考題思考題齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫1.1.評價人評價人T T細胞功能的試驗細胞功能的試驗（ ）A.A.血清血清

38、IgIg的測定的測定 B.B.溶血空斑溶血空斑C.C.膜表面免疫球蛋白測定膜表面免疫球蛋白測定D.D.淋巴細胞轉(zhuǎn)化淋巴細胞轉(zhuǎn)化 E.EE.E花環(huán)試驗花環(huán)試驗2.2.吞噬細胞吞噬的三個階段是（吞噬細胞吞噬的三個階段是（ ）A.A.趨化趨化/ /吸附吸附/ /胞內(nèi)殺滅胞內(nèi)殺滅 B.B.趨化趨化/ /識別識別/ /吞噬吞噬 C.C.趨化趨化/ /識別識別/ /吸附吸附 D.D.趨化趨化/ /識別識別/ /胞內(nèi)殺滅胞內(nèi)殺滅 E.E.趨化趨化/ /吞噬吞噬/ /胞胞內(nèi)殺滅內(nèi)殺滅D DE E齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫3. 3. 將將PBMCPBMC懸液加入尼龍毛柱內(nèi)，充分反應(yīng)后進懸液加入尼龍毛柱內(nèi)，充分反應(yīng)后進行灌洗，先洗脫下來的細胞是（行灌洗，先洗脫下來的細胞是（ ）A.TA.T細胞細胞